Este documento describe las herramientas moleculares utilizadas en ingeniería genética, incluyendo enzimas de restricción, sistemas de modificación-restricción y plásmidos. Explica cómo las enzimas de restricción cortan el ADN en secuencias específicas y cómo los sistemas de modificación-restricción protegen el ADN bacteriano. También resume los tipos de plásmidos, su clasificación, replicación y aplicaciones como vehículos de clonación.

1. Herramientas
Moleculares
Enzimas de Restricción
Clonación Molecular

2. Sistema Modificación-Restricción
! Sistema inmune para la contra patógenos en bacterias,
protegiéndolas del ataque de DNA foráneo (ej.: bacteriófago).
! R: endonucleasa (corte ADN).
! M: modifica al DNA por metilación (metilasa)
! Cada enzima de restricción tiene una metilasa asociada.
! Ambas enzimas reconocen la misma secuencia de bases. La metilasa
metila una base determinada siempre dentro de la secuencia de
reconocimiento, mientras que la endonucleasa puede cortar dentro
de la secuencia de reconocimiento o fuera de ella, dependiendo del
tipo de enzima.
! La metilación en las dos hebras del DNA evita que la Enzima de
Restricción pueda cortar la molécula de DNA. Este mecanismo es
empleado por las bacterias para proteger a su propio DNA
genómico y plasmídico del ataque de sus propias Enzimas.

3. ! También llamadas endonucleasas de restricción.
! 1962: “Tijeras Moleculares” descubiertas en
bacterias.
! Las bacterias tienen un sistema inmune enzimático
que reconoce ADN foráneo y lo destruyen.
! 3,000 enzimas han sido identificadas, alrededor de
200 tienen propiedades únicas y muchas de ellas han
sido purificadas y están disponibles comercialmente.
Enzimas de Restricción

4. Propiedades de las enzimas de
Restricción
Cortan enlace
fosfodiéster del
material genético a
partir de secuencias de
4 a 12 pb que
reconocen.

5. Secuencias de reconocimiento
! Cada enzima de restricción siempre corta a la misma
secuencia de reconocimiento.
! Una enzima siempre produce el mismo patrón de bandeo
en una región de ADN específico (fingerprint)
! Muchas enzimas de restricción reconocen secuenciad
palíndromes:
!
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
CCCGGG
GGGCCC
SmaI
GGTACC
CCATGG
KpnI

6. Extremos cohesivos
! Muchas enzimas de restricción producen cortes
escalonados.
! El corte escalonado produce una porción de ADN
de hebra simple o “extremo cohesivo”
! ADNs de diferente fuente puede ser fácilmente
ensamblado en extremos cohesivos compatibles.
EcoRI
HindIII
- OH 3’

7. Extremos romos
AluI
HaeIII
! Algunas enzima cortan el ADN en la base
opuesta o complementaria.
! Estas enzimas dejan extremos romos sin dejar
regiones de hebra simple.

8. Nomenclatura de las enzimas
Según su origen:
1. Tres letras que corresponden al nombre
científico del microorganismo (Género y especie)
2. 2º La cepa o estirpe si la hubiese.
3. 3º Número romano, para distinguir
endonucleasas aislada de una misma especie.
4. Ejemplos:
- EcoRV: Escherichia coli, cepa RY13, quinta enzima
descubierta.
- HindIII: Haemophilus influenzae serotipo d, tercera
enzima descibierta.

9. Algunas enzimas de restricción:
Enzima Organismo del que deriva
Secuencia blanco
(cut at *)
5' -->3'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C
EcoRI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C
HindIII Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T
NdeI Neisseria denitrificans CA* TATG
PstI Providencia stuartii C T G C A * G
SmaI Serratia marcescens C C C * G G G
TaqI Thermophilus aquaticus T * C G A
XmaI Xanthamonas malvacearum C * C C G G G

10. Tipos de enzimas de restricción
(sistema R-M)
Tipo I:
! En la misma enzima tienen 2 subunidades para la
restricción, 2 subunidades para la modificación
(metilación) y una subunidad para el reconocimiento.
! Tanto la metilación como el corte requieren de ATP.
! El corte se da a alguna distancia del lugar de
reconocimiento.
! Poco valor para manipulación genética.

11. Tipo II:
! No tienen actividad metilasa, solamente tienen
actividad de endonucleasa.
! No requieren de cofactores como ATP por lo que su
uso es más sencillo.
! El lugar de reconocimiento generalmente es
simétrico y cortan al DNA en el lugar de
reconocimiento.
! Requieren Mg 2+ como cofactor

12. Tipo IIs:
! Son parecidos a los del tipo II, pero la
restricción ocurre en lugares del DNA alejados
del lugar de reconocimiento, por lo que su uso en
ingeniería genética también es reducido.
Tipo III:
! Tienen lugares de reconocimiento simétricos,
pero se parecen en lo demás a los sistemas del
tipo I, por lo que son poco útiles.
! Requieren ATP como cofactor importante.

13. Aplicaciones de las enzimas de
restricción
! Mapeos de restricción.
! Fragmentación de ADN
para electroforesis y
Southern Blot.
! Clonación molecular:
“ADN Recombinante”.

14. Definición:
“Molécula
de
ADN
lineal
o
circular,
que
se
replica
independiente
del
cromosoma
y
que
con9ene
genes
ú9les
pero
no
necesarios
para
la
supervivencia
celular”.
Ocurrencia:
-­‐ Procariotas
(bacterias
y
archeas).
-­‐ Eucariotas
(protozoos,
levaduras,
plantas).
Tamaño:
100
a
400.000
pb
(1
a
400
Kb).
PLÁSMIDOS

15. Representa<vidad:
" 1
copia
(plásmidos
grandes).
" Hasta
100
copias
(plásmidos
pequeños).
Replicación:
" Requiere
maquinaria
celular.
" El
número
de
copias
es
regulado
por
el
inicio
de
replicación.
*Incompa<bilidad:
Ocurre
cuando
dos
plásmidos
no
pueden
mantenerse
estables
en
la
misma
célula,
porque
la
replicación
de
uno
interfiere
con
la
del
otro.
*
Episomas:
Algunos
plásmidos
pueden
integrarse
en
el
cromosoma.
PLÁSMIDOS

16.
Clasificación
de
Plásmidos
1.
Por
su
habilidad
de
transferirse
a
otras
bacterias
1.1
Plásmidos
conjuga<vos:
Estos
plásmidos
se
transfieren
a
otras
bacterias
a
través
de
un
pili
sexual.

17. Conjugación

18. Conjugación:
Importancia
• Bacterias
Gram
-­‐
− Resistencia
an9microbianos
− Diseminación
rápida
• Bacterias
Gram
+
− Producción
de
factores
de
adherencia
− Resistencia
an9microbianos

19. " Gran
tamaño
(100
kb)
" Bajo
número
de
copias
(1/2
x
célula)
" Se
transfiere
por
si
mismo.
" repE
codifica
para
la
prot.
de
replicación
RepE.
" RepE
se
une
al
origen
de
replicación
(oriS)
e
inicia
la
replicación
del
plásmido.
" RepE
se
une
al
promotor
de
repE
ac9vando
la
transcripción.
Plásmido
F

21. Pili
Conjugación

22. Organización
plásmido
F

23.
Clasificación
de
Plásmidos
1.
Por
su
habilidad
de
transferirse
a
otras
bacterias
1.2
No
conjuga<vos
Plásmidos
que
no
se
conjugan.
Algunos
pueden
conjugar
pero
con
la
ayuda
de
otros
plásmidos
conjuga9vos.
.
1.3
Movilizables:
Con9enen
sólo
algunos
genes
requeridos
para
la
transferencia.
Éstos
pueden
parasitar
a
otros
plásmidos,
transfiriéndose
con
alta
frecuencia
en
presencia
de
uno
conjuga9vo.

24. 2.
Clasificación
de
Plásmidos
2.1
Fer<lidad-­‐(Plásmido
F).
Plásmidos
conjuga9vos
y
que
con9ene
todos
los
genes
necesarios
para
este
proceso.
2.2
Resistencia-­‐(Plásmido
R)
Con9enen
genes
que
otorgan
resistencia
a
an9bió9cos
u
otros
compuestos
.
2.3
Plásmidos
Col:
Con9enen
genes
que
codifican
para
colicinas
(proteínas
que
matan
a
otras
bacterias).
2.4
Plásmidos
degrada<vos.
Genes
que
9enen
relación
con
la
diges9ón
de
sustancias
químicas
complejas
como
tolueno
o
ácido
salicílico.
2.5
Plásmidos
de
Virulencia.
Genes
de
virulencia.
2.6
Plásmidos
de
adicción.
Genes
Toxina-­‐An9toxina.

25. Herramientas
Moleculares
CLONACIÓN MOLECULAR

26. 26
# Clonamiento:
Proceso para producir poblaciones de individuos
genéticamente idénticas.
# Clonamiento Celular:
Producir células genéticamante idénticas
Clonamiento

27. Clonación Molecular
# Se refiere al proceso de aislar una
secuencia de ADN de interés, insertarlo en
un plásmido o vector de clonación y obtener
múltiples copias de ella en un organismo
(generalmente procariota) por acción de la
DNA polimerasa.

28. Vector de clonación
# Molécula pequeña de ADN que puede
replicarse de manera autónoma en un
huésped (células bacterianas o de
levaduras).
# Los vectores se utilizan para clonación
porque pueden seguir su desarrollo normal
a pesar de que secuencias adicionales de
ADN sean incorporadas en su material
genético.

29. Características de los vectores
de clonación

30. Tipos de vectores de clonación
# Plásmidos
# Bacteriófagos (Fago lambda)
# Cósmidos
# Fásmidos (fagémidos).
# Cromosomas Artificiales:
# Bacmidos (bacterias).
# YAC (Levaduras).

31. PLÁSMIDOS
Moléculas de ADN generalmente circular
extracromosomal que se replican
indepedientemente del DNA cromosómico.
Pueden contener un tamaño de inserto no
superior a 20 Kb.

32. Los plásmidos naturales pueden conferir a las
bacterias las siguientes características:
# Resistencia a antibióticos, metales pesados, UV.
# Degradación de productos del petróleo
# FACTORES DE VIRULENCIA:
- Toxinas: E. coli enteropatogénica
- Factores de adherencia: pili en E. coli
- Adhesinas
- Hemolisinas
- Bacteriocinas
- Efectores de virulencia.
# Control del metabolismo de lactosa, rafinosa, citrato,
galactosa, xilosa.
# Fijación del nitrógeno.

33. Un plásmido natural puede ser:
1) Conjugativos
2) No conjugativos

34. Bacteriófagos (Fago Lamda)
Es un virus bacteriófago,
cuya región central del
genoma es prescindible y
se puede sustituir por un
inserto de ADN. Tamaño
de inserto 10- 15 kb. Se
forma un multímero que
luego se utiliza para
rellenar cápsides del fago
mediante
empaquetamiento in vitro.

35. Cósmidos
Son vectores híbridos entre el
fago H y un plásmido. Se
pueden replicar en una
bacteria o empaquetarse como
un fago.
Tamaño de inserto hasta 45
kb.
Se remueve casi todo el ADN
del H y se deja sólo las
secuencias que actúan como
señales de empaquetamiento
(cos). Casi todo se rellena con
el inserto que queremos clonar.
Se replican a modo de
plásmido

36. Fásmido
Son vectores que
combinan las
características de un
fago filamentoso y un
plásmido y contienen
tanto el origen de
replicación del fago
como del plásmido.

37. Cromosomas artificiales:
Bácmidos y YACs:
Se desarrollaron con el objetivo de clonar
grandes segmentos de cromosomas
eucarióticos.