Thesis Presentation: Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo
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Thesis Presentation: Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo
- 1. Tesi di Laurea in Medicina Facoltà di Medicina e Psicologia – Università di Roma “La Sapienza” Angelo D’Ambrosio “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo.”
- 2. La Patologia Psichiatria È Molto Diffusa Un terzo della popolazione europea riporterà una patologia psichiatrica nel corso della vita. (Alonso J, Angermeyer MC, Bernert S, et al., 2004) Prevalenza maggiori disturbi psichiatrici: •Disturbi d’ansia: 10.6% •Disturbi dell’umore: 6.8% •Schizofrenia: 0.4% •Disturbi della personalità: 13.4% D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 2
- 3. La Patologia Psichiatria È Molto Diffusa La maggior parte dei farmaci a nostra disposizione agisce sulle sinapsi e in partcolare sul sistema delle monoammine (serotina, noradrenalina, GABA) VIENE TRATTATO IL SINTOMO NON LA CAUSA D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 3
- 4. Epigenetica Renthal and Nestler Dialog. Clin Neurosci 11, 2009 D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 4
- 5. Epigenetica D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 5
- 6. SATB1 e SATB2 e le MAR La cromatina è organizzata in anse. D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 6
- 7. SATB1 e SATB2 e le MAR Le Matrix Attachment Regions (MARs) sono dei domini che permettono l’attracco del DNA alla matrice nucleare e la formazione e la regolazione delle anse della cromatina. D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 7
- 8. SATB1 e SATB2 e le MAR I fattori SATB si legano alla base delle anse e fungono da landing point per una molteplicità di effettori, fra i quali anche HDAC e HAT. D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 8
- 9. SATB1 e SATB2 I fattori SATB sono necessari per lo sviluppo di molte linee cellulari e sono coinvolti in alcune patologie. SATB1 Switch da emoglobina fetale ad adulta Differenziazione CD4+CD8+ Patologia SATB2 Necessario lyonizzazione chromosoma X Sviluppo osseo Attivazione IgM in cellule B Deficit causa ritardo mentale Fenotipo metastatico K mammella Nel Sistema Nervoso Sviluppo IEG Corretta formazione precoce delle spine dendritiche Patologia Deformazioni crani-facciali, palato schisi, ritardo mentale, Screening K Colon Retto Nel Sistema Nervoso Fenotipo cortico-corticale neuroni corteccia Swtich colinergico delle fibre sudoromotorie del simpatico D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 9
- 10. SATB1 e SATB2, Riassumendo I fattori SATB regolano l’espressione di molti geni permettendo la modifica della cromatina. Fungono quindi da interruttori generali del fenotipo cellulare. Le informazioni sulla loro funzione fa intuire un possibile ruolo nelle funzioni cognitive superiori e quindi anche nella loro patologia. Il nostro studio è un primo approccio alla definizione di SATB2 nei processi di apprendimento e affettivi. A tal fine abbiamo indagato l’effetto del modello del Fear Conditioning sull’espressione nell’amigdala di topo. D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 10
- 11. Fear Conditioning E’ un paradigma di memoria associativa. Presentando più volte uno stimolo emotivamente neutro, come un suono, con uno rilevante, come il dolore causato da una scossa elettrica, alla fine lo stimolo neutro sarà in grado autonomamente di provare risposte associate a quello rilevante. La risposta che noi andiamo a misurare è il freezing. D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 11
- 12. Amigdala D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 12
- 13. Protocolli Di Fear Conditioning D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 13
- 14. Protocollo Di Fear Conditioning Fear Acquisition US CS Pausa 2s 2s 30s 120s PreCS 2s 30s P P CS1 2s 30s CS2 2s 30s 30s P P CS3 CS4 30s 30s 120s CS4 PostCS Fear Extinction CS Pausa 30s 30s 120s PreCS P 30s P CS1 CS2 P CS3 CS14 120s CS15 PostCS Control Training 30s CS Pausa 30s 120s PreCS P CS1 CS2 Reinstatement US CS Pausa 30s P 30s 30s P P CS3 CS4 120s CS5 PostCS Fear Testing 2s CS 30s 120s 120s PreCS CS1 PostCS Pausa 30s 120s PreCS 120s CS1 PostCS D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 14
- 15. Metodi Topi C57/Bl6n. Perfusione tramite infusione transcardica di acido picrico e paraformaldeide. Immunostaining con immuno perossidasi e immuno fluorescenza. Anticorpi utilizzati per le proteine SAT: •Rabbit policlonale anti-SATB1 (rRbSATB1) [1:1000] da Abcam (ab49061) •Mouse monoclonale anti-SATB2 (mMsSATB2) [1:1500] da Abcam (ab51502) •Rabbit monoclonale anti-SATB12 (mRbSATB2) [1:500] da Abcam (ab92446) D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 15
- 16. Immunoreatività D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 16
- 17. Immunoreatività Mancanza di co-localizzazione tra FOXP2 e SATB21/ nel complesso basolaterale dell’amigdala Anti-FOXP2 = rosso mMs-SATB2 = verde D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 17
- 18. Immunoreatività Assenza di espressione del SATB-1/2 nei neuroni GABAergici inibitori nell’amigdala Anti-GAD = rosso mMs-SATB2 = verde D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 18
- 19. Training di Fear Conditioning I dati mostrano l’efficacia del modello, con un aumento significativo del freezing FA: fear acquisition FC: fear conditioning S/L: Short/Long D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 19
- 20. Quantificazione segnale Costante diminuzione a 24h e a 72h del segnale di SATB1 nell’amigdala basolaterale. D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 20
- 21. Quantificazione segnale Il segnale di SATB2 in amigdala basolaterale è difficilmente apprezzabile e mostra una variazione a campana, sebbene non significativa. D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 21
- 22. Interpretazioni • Diminuzione di SATB1 nei topi trattati • Diminuzione di SATB1 potrebbe impedire complessamento HDAC con cromatina, favorendo la trascrizione genica necessaria per plasticità sinaptica • SATB1 e SATB2 potrebbero interagire positivamente o negativamente. • Impossibile valutare effetti di modifiche post-trascrizionali su SATB1 e SATB2. • In futuro sarà necessario sviluppare dei knock-out condizionali per valutare gli effetti del deficit dei fattori SATB sull’apprendimento di ansia e paura nel Fear Conditioning. D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 22
- 23. Epigenetica? Un meccanismo complesso per un sistema complesso D’Ambrosio, A. “Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo”. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012 23
- 24. GRAZIE!
Editor's Notes
- ⁃Le patologie psichiatriche sono estremamente comuni andando a colpire un terzo della popolazione europea (Wittchen HU, Jacobi F., 2005) Uno studio europeo ha riportato una prevalenza di disturbi d'ansia dell'11% in europa
- L'approccio farmacologico fin'ora utilizzato, basato sulla regolazione delle monoammine e dei loro recettori ha avuto successi limitati. Si cura il sintomo ma non la causa
- Una nuova serie di studi si sta concentrando sull'epigenetica, come meccanismo di regolazione dell'espressione generalizzata del DNA e quindi del fenotipo neuronale I paradigmi più noti dell'epigenetica sono la metilazione del DNA e la modifica del grado di compattazione attraverso il controllo del livello di acetilazione degli istoni da parte dei fattori nucleari HDAC e HAT Studi sugli inibitori degli HDAC hanno avuto effetti positivi nei distubi dell'umore. Ma questi fattori hanno un effetto generalizzato sulla trascrizione genica. Abbiamo quindi di capire meglio come funziona il fenomeno della regolazione epigenetica per trovare target farmacologici più specifici.
- Una nuova serie di studi si sta concentrando sull'epigenetica, come meccanismo di regolazione dell'espressione generalizzata del DNA e quindi del fenotipo neuronale I paradigmi più noti dell'epigenetica sono la metilazione del DNA e la modifica del grado di compattazione attraverso il controllo del livello di acetilazione degli istoni da parte dei fattori nucleari HDAC e HAT Studi sugli inibitori degli HDAC hanno avuto effetti positivi nei distubi dell'umore. Ma questi fattori hanno un effetto generalizzato sulla trascrizione genica. Abbiamo quindi di capire meglio come funziona il fenomeno della regolazione epigenetica per trovare target farmacologici più specifici.
- Il nostro studio si è concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2 La cromatina nel nucleo in interfase è organizzata in anse che regolano l'accessibilità di tali regioni ai macchinari nucleare. Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica. SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori più o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.
- Il nostro studio si è concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2 La cromatina nel nucleo in interfase è organizzata in anse che regolano l'accessibilità di tali regioni ai macchinari nucleare. Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica. SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori più o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.
- Il nostro studio si è concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2 La cromatina nel nucleo in interfase è organizzata in anse che regolano l'accessibilità di tali regioni ai macchinari nucleare. Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica. SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori più o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.
- Sono stati studiati i ruoli di SATB soprattutto nello sviluppo SATB1 fa SATB2 fa Entrabi agiscono nel sistema Nervoso. SATB1 regola la sequenza dell'espressione di geni necessari per la plasticità sinaptica e la densita di sinapsi. SATB2 è necessario per la differenziazione dei neuroni corticali da cortico-spinali a cortico-corticali.
- Regolatori globali dell'espressione genica e quindi probabilmente coinvolti nelle funzioni cognitive superiori e nelle loro alterazioni patologiche
- Noi abbiamo indagato come SATB vengano inluenzati nel topo dal FC, un paradigma di memoria associativa. il paradigma dice che associando più volte un stimolo neutro (un suono, o il contesto stesso) con uno emozionalmente rilevante, lo stimolo neutro sarà in grado di provocare le risposte associate allo stimolo avversivo Per valutare la creazione delle memorie associative registriamo il freezing, ovvero il tempo di assenza di qualunque movimento nel topo a parte il respiro.
- Noi abbiamo indagato l'influenza che questi due fattori possono avere nell'amigdala. L'amigdala è il centro nevralgico di analisi e memorizzazione della paura e dell'ansia. Nuclei e connessioni
- I 3 anticorpi mostrano un segnale differente in amigdala. dal confronto con la letteratura possiamo dire che pRB e mRB sono specifici. Quindi mMs è specifico per entrambi. Noi questo lo abbiamo scoperto dopo e abbiamo eseguito i nostri esperimenti Ma il fatto che il segnale di SATB2 in amigdala è trascurabile rispetto a SATB1, possiamo attribuire i risultati a SATB1
- Proponiamo per brevità i dati di un solo esperimento, ma esperimenti simili da noi fatti danno risultati simili. Analizzando i dati del comportamento possiamo vedere come il FC sia un paradigma efficacia nella creazione di ansia e paura associativa sia per gli stimoli sensoriali, che per il contesto.
- Mostriamo quindi i risultati sulla quantificazione cellulare di SATB1, fatta tramite l'anticorpo doppiamente specifico su citato. possiamo vedere sia dalle immagini che dal grafico come il segnale di SATB1 cali in BLA passando dai controlli, ai topi sacrificatii 24h dopo training a quelli sacrificati 72h questo cambiamento e il trend decrescente sono statisticamente significativi
- SATB2 mostra invece risultati più dubbi. abbiamo un comportamento a campana invertita, che indica una prima sotto regolazione di SATB2 che tende a regredire a livelli normali. Sfortunatamente non significativi
- Questi risultati, soprattutto per satb1 possono essere interpretati con il ruolo che questo ha sul compattamento della cromatina tramite HDAC. Infatti SATB1 funge da punto di attracco per questo fattore permettendogli di deacitilare gli istoni, aumentando così il compattamento della cromatina e quindi diminuendo la trascrizione genica. di converso una diminuizione di SATB1 potrebbe accompagnarsi ad una regolazione positiva di certi geni, necessaria per la plasticità sinaptica.
- Vediamo quindi come l'epigenetica aggiunge ennesimi livelli di complessità al vecchio paradigma un gene una proteina. Complessità che si manifesta chiaramente nella complessità del nostro sistema nervoso, nella fisiologia e nella patologia. Comprendere tali sistemi ci permetterà di affinare ancora ulteriormente le nostre armi terapeutiche per riportare nei ranghi quegli interruttori fenotipici andati fuori asse.