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POSITIVOS

CGP
Identificación de Cocos
Gram Positivos de
Importancia Clínica
COCOS GRAM
POSITIVOS
Catalasa Positiva

Staphylococcus Sp

Catalasa Negativa

Streptococcus
Enterococcus
STAPHYLOCOCCUS Sp
COAGULASA DNASA
+

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S. Aureus

S.C.N
Novobiocina
5 ug

Resistente
S. Saprophyticus

Sensible
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STREPTOCOCCUS
HEMOLISIS

Beta Hemólisis

Bacitracina

Sensible
S. pyogenes

Resistente
P. CAMP

Positiva
S. agalactiae

Al...
PRUEBAS DE
IDENTIFICACION
PRUEBA DE CATALASA
Enzima que descompone el peroxido de
hidrogeno en oxigeno y agua.
H2 O 2
H2O + O2 (Burbuja
de gas)
Cata...
PRODUCCION DE COAGULASA
Enzima que transforma el fibrinogeno en fibrina, provocando la
formación de un coagulo visible.
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PRODUCCION DE LA DNASA
(Desoxirribonucleasa)
Enzima que desdobla al ácido
desoxirribonucleico en sus
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PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA
NOVOBIOCINA
Es un ATB que inhibe el crecimiento de Staphylococcus
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OPTOQUINA
La Optoquina inhibe selectivamente al
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Pneumoniae.
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Es un ATB que inhibe el desarrollo
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PRUEBA DE CAMP
La actividad hemolítica de la beta lisina,
Estafilococica sobre los eritrocitos se ven
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DESARROLLO EN
NaCl al 6.5%
Los Enterococcus tienen la capacidad
de crecer a altas concentraciones de
NaCl.
Técnica:
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PRUEBA DE LA BILIS
ESCULINA
Se basa en la capacidad que tienen
algunas bacterias de hidrolizar la
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Prueba de la Hidrólisis del PYR
(Producción de Pirrolidonil-beta-Naftilamida

Consiste en la capacidad de ciertas bacteria...
QUE ENSAYAR Y QUE
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COCOS GRAM POSITIVOS
DE IMPORTANCIA
CLINICA
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Streptococcus pyogenes
(grupo A)
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Eritromicina

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Streptococcus pneumoniae
Antibiótico

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Meningitis

Neumonía

Otitis

PEN, CRO/CTX
(CIM)

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PROBLEMAS PLANTEADOS POR
LOS COCOS GRAM POSITIVOS
La resistencia bacteriana a los ATB esta relacionada:
A la calidad de la...
STAPHYLOCOCCUS
METILICINA RESISTENTE
Los SMR presentan en su membrana una PBP adicional
(PBP 2a) Gen mecA.
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Staphylococcus aureus
Meticilina Resistente (MRSA)
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Staphylococcus aureus
Meticilino Resistente
Adquirido en la Comunidad
CA-MRSA
Propiedades Distintivas CA-MRSA
Resistente solamente a Meticilina con Resistencia cruzada
solamente a otros ß-lactamicos
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Manifestaciones CA-MRSA
Neumonía Necrotizante
Osteomielitis
Abscesos
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Fascitis Necrotizante
Tromboflebitis Séptica
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CA-MRSA Opciones de
Tratamiento
Clindamicina - Oral es el agente que se ha redescubierto para
Infecciones por CA-MRSA
CA-M...
DETECCION DE OXACILINA
RESISTENTE EN
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Método: Oxacillin Screening Agar
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Punto de Corte establecido
por el CLSI para Oxicilina
DD (mm):
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Resistencia Inducible
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“Test D” – Reacción Negativa
NO hay Inducción
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Mediada por gen
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Vancomicina
Un Problema - Crítico

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VISA Fenotipo vs. VRSA Genotipo
Las cepas VISA representan un fenotipo que probablemente resulta de
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Criterios de Interpretación de la CLSI
Vancomicina y Staphylococcus spp.
Vancomicina
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Metodo de Screening para
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Metodo de Screening para
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Resistencia a Vancomicina –
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Criterios de Interpretación de la
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Streptococcus pneumoniae con
Sensibilidad disminuida a
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Que Lavarse las manos y utilizar
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Muchas Gracias !!!
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AUTOEVALUACION
Se reciben tres muestras de Hemocultivos: a las 48 hs son positivas, observándose en la coloración de Gram....
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Microorganismo = Staphylococcus epidermides.
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Tipo de Muestra = Sangre
Microorganismo = Staphylococcus aureus

Ciprofloxacina
Eritromicina
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Vancomicina

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Tipo de Muestra = Sangre
Microorganismo = Streptococcus pneumoniae
Cloramfenicol

S 30mm

Eritromicina

Oxacilina
Tetracic...
Tipo de Muestra = Ulcera Externa
Microorganismo = Enterococcus faecalis

Ampicilina
Gentamici-Alta Carga

S 36mm
S 19mm

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cocos gram positivos

Cocos Gram Positivos.

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  1. 1. COCOS GRAM POSITIVOS CGP
  2. 2. Identificación de Cocos Gram Positivos de Importancia Clínica
  3. 3. COCOS GRAM POSITIVOS Catalasa Positiva Staphylococcus Sp Catalasa Negativa Streptococcus Enterococcus
  4. 4. STAPHYLOCOCCUS Sp COAGULASA DNASA + - S. Aureus S.C.N Novobiocina 5 ug Resistente S. Saprophyticus Sensible S. Epidermides
  5. 5. STREPTOCOCCUS HEMOLISIS Beta Hemólisis Bacitracina Sensible S. pyogenes Resistente P. CAMP Positiva S. agalactiae Alfa Hemólisis P. Optoquina Positiva Negativo S. pneumoniae No Hemólisis Bilis esculina crecimiento NaCl 6.5% PYR Positivo Enterococcus Spp Negativo Streptococcus grupo viridans
  6. 6. PRUEBAS DE IDENTIFICACION
  7. 7. PRUEBA DE CATALASA Enzima que descompone el peroxido de hidrogeno en oxigeno y agua. H2 O 2 H2O + O2 (Burbuja de gas) Catalasa Técnica: Colocar una gota de H2O2 en un porta objeto y añadir con asa una colonia de la bacteria en estudio. “Nota” La tecnica no se puede hacer con colonia aislada de Agar Sangre ya que pueden dar falsos positivos porque los eritrocitos tienen actividad de catalasa. Resultados: POSITIVO: Formación de burbujas (desprendimiento de O2) NEGATIVO: No formación de burbujas.
  8. 8. PRODUCCION DE COAGULASA Enzima que transforma el fibrinogeno en fibrina, provocando la formación de un coagulo visible. Técnica: Hacer una suspensión en plasma con colonias de Staphylococcus en un tubo estéril. Incubar a 35ºc de 2 a 24h Resultados: PRUEBA POSITIVA: Formación de Coagulo PRUEBA NEGATIVA: No formación de coagulo
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  10. 10. PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA Es un ATB que inhibe el crecimiento de Staphylococcus epidermides. Técnica: Efectuar una siembra masiva en Agar Mueller Hinton colocar el disco de Novobiocina de 5 ug. Incubar 35ºC x 24h. Resultados: SENSIBLE: RESISTENTE: ≥ 16 <16
  11. 11. PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA La Optoquina inhibe selectivamente al desarrollo del Streptococcus Pneumoniae. Técnica: Hacer un inoculo equivalente al tubo 0.5 de la escala de MC. Farland Hisopar el inoculo en Agar MH sangre al 5% colocar el disco de optoquina Incubar a 35º C de 20 – 24h en lata con vela para proporcinar 5% de CO2 Resultados: SENSIBLE: Mayor 14 mm Halos entre 9 – 14 deben ser Confirmado con la prueba de Solubilidad en Bilis
  12. 12. PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA Es un ATB que inhibe el desarrollo del Estreptococos pyogenes a bajas concentraciones 0.02 a 0.04 unidades. Técnica: Hacer una siembra masiva en placa de Agar sangre, colocar el disco de Bacitracina. Incubar a 35ºC por 24h. Resultados: SENSIBLE: Cualquier halo de inhibición.
  13. 13. PRUEBA DE CAMP La actividad hemolítica de la beta lisina, Estafilococica sobre los eritrocitos se ven intensificados por un factor extracelular producido por el estreptococos del grupo B llamado factor Camp. Técnica: En una placa de Agar sangre realizar una estría de estreptococos en forma perpendicular a otra estría de Staphylococcus aureus, incubar a 35ºC x 24h. Resultados: CAMP POSITIVO: Formación de una flecha entre la estría del estreptococo y la estría de Staphylococcus aureus. CAMP NEGATIVO: No formación de flecha.
  14. 14. DESARROLLO EN NaCl al 6.5% Los Enterococcus tienen la capacidad de crecer a altas concentraciones de NaCl. Técnica: Hacer una suspensión en caldo NaCl al 6.5% con colonias de Enterococcus. Incubar a 35ºC x 24h Resultados: POSITIVO: Crecimiento en NaCl al 6.5% (Turbio) NEGATIVO: No crecimiento. (Transparente)
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  16. 16. Prueba de la Hidrólisis del PYR (Producción de Pirrolidonil-beta-Naftilamida Consiste en la capacidad de ciertas bacterias de hidrolizar la Pirrolidonil-beta naftilamida liberándose el grupo pirrolidico que se determina con el reactivo revelador. (N-N dimetilamino cinamaldehido). Técnica: Preparar una suspensión de la bacteria en estudio en solución fisiológica estéril se le agrega el disco impregnado con el reactivo se incuba 30 minutos a 35ºC, luego de la incubación se agregan 2 gotas del reactivo revelador. Resultados: POSITIVO: Disco color Rosado a Rojo NEGATIVO: Disco y/o solución color Amarillo a Incoloro.
  17. 17. QUE ENSAYAR Y QUE INFORMAR EN EL ATB DE COCOS GRAM POSITIVOS DE IMPORTANCIA CLINICA
  18. 18. Staphylococcus spp Informar Antibióticos Ensayar Orina Otros LCR A I Ampicilina 10 µg X X X Ampicilina/sulbactama 10/10 µg X X X X X X X X X X CXM X X X X Oxacilina 1µg X Cefoxitina 30 µg X Cefalotina 30 µg Gentamicina 10 µg X Eritromicina 15 µg X X Clindamicina 2 µg X X Rifampicina 5 µg X X X Trimetropina/sulfametoxazol 1,25/23,75 µg X X X Minociclina 30 µg X Vancomicina 30 µg X Ciprofloxacina 5 µg X Norfloxacina 10 µg Nitrofurantoinas 300 µg X X X X X X X X X X X X X X La resistencia del Staphylococcus a la oxacilina predice igual resistencia a todos los ATB Beta-lactamicos, incluyendo cefalosporina de primera, segunda, tercera y cuarta generación, inhibidores de beta-lactamasas y carbapenemes. Frente al aislamiento de staphylococcus multi-resistente deberá ensayarse: Linezolid, Quinupristina/Dalfopristina y nuevas fluorquinolonas. X
  19. 19. Enterococcus spp Antibióticos Informar Ensayar Orina Otros Sitios X Ampicilina (10 µg) X X Gentamicina (120 µg) X X Estreptomicina (300 µg) X X Vancomicina (30 µg) X X Teicoplanina ( 30 µg) X Ciprofloxacina (5 µg) X X Nitrofurantoina (300 µg) X X En los enterococos, la sensibilidad a ampicilina predice sensibilidad a las penicilina asociadas a los inhibidores de beta-lactamasa (ampicilina/sulbactama, amoxicilina/Clavulánico y peperacilina /tazobactama). Frente al aislamiento de Enterococcus vancomicino-resistente deberá ensayarse: Tetraciclina, Cloranfenicol, Rifampicina, Linezolid, Quinupristina/dalfopristina y nuevas Fluorquinolonas. Los discos de alta carga (Gentamicina 120 µg y estreptomicina 300 µg) se utilizan para predecir sinergia entre Penicilina, ampicilina o Vancomicina y un aminoglucósido.
  20. 20. Streptococcus pyogenes (grupo A) Antibióticos Ensayar Informar Fauces Eritromicina X X Clindamicina X Otras Localizaciones X X En Streptococcus pyogenes el CLSI no recomienda ensayar penicilina ni ningún otro antibiótico betaLactamico, ni Vancomicina, ya que no se encontraron, hasta la presente cepas resistente. La resistencia a eritromicina predice resistencia a roxitromicina, Claritromicina y azitromicina. En pacientes con fascitis necrotizante se debe informar clindamicina a demás de penicilina , ya que en estas situaciones deben utilizarse ambos antibióticos simultáneamente, dado que en esta infección los microorganismos se presentan en un alto inóculo y en fase estacionaria.
  21. 21. Streptococcus pneumoniae Antibiótico Ensayar Informar Meningitis Neumonía Otitis PEN, CRO/CTX (CIM) PEN (CIM) AMX/PEN (CIM) Oxacilina 1 ųg X Eritromicina 15 ųg X X X Clindamicina 2 ųg X X X Trimetoprima/sulfametoxazol 1.25/23.75 ųg X X X Tetraciclina 30 ųg X X Rifampicina 5 ųg X X Vancomicina 30 ųg X X Oxacilina es el único antibiótico beta-lactámico que se debe ensayar en la prueba de sensibilidad por el método de difusión en Agar. Frente al aislamiento de cepas resistente a Oxacilina (halo ≤ 19) se debe realizar CIM a Penicilina para determinar el nivel de resistencia. • La sensibilidad a Oxacilina predice sensibilidad a: penicilina, ampicilina, amoxicilina, cefotaxima, ceftriaxona, cefepima, Cefixima, cefuroxima, imipemen y meropenem.
  22. 22. PROBLEMAS PLANTEADOS POR LOS COCOS GRAM POSITIVOS La resistencia bacteriana a los ATB esta relacionada: A la calidad de las practicas higiénicas hospitalarias (Staphylococos meticilino-resistente). Al uso intensivo de ciertos ATB (Enterococos glucopeptido resistente). Al hacinamiento de pacientes (Neumococo con sensibilidad disminuida a penicilina).
  23. 23. STAPHYLOCOCCUS METILICINA RESISTENTE Los SMR presentan en su membrana una PBP adicional (PBP 2a) Gen mecA. De Baja afinidad a los ATB beta-lactamico Los SMR requieren mayor cantidad de cualquier ATB betalactamico para saturar las PBP. Por ello son resistente a todos los beta lactamicos incluido los carbapenemes.
  24. 24. Staphylococcus aureus Meticilina Resistente (MRSA) Incidencia incrementando en hospitales especialmente en UCI o en pacientes con quimioterapia Están comenzando a aparecer cepas Vancomicina Intermedia y Resistente Esta Emergiendo MRSA adquirido en la comunidad (CA-MRSA) que aparece susceptible a muchos agentes orales
  25. 25. Staphylococcus aureus Meticilino Resistente Adquirido en la Comunidad CA-MRSA
  26. 26. Propiedades Distintivas CA-MRSA Resistente solamente a Meticilina con Resistencia cruzada solamente a otros ß-lactamicos Asoc. con Síndromes semejando a los causados por MSSA Puede causar Infecciones Serias (fatales)
  27. 27. Manifestaciones CA-MRSA Neumonía Necrotizante Osteomielitis Abscesos Empiema Fascitis Necrotizante Tromboflebitis Séptica Sepsis Severa
  28. 28. CA-MRSA Opciones de Tratamiento Clindamicina - Oral es el agente que se ha redescubierto para Infecciones por CA-MRSA CA-MRSA la prueba es usualmente susceptible a Clindamicina El problema es cuando el microorganismos tiene una prueba de susceptibilidad: Eritromicina-R y Clindamicina-S Algunas cepas pueden tener Resistencia Inducible
  29. 29. DETECCION DE OXACILINA RESISTENTE EN STAPHYLOCOCCUS AUREUS Método: Oxacillin Screening Agar Agar Mueller Hinton con 4% de NaCl y 6µg/ml de Oxacilina. Suspension bacteriana 0.5 McFarland Sembrar sobre el agar 10 µl de la suspensión. Incubar 24h a 35º C. Crecimiento > 1 Colonia es positivo para Staphylococcus resistente a Oxacilina. La resistencia a la Oxacilina indica resistencia a todos los ATB ß Lactamicos y ß-lactamicos asociados a los inhibidores de ß lactamasas independientemente de su sensibilidad “In Vitro”
  30. 30. Punto de Corte establecido por el CLSI para Oxicilina DD (mm): R I ≤ 10 ≤ 17 S.aureus CoNS S 11-12 - ≥13 ≥18 MIC (µg/ml): S S.aureus CoNS ≤2 I - ≤ 0.25 R ≥4 - ≥0.5
  31. 31. Screen – Difusion de Disco para Resistencia mediada por gen mecA en Staphylococcus Reemplazar disco de Oxacilina por disco de Cefoxitina. Realizar método Estándar de Difusión de Disco con Disco de Cefoxitina (30 ųg). Incubar por 24 h. Los resultados pueden ser reportados despues de 18 h, si son resistentes. Reportar el resultado para OXACILINA, no para Cefoxitina.
  32. 32. Staphylococcus spp. “Los resultados de la prueba de Difusion de Disco con Cefoxitina de 30 µg debe ser usados para predecir la Resistencia mediada por gen mecA en Staphylococcus”.
  33. 33. Punto de Corte establecido por el CLSI para Cefoxitina (30µg) Cefoxitina Zona (mm) S.Aureus R ≤ 21 S ≥ 22 CoNS ≤ 24 ≥ 25
  34. 34. Staphylococcus spp. Eritromicina / Clindamicina Mecanismo Eflujo Alteración Ribosomal inducible Alteración Ribosomal constitutiva GEN Eritro Clinda msrA R S erm R S* erm R R
  35. 35. “Test D” – Reacción Positiva Resistencia Inducible a Clindamicina (mediada-erm) Antibiograma por Difusión de Disco: Colocar discos de 2 µg Clindamicina y 15 µg Eritromicina a una distancia de borde a borde de 15 mm a 26 mm. 15 - 26 mm
  36. 36. “Test D” – Reacción Negativa NO hay Inducción (Resistencia a Eritromicina: Mediada por gen msrA)
  37. 37. Staphylococcus Aureus con sensibilidad Intermedia y Resistencia a Vancomicina Un Problema - Crítico • • Vancomicina sigue siendo una droga importante por no sólo tratar Infecciones por Staphylococcus aureus, Staphylococcus Coagulasa-negativa, Neumococos, y una variedad de otros organismos Gram Positivos. Es muy importante descubrir la Resistencia Emergente a Vancomicina.
  38. 38. VISA Fenotipo vs. VRSA Genotipo Las cepas VISA representan un fenotipo que probablemente resulta de mutaciones en varias vías genéticas, que bajo larga presión con Vancomicina produce: - Paredes celulares alteradas, - Cambios en las vías metabólicas, - Lento crecimiento. En las cepas VRSA hay un cambio en el genotipo donde las cepas adquieren el gen de resistencia vanA, muestra una pequeña perdida de amplitud, y pueden transferir la resistencia de Vancomicina a otros organismos
  39. 39. Criterios de Interpretación de la CLSI Vancomicina y Staphylococcus spp. Vancomicina Disco (30 µg) MIC (µg/ml) Sensible Intermedio Resistente ≥ 15 mm ND ND ≤2 4-8 ≥ 16
  40. 40. Metodo de Screening para detectar mecanismo de Resistencia a Vancomicina Usar Placas de agar preparado comercialmente Preparar una suspensión con 4 a 5 colonias en caldo o solución salina a 0.5 McFarland, mezclar en vortex. Usar asa calibrada de 1 o 10-µl o pipeta para inocular en la placa (hasta 6 cepas/placa) Dejar que el inóculo se absorba.
  41. 41. Metodo de Screening para detectar mecanismos de Resistencia a Vancomicina Invertir las placas e incubar a 35ºC en ambiente aeróbico. Examinar después de 16-18 hrs. de incubación; si no hay crecimiento, re-incubar y examinar 24 horas después. Crecimiento >1 colonia es positivo para VISA/VRSA Confirmar identificación; no realizar MIC automatizado
  42. 42. Resistencia a Vancomicina – Enterococcus spp.  Fenotipos más comunes: Resistencia Adquirida Van A: Fenotipo de alto nivel de resistencia a Vancomicina y E. faecium Teicoplanina. Van B: Bajo a alto nivel de resistencia E. faecalis solo a Vancomicina. Resistencia Intrínseca Van C: Fenotipo asociado a bajo nivel de E.gallinarum resistencia a Vancomicina.
  43. 43. Criterios de Interpretación de la CLSI para Enterococcus spp. Agente antimicrobiano Resistente Menor o = Intermedio Sensible Mayor o = Vancomicina 30μg 14 15 – 16 17 Ampicilina 10μg 16 - 17 Gentamicina 120 μg 6 7-9 10 Estreptomicina 300 μg 6 7-9 10
  44. 44. Streptococcus pneumoniae con Sensibilidad disminuida a Penicilina La resistencia a la penicilina se debe a la alteración de los PBP (gen en mosaico) y no por la producción de beta – lactamasa.
  45. 45. Screen Difusión de Disco para detectar Resistencia a la penicilina en S.pneumoniae Realizar método Estándar de Difusión de Disco en Agar MH sangre al 5% con disco de Oxacilina (1µg). Incubar a 35º C de 20-24 h. En presencia de CO2 5% Reportar los resultados para Penicilina, no para Oxacilina. Punto de Corte: S ≥ 20 mm Halos < 19mm realizar CIM
  46. 46. RECORDEMOS Que Lavarse las manos y utilizar Correctamente los ATB reduce la resistencia bacteriana. Muchas Gracias !!! Robafi30@hotmail.com
  47. 47. AUTOEVALUACION Se reciben tres muestras de Hemocultivos: a las 48 hs son positivas, observándose en la coloración de Gram.: cocos Gram. (+) en racimos y cortas cadenas. ¿Qué medios de cultivo elegiría? EMB Agar Tripteína soya Agar sangre Agar chocolate Después de 24 hs de incubación a 35ºC, se observan colonias con iguales características y tinción de Gram. coincidente con la anterior. ¿Cuál de las siguientes pruebas realizaría primero? Dnasa Coagulasa Oxidasa Catalasa ¿De cual de los medios de cultivo anteriores se puede realizar? Se obtienen los siguientes resultados en las pruebas bioquímicas. Dnasa (-) Coagulasa (-) Resistencias a Novobiocina (-) Catalasa (+) De que microorganismos se trata? En este caso provienen de un paciente con catéter implantable sometido hace un año a transplante de medula ósea Informa: Positivo Se solicitan mas muestras Negativo Contaminado
  48. 48. Tipo de Muestra = Hueso Microorganismo = Staphylococcus epidermides. Eritromicina Oxacilina Vancomicina Clindamicina R 6mm R 6mm S 21mm R 6mm Gentamicina S Rifampicina R Trimeto/sulfametoxazol R 17mm 6mm 6mm ¿Cómo informaría cefalotina, con respecto al resultado de Oxacilina?.
  49. 49. Tipo de Muestra = Sangre Microorganismo = Staphylococcus aureus Ciprofloxacina Eritromicina Oxacilina Vancomicina R R R S 6mm 6mm 6mm 19mm Clindamicina Gentamicina Rifampicina Trimeto/sulfametoxazol R 6mm R 6mm S 34mm S 27mm ¿Qué método utilizaron para predecir la resistencia a Oxacilina?
  50. 50. Tipo de Muestra = Sangre Microorganismo = Streptococcus pneumoniae Cloramfenicol S 30mm Eritromicina Oxacilina Tetraciclina Vancomicina S 22mm S 23mm S 25mm Rifampicina S 30mm Trimeto/sulfametoxazol S 25mm ¿Se informaría Oxacilina? S 32mm
  51. 51. Tipo de Muestra = Ulcera Externa Microorganismo = Enterococcus faecalis Ampicilina Gentamici-Alta Carga S 36mm S 19mm Eritromicina S Vancomicina S 15mm 19mm ¿A que otros ATB es sensible este Enterococcus con relación al resultado de ampicilina?

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