Dokumen ini membahas tentang produksi akar rambut teh (Camellia sinensis) melalui transformasi Agrobacterium rhizogenes. Eksplan daun teh diinfeksi dengan strain A. rhizogenes pada konsentrasi acetosyringone 300 μM/L yang meningkatkan frekuensi transformasi hingga 70%. Medium MS dengan 30g/L maltosa dan 5mg/L IAA tepat untuk pertumbuhan akar rambut dan akumulasi senyawa fenolik. Analisis PCR dan HPLC menunjukkan ke

1. YONA OKTA SARI
1010413008
Universitas Andalas
Dosen Pembimbing : Prof.DR Sumaryati Syukur

2. Agrobacterium rhizogenes-mediated
hairy roots production tea leaves
[Camellia sinensis (L) O Kuntze]
Agrobacterium rhizogenes Investigating agrobacterium rhizogenes
transformation mediated transformation

3. [Camellia sinensis (L) O Kuntze]

4. ABSTRACT
Daun dari the [Camellia sinensis (L) O Kuntze] tanaman
yang telah diubah dengan Agrobacterium
Rhizogenes strain (MTCC) dan dengan menginduksikan hairy
roots. Diantaranya dengan perbedaan
konsentrasi dari acetosyringone tested 300µM/L yang telah
didapatkan untuk meningkatkan frekuensi
pembentukan hingga 70%. Murashige and Skoog (MS)
medium tambahan dengan 30g/L maltosa dan
indole-3-asam asetat (IAA) pada 5mg/L yang telah tepat
didapatkan untuk jaringan hairy roots dan
akumulasi dari senyawa fenolik. Untuk mempertegas studi
dilakukan analisis PCR menggunakan rol C
gen primer untuk pembentukan. Proses ampilifikasi
(menguatkan) fari gen yang spesifik dibentuk pada
540 bp. Dinyatakan dengan analisis HPLC bahwa katekin
mempunyai tingkat yang lebih tinggi dan
fraksi-fraksi yang muncul dari jaringan pembentukan. Fraksi-

5. Persiapan Eksplant
Tea shoot of the clone
from tea Experimental
farm of UPASI-9
-Remove from the shoot at their base
- make 2 cm long segments, and each
containing give one node.
- The nodal segments were washed
under running tap water for 30 min
-Disinfected with 70% (v/v) ethanol
for 1 min
-Surface sterilized with 0.1% (w/v)
HgCl2 for 3 min
-Rinses in sterile distiled water.
Surface sterilized explants
- Were cultured on Murashige and
skoog (MS) basal media suplements
with (3% sucrose, 3 mg/L 6-benzyl-
adenine (BA) and 0.8% agar)
Sprouting

6. -Culture dipindahkan ke medium
perbanyakan (multiplikasi) dengan
menggunakan hormon pertumbuhan BA
pada konsentrasi 5 mg/L dan 2
subculture dengan rentang selama 30
hari pada media yang sama.
- pH untuk semua media hingga 5.6
sebelum proses autoclave.
- Autoclaving selama 15 menit pada suhu
121oC
- cultures di inkubasi selama 25± 1oC
dibawah cahaya fluoroscent selama 16
jam photoperioda (36 µmol/m2.s)
selama 2 bulan.
Fully exposed leaves
- Daun yang telah selesai di kulturkan
dipisahkan dari pucuk baru yang telah
telah tumbuh secara in vitro yang
digunakan sebagai eksplant
pembentukan

7. Persiapan Kultur Bakteri
A. Rhigozenes strain MTCC 532, yang telah
disimpan didalam glycerol yang telah
disterilkan pada suhu -70oC
- Dikulturkan pada YEB, komposisi :
(1g/L ekstrak ragi, 5 g/L ekstrak daging.
5 g/L peptone dan 0,5 g/L MgSO4 )
merupakan media padat untuk
mengaktifkan strain.
-3x subkultur pada media yang sama.
- Bakteri tersebut dipindahkan kedalam
media YEB cair dan dikultur selama 16
jam pada suhu 25oC.
- Shaker 250 rpm.
Suspensi bakteri cair
dipindahkan kedalam
sentrifuge steril
- Sentrifuge selama 10 menit
5000 rpm

8. Suspensi endapan bakteri di
dalam media MS cair dengan
3% sukrosa
Suspensi ini yang digunakan untuk
pembentukan dari eksplan daun

9. Pembentukan Kultur Akar Rambut
3-4 potong pucuk daun
-Kokultivasi dengan 25 mL MS cair
didalam 100 mL labu.
- shaker 200 rpm dalam keadaan
gelap selama 3 jam.
- eksplan dipindahkan kedalam
botol yang berisi tisu steril
Eksplan Tumbuh
-Kokultivasi pada media MS padat
konsentrasi acetosyringone berbeda
(100,200,300,400,500 µM/L)
dengan 0.8% bacto agar.
- Kokultivasi selama 48 jam pada
suhu 25±1oC dalam keadaan gelap
- dicuci dengan 50 mL pada media
basal (30 g/L sukrosa dan 250 mg/L
cefotaxine)
- Kultivasi
- Medium padat dicuci dengan 0.8%
agar

10. Subkultur I Subkultur II
- Dipindahkan ke media - Dipindahkan ke media
MS yang mengandung MS yang mengandung
(sukrosa, dextrosa, hormon pertumbuhan
maltosa, fruktosa) yang (IAA-3 dan 2,4-
berbeda konsentrasi dichlorophenoxy acetic
acid)
Kalus yang
berkembang dari
eksplan daun hasil
transformasi

11. Konfirmasi PCR
DNA plasmid Kalus yang telah
DNA dari daun yang
A.rhizogenes diinfeksi selama 20
telah di infeksi
strain hari sebagai amplified
selama 15 hari
- Diekstraksi PCR
- Diekstraksi
menggunakan Genelute menggunakan metoda
HP plasmid miniprep kit Mariya John
+ 50 ng DNA plasmid
-DNA dari jaringan daun non-transformed (+
dan – controls)
+ 25 MI campuran pereaksi
-Denaturasi selama 4 menit pada suhu 94oC
-Diputar (cycles) 30 x selama 45 detik T=94oC
- Annealing (proses penempelan primer ke
DNA template) selama 60 detik suhu 55oC
- Extension/polimerisasi (proses
pemanjangan rantai DNA) pada suhu 72oC

12. Produk amplified/produk PCR
pada 1.2% agarose gel
+ noda ethidium bromida
-Dilihat dibawah sinar lampu
UV, catat.
-Hitung fragment amplified yang
terbentuk menggunakan software
(Total Lab Ver.1 Amersham
Bioscience, USA)
Jumlah fragment
amplified

13. Penentuan Jumlah Polyphenol dan
Katekin

14. Hasil dan Diskusi
• Perbedaan konsentrasi dari
acetosyringone yang tergabung
dalam medium nutrisi dan
berpengaruh terhadap
transformasi yang diamati.
• Diantara perbedaan
konsentrasi yang diuji cobakan
(100-500µM/L),
acetosyringone pada
konsentrasi 300µM/L yang
memiliki frekuensi
transformasi tertinggi secara
signifikan, yang mana pada
konsentrasi yang lebih rendah
(<300µM/L) atau lebih tinggi
(>300µM/L) mengalami
penurunan.

15. • Hubungan kuadrat antara
konsentrasi
acetosyringone dan
frekuensi transformasi
pada tingkat 0.5%.
• Acetosyringone
merupakan turunan dari
asam amino yang
berfungsi sebagai sumber
nutrisi untuk bakterium
invading dan
meninggikan tingkatan
transformasi.
• Agrobacterium yang
diinfeksi digunakan
sebagai sumber nutrient

16. • Analisis PCR dari jaringan
yang telah ditransformasi
menunujukan amplifikasi
pada 540 bp di dalam
daun, kalus, dan sampel
akar berambut (hairy root)
dan didalam plasmid
(kontrol positif)
mengindikasikan peristiwa
transformasi.
• Tetapi dalam kontrol
negatif (non transformed
tissue) tidak ada
amplifikasi (Fig 2)

17. • Konfirmasi dari semua
akar berambut mempunyai
perkembangan dari kalus
yang telah tertransformasi.
• Diantara berbeda sumber
dari karbon
organik, maltosa pada
tingkat 3% memiliki
presentasi jaringan akar
berambut yang paling
tinggi, yang kemudian
diikuti dextrosa, sukrosa
dan fruktosa. (Tabel 2)

18. • Kultur eksplan pada media pendukung
dengan fruktosa menunjukan presentasi
yang sangat rendah dari kultur akar
berambut.
• Yang tidak mengandung sumber
karbon, kalus yang tersisa menjadi
keras, kering dan berwarna coklat.
• Maltosa merupakan sumber karbon yang
paling baik untuk menginduksi akar
berambut juga merupakan pengamatan
yang lebih cepat.

19. • Mengatur pertumbuhan tanaman merupakan
salah satu bagian yang sangat penting dalam
induksi akar berambut dari jaringan eksplan teh.
• Secara umum, auksin mampu membentuk akar.
• Waktu yang dibutuhkan untuk menginduksi akar
selama transformasi kalus selama 15 hari (IAA)
dan 20 hari (2,4-D) dan 31 hari untuk kedua
media (IAA dan 2,4-D).
• Tanpa auksin waktu yang dibutuhkan untuk
menginduksi pada kalus transformasi selama 35
gari dan 60 hari untuk kalus yang tidak
mengalami transformasi (untransformed).

20. • Medium yang mengandung IAA
merupakan merupakan kecepatan
induksi dari akar berambut
kemudian diikuti oleh 2,4-D (Tabel 3)
• Kombinasi dari kedua hormon yang
ditunjukan tidak mengalami reduksi
yang signifikan terhadap waktu hairy
root induksi
• Induksi akar tertunda pada kalus
untransformed dimana untuk proses
terbentuknya terjadi setelah 2 bulan
sedangkan untuk membentuk akar
pada kalus transformed terjadi
selama 35 hari.

21. • Tingkat fenolik dalam akar
berambut ditentukan dan
dibandingkan dengan daun
non-transformed.
• Sintesis polyphenol dan
fraksi katekin yang
didapatkan (EC, ECG, EGC,
EGCG ) didalam medium
hairy root sangat lambat
dibandingkan dengan daun
unstransformed.
• Jumlah yang paling banyak
dari fraksi katekin= EGCG
dan fraksi yang paling
sedikit=Ec

22. • Biosintesa metabolit sekunder dalam akar
transformed secara genetik telah
terpantau, tetapi dipengaruhi oleh nutrisi dan
faktor lingkungan.
• Komposisi dari medium jaringan memberikan
pengaruh terhadap hasil metabolit sekunder.
• Sumber karbon yang digunakan sebagai
komponen basal dalam medium jaringan
pertumbuhan tanaman merupakan faktor
utama.