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C e n t r e 	
   d e 	
   R e c h e r c h e 	
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   l ’ I n s t i t u t 	
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   C e r v e a u 	
   e t 	
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   l a 	
   M o e l l e 	
   E p i n i è r e 	
  
P a r i s , 	
   F r a n c e 	
  
Etude	
  de	
  la	
  navigation	
  spatiale	
  par	
  
imagerie	
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  chez	
  le	
  rat	
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Antoine	
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  :	
  Cortex	
  et	
  Epilepsie,	
  INSERM	
  U975	
  
M2	
  Cogmaster	
  
2012	
  
2 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
	
  
	
   	
  
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 3
Table des matières
TABLE	
  DES	
  MATIERES	
  ..................................................................................................................................	
  3	
  
INTRODUCTION	
  ..............................................................................................................................................	
  4	
  
NAVIGATION	
  SPATIALE	
  ......................................................................................................................................................	
  4	
  
RYTHME	
  THETA	
  HIPPOCAMPIQUE	
  ....................................................................................................................................	
  5	
  
Description	
  ............................................................................................................................................................................	
  5	
  
Corrélats comportementaux	
  .............................................................................................................................................	
  6	
  
Génération	
  ............................................................................................................................................................................	
  6	
  
Fonction	
  ................................................................................................................................................................................	
  6	
  
IMAGERIE	
  ULTRASONORE	
  FONCTIONNELLE	
  (FUS)	
  ......................................................................................................	
  7	
  
Principe	
  de	
  l’échographie-­‐Doppler	
  classique	
  .....................................................................................................	
  7	
  
Ultrafast	
  Doppler	
  Compound	
  ....................................................................................................................................	
  8	
  
Lien	
  avec	
  les	
  grandeurs	
  hémodynamiques	
  ..........................................................................................................	
  9	
  
Résultats	
  chez	
  l’animal	
  anesthésié	
  ......................................................................................................................	
  10	
  
VERS	
  L’IMAGERIE	
  ULTRASONORE	
  MOBILE	
  ...................................................................................................................	
  11	
  
PROBLEMATIQUE	
  ........................................................................................................................................	
  12	
  
DEMARCHE	
  ET	
  METHODES	
  ......................................................................................................................	
  13	
  
DEVELOPPEMENT	
  TECHNIQUE	
  ......................................................................................................................................	
  13	
  
Chirurgie	
  .........................................................................................................................................................................	
  13	
  
Fixation de la sonde	
  ........................................................................................................................................................	
  15	
  
PROTOCOLE	
  D’ENREGISTREMENT	
  .................................................................................................................................	
  16	
  
Acquisition des épisodes de thêta	
  ................................................................................................................................	
  16	
  
Système de synchronisation EEG-vidéo-fUS	
  .............................................................................................................	
  17	
  
Différents modes d’imagerie	
  ..........................................................................................................................................	
  17	
  
ANALYSE	
  DU	
  SIGNAL	
  ........................................................................................................................................................	
  18	
  
Détection du mouvement du rat	
  ....................................................................................................................................	
  18	
  
Détection de la direction de la tête	
  ...............................................................................................................................	
  18	
  
Extraction des épisodes de thêta	
  ..................................................................................................................................	
  18	
  
Recherche des régions d’intérêt	
  ...................................................................................................................................	
  19	
  
RESULTATS	
  ....................................................................................................................................................	
  20	
  
ETUDE DES VARIABLES DE LA NAVIGATION SPATIALE	
  ......................................................................................................	
  20	
  
Signaux étudiés	
  ................................................................................................................................................................	
  20	
  
Etudes de corrélation	
  ......................................................................................................................................................	
  20	
  
Influence sur la mobilité	
  ..................................................................................................................................................	
  22	
  
COMPARAISON STATISTIQUE ANIMAL EVEILLE/ANESTHESIE	
  ............................................................................................	
  22	
  
Contraste Mobile (M) / Anesthésie	
  ...............................................................................................................................	
  22	
  
Profil des données	
  ...........................................................................................................................................................	
  23	
  
Analyse statistique	
  ...........................................................................................................................................................	
  24	
  
CORRELATIONS	
  FONCTIONNELLES	
  FUS	
  .......................................................................................................................	
  26	
  
Recherche de pixels d’intérêt corrélant avec les indices de navigation spatiale	
  ................................................	
  27	
  
Analyse par régions	
  .........................................................................................................................................................	
  27	
  
DISCUSSION	
  ...................................................................................................................................................	
  29	
  
BIBLIOGRAPHIE	
  ...........................................................................................................................................	
  31	
  
ANNEXES	
  .........................................................................................................................................................	
  33	
  
4 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
Introduction
	
   Navigation	
  spatiale	
  
Se repérer dans un environnement donné met en jeu de multiples fonctions cognitives incluant
perception, mémoire, apprentissage et motivation et nécessite une étroite coordination entre les
structures impliquées dans ces différentes fonctions. Il paraît donc inapproprié de tenter d’isoler un
substrat neuronal spécifique de la navigation spatiale au regard de la diversité des fonctions requises
dans cette tâche. Les résultats de ces dernières années ont mis en lumière certaines unités
fonctionnelles codant pour un aspect très spécifique de l’information spatiale, suggérant l’existence d’un
réseau modulaire spécialisé dans le traitement de ce type d’information. Cependant, l’architecture
fonctionnelle des réseaux sous-tendant la navigation spatiale reste incomprise, bien que les propriétés
de certains types de neurone fournissent de précieux indices sur leur rôle dans l’intégration globale de
l’information spatiale.
Certaines cellules exhibant des propriétés spatiales particulières ont été décrites pour la première fois
en 1971 par O’Keefe et Dostrovsky (O’Keefe & Dostrovsky, 1971 ; O’Keefe & Nadel, 1978). Ces
cellules de l’hippocampe, appelées cellules de lieu, déchargent à haute fréquence lorsque l’animal se
trouve dans un endroit donné de l’espace, définissant ainsi un champ récepteur (place field) analogue
au champs récepteurs de la vision. Ces champs de lieu sont rapides à mettre en place lorsque l’animal
explore un environnement nouveau, ils sont stables au cours du temps et codent à la fois pour le
repérage absolu et relatif. Ces champs ne sont pas seulement ‘sensoriels’ mais aussi ‘cognitifs’ et ils
exhibent une composante temporelle forte, notamment lors de phénomène tels que la précession de
phase.
D’autres cellules jouant un rôle particulier dans l’intégration de l’information spatiale ont ensuite été
étudiées : les cellules de direction de la tête présentes dans le subiculum le cortex entorhinal et
l’hippocampe (Ranck 1984, 1990) déchargent lorsque l’animal tourne sa tête dans une direction
particulière, indépendamment de sa position ; les cellules de grille, présentes dans le cortex entorhinal,
sont analogues aux cellules de lieu mais leur champ récepteur est un maillage topologique triangulaire
de l’espace (Moser, 2005). Il a été proposé que l’information contenue dans le codage des cellules de
grille conjointement à celle des cellules de lieu permette une représentation précise de la position et de
la vitesse de l’animal dans un espace euclidien. Plus récemment, il a été montré que le taux de
décharge de certaines cellules du subiculum corrèle spécifiquement à la distance de l’animal par
rapport à certaines frontières de l’environnement comme un fossé, un mur ou repère caractéristique
(Lever, O’Keefe, Burgess, 2009). Ces cellules dont l’existence a été suggérée par des modèles
computationnels de navigation spatial correspondent à un codage relatif de l’environnement (en
opposition à un codage absolu comme celui des cellules de grille.
Le type d’information codé par ces différentes cellules de position, bien que divers, reste néanmoins
très local. Afin de comprendre comment ces informations s’organisent pour former une représentation
robuste et flexible de l’environnement, il est crucial de mettre en lumière comment les mécanismes
d’intégration passent d’une information locale (au niveau) à un niveau global. Il a été proposé que la
synchronisation d’assemblées cellulaires et la génération de rythmes soit un moyen efficace pour
permettre au système d’intégrer les informations locales au niveau global. Des études ont, dès lors,
montrées que les cellules de position déchargent pendant des oscillations spécifiques générées dans
l’hippocampe, appelé rythme thêta (O’Keefe & Recce 1993/).
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 5
Figure 1.1 : Phénomène de précession
de phase observé chez le rat.
Au fur et à mesure que le rat traverse un
champ de lieu donné, on observe un
décalage de phase entre l’occurrence des
potentiels d’actions de la cellule de lieu
associée et la phase du rythme thêta.
Lorsque le rat pénètre le champ de lieu,
les cellules déchargent au pic de thêta,
alors qu’elles déchargent au creux de
thêta lorsque l’animal quitte le champ de
lieu. Ce phénomène permet d’extraire la
position exacte de l’animal dans un champ
de lieu donné.
	
   Rythme	
  thêta	
  hippocampique	
  
Description
Le rythme thêta est une oscillation rythmique de l’électroencéphalogramme (EEG) dans la bande de
fréquence 4-10 Hz, généralement stable sur une dizaine de périodes, observé de manière proéminente
chez le rat et de nombreuses espèces de mammifères, dont l’homme. Deux profils oscillatoires distincts
ont été décrits : le rythme thêta hippocampique et le rythme thêta cortical. Le premier est enregistré
dans l’hippocampe et ses structures adjacentes (cortex entorhinal, subiculum, septum) et correspond à
une bande de fréquence haute (6-10 Hz) et une forte amplitude. Plus précisément, l’activité thêta est
enregistrée dans CA1, CA3, le gyrus denté (Fox et al., 1986), le subiculum (Buzsaki et al., 1986,
Buzsaki et al., 1985) et le cortex entorhinal (Alonso & Garcia-Austt, 1987a, Alonso & Garcia-Austt,
1987b), avec en général un déphasage d’une aire à la suivante. Dans le cortex entorhinal les couches
superficielles et profondes oscillent en opposition de phase (Alonso & Garcia-Austt, 1987a, Alonso &
Garcia-Austt, 1987b, Mitchell & Ranck, 1980). Dans l’hippocampe l’oscillation est synchrone suivant
l’axe longitudinal (Bullock et al ., 1990). Le second est une oscillation basse fréquence (4-7Hz)
d’amplitude modérée, observé chez le primate au moyen d’un EEG de surface et associée à des états
de somnolence ou de sommeil ou lors de tâches de mémoire de travail [Wang 2010]. A ce jour, il
n’existe pas de preuve d’un lien quelconque entre les deux types de thêta (hippocampique et cortical).
Figure 1.2 : Rythme thêta enregistré chez l’animal en EEG intracrânien. L’épisode de thêta est caractérisé par de fortes
amplitudes sur de multiples canaux. Il dure entre dix et quinze périodes en moyenne (1 à 2 secondes).
6 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
Corrélats comportementaux
On distingue deux types de rythmes thêta dans l’hippocampe: le thêta de type 1, correspond au
mouvement volontaire et aux phases de sommeil paradoxal. Le thêta de type 2 est lui rarement observé
lorsque le rat est éveillé (éventuellement en présence d’un prédateur lorsque le rat immobile prépare un
mouvement de fuite) et plus couramment sous anesthésie à l’uréthane. Ce type de thêta peut être
supprimé par injection d’atropine suggérant que les mécanismes de génération de deux types diffèrent.
De manière générale, les épisodes de rythme thêta sont conjoints à une activité locomotrice (marche,
course, saut), à des comportements d’exploration de l’environnement (reniflement) ou aux phases de
sommeil paradoxal (REM sleep) (Vanderwolf, 1969). En revanche, lorsque le rat mange, dort ou fait sa
toilette, l’hippocampe montre un profil oscillatoire irrégulier de large amplitude (Large Irregular Activity). .
Chez le rat, le rythme est verrouillé sur la phase des reniflements et le mouvement des vibrisses, bien
que le déphasage puisse dériver au cours du temps (Komisaruk, 1970), bien que des résultats plus
récents remettent en question la validité de ce verrouillage de phase. On observe une augmentation de
la fréquence des oscillations thêta avec la vitesse de l’animal. Enfin, on observe un verrouillage de
phase entre régions distantes du cerveau (hippocampe et cortex préfrontal) lorsque l’animal réalise des
tâches de mémorisation spatiale (Benchenane, 2009).
Génération
Les mécanismes de génération et modulation d’amplitude du rythme thêta ne sont pas encore connus
en détail. Deux hypothèses principales non-exclusives sont avancées pour expliquer la génération du
rythme : l’activation de certaines zones spécifiques permet fait émerger les oscillations du réseau
(hypothèse permissive) ou une structure donné fournit une oscillation assez puissante et rythmique qui
se propage au réseau (hypothèse de ‘l’effet pacemaker’) (Buzsaki, 2002). Les lésions du septum et du
cortex entorhinal bloquent spécifiquement la génération du rythme thêta, il a été proposé que la mise
en place de ce dernier résulte d’une alternance répétée entre inhibition provenant du septum et
excitation provenant du cortex entorhinal (Pignatelli, Review, 2011).
Certains éléments du mécanisme de l’activité thêta sont communément admis. Le rôle du septum dans
le contrôle de l’activité thêta hippocampique est solidement établi. Le thêta septal et hippocampique
apparaissent simultanément in vivo et sont verrouillés en phase. De plus, les études de stimulation et
ablation ont montré que le septum est nécessaire pour l’apparition de ce rythme, même si l’activation
d’autres aires telles que la formation réticulaire mésencéphalique est corrélée au thêta hippocampique
chez certaines espèces (Vertes, 1982).
Les cellules principales et des interneurones montrent une activité synchrone en opposition de phase
pendant l’activité thêta (Buzsaki, 1986). Leurs potentiels membranaires présentent des oscillations, qui
mènent à une décharge à chaque cycle pour les interneurones et moins souvent pour les cellules
principales (Nunezet, 1987). L’activité des interneurones augmente pendant les épisodes thêta, tandis
que l’activité moyenne des pyramidales est réduite. Les oscillations du potentiel membranaires des
cellules pyramidales semblent dues en partie à des séries de PPSI (Leung & Yim, 1986). Ces deux
actions peuvent être dues aux deux types de fibres septo-hippocampiques. Les fibres cholinergiques
activant des récepteurs muscariniques produiront une excitation lente, tandis que les fibres
GABAergiques inhiberont rythmiquement des interneurones hippocampiques, produisant une
désinhibition des cellules pyramidales (Freund & Antal, 1988). De plus, l’activation des récepteurs
muscariniques peut, à elle seule, provoquer des oscillations du potentiel membranaire dans certains
interneurones (Parra, 1998).
Fonction
La fonction principale du rythme thêta n’a pas été établie de manière définitive. Trois hypothèses
principales sont proposées. Il pourrait jouer un rôle dans le codage fin de la position de l’animal dans
son environnement (O’Keefe & Burgess 2005, Buzsaki 2005). Autrement, il pourrait jouer un rôle dans
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 7
la mémoire et l’apprentissage de tâches spatiales (Hasselmo, 2005). Enfin, il pourrait être crucial dans
l’intégration des informations sensori-motrices (Vanderwolf 1969, Bland & Oddie, 2001).
Les cellules de position, qui sont actives spécifiquement lorsque l’animal se trouve en certains endroits,
déchargent pendant le thêta. Le déphasage entre le rythme thêta et l’activité d’une cellule varie pendant
que l’animal s’approche, traverse et quitte son champ de position. Ces observations ont mené à la
théorie que le rythme thêta participe à la formation et au stockage d’une carte spatiale permettant la
navigation (O'Keefe & Recce, 1993). Il pourrait avoir une fonction d’horloge de référence afin de coder
précisément la position de l’animal dans son environnement et de permettre de transcrire les
informations locales au niveau global du réseau de navigation spatiale (Battaglia, 2011).
Il est important pour la mémoire spatiale, à la fois dans l’encodage et dans la récupération d’information.
De plus, on observe une forte synchronisation (pic de cohérence) entre hippocampe et cortex préfontal
lorsque l’animal doit faire un choix dans une tâche dirigée vers un but (Benchenane, 2010). Il a de plus
été démontré que l’émergence d’un rythme favorise la communication entre régions géographiquement
éloignées et pourrait donc sous-tendre la récupération d’informations au moment de la prise de décision
(Womelsdorf, 2007).
Enfin, certains auteurs attachent au rythme thêta un rôle majeur dans l’intégration des données sensori-
motrices : il a été démontré que le démarrage des épisodes de thêta a lieu plusieurs centaines de
millisecondes avant le déclenchement du mouvement. Ceci expliquerait l’occurrence du thêta quand
l’animal prépare une séquence de mouvement sans pour autant l’initier. Certains modèles d’intégration
sensori-motrice imputent un rôle majeur au rythme thêta pour coordonner les entrées motrices à la
planification de séquence de mouvement.
Tous ces éléments montrent une implication du rythme thêta hippocampique dans la navigation spatiale.
Néanmoins, beaucoup d’inconnus subsistent, notamment l’ensemble du réseau, ainsi que les
interactions entre les différents sous-réseaux, impliqués lors de la navigation spatiale, et ce, par
manque d’outils. Toutefois, une toute nouvelle méthode d’imagerie a été récemment mise en point et
pourrait apporter des informations cruciales à la compréhension du processus de la navigation spatiale.
Imagerie	
  ultrasonore	
  fonctionnelle	
  (fUS)	
  
L’imagerie ultrasonore fonctionnelle (fUS) est une nouvelle technique d’imagerie adaptée de
l’échographie, mise au point il y a une dizaine d’années par des chercheurs de l’institut Langevin
(Mickaël Tanter & Mathias Fink). Cette dernière permet d’imager avec une très forte sensitivité les
transitions rapides du volume sanguin et du débit sanguin dans le cerveau. La résolution spatio-
temporelle est comparable sinon meilleure aux techniques actuelles d’imagerie fonctionnelle.
Principe	
  de	
  l’échographie-­‐Doppler	
  classique	
  
L’échographie permet de sonder les propriétés d’un milieu, et a fortiori d’un milieu biologique, à l’aide
d’ondes ultrasonores dont la fréquence varie entre 1 MHz et 100 MHz dans le cas des applications
médicales. Ses principaux avantages résident dans le fait qu’il s’agit d’une technique non-invasive,
relativement peu coûteuse, réalisée à l’aide de sondes portatives sur des périodes prolongées et
présentant une haute résolution temporelle. L’onde ultrasonore est générée par un transducteur piézo-
électrique, dont le rôle est de convertir un signal électrique en onde acoustique et inversement.
Lorsque le train d’ondes généré traverse une interface dans le milieu se produit un phénomène d’écho :
une partie de l’onde est réfractée à travers l’interface alors qu’une autre partie est réfléchie. C’est
l’amplitude et le retard de cette onde réfléchie qui permet de reconstruire une image de la structure du
milieu. Il s’agit donc d’une méthode d’imagerie purement structurelle.
8 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
L’imagerie Doppler classique est basée sur l’effet Doppler-Fizeau qui permet d’évaluer la vitesse d’une
particule en mouvement entre l’émission et la réception d’un train d’ondes. Elle est utilisée ici pour
calculer le flux sanguin cérébral, en évaluant la vitesse de déplacement des globules rouges. Il est
démontré que la fréquence de l’onde réfléchie, dite fréquence Doppler fd, renvoyée par un globule
rouge se déplaçant à la vitesse v dans un champ ultrasonore de fréquence fus est donnée par la formule
suivante:
Dans le cas de l’imagerie du flux sanguin cérébral, les vitesses considérées sont comprises entre 5
mm.s-1 à 2 cm.s-1 pour les petits vaisseaux (capillaires et artérioles) et peuvent atteindre 40 cm.s-1 pour
les plus gros vaisseaux. Ainsi, imager un flux sanguin de 2 cm.s-1 à l’aide d’une sonde émettant à 15
MHz, requiert une fréquence Doppler de 400 MHz, ce qui impose une fréquence d’acquisition
supérieure à 800 MHz pour obtenir une échantillonnage correct du signal (théorème de Shannon).
Cette méthode nécessite donc une cadence d’acquisition particulièrement élevée. Par ailleurs, on
rencontre un problème d’échogénéicité (le sang n’ayant pas le même degré d’échogénéicité que les
tissus environnants), qui résulte en une perte de signal et l’apparition d’une intensité Doppler minimale.
Le rapport signal/bruit peut cependant être amélioré en répétant l’acquisition du signal un grand nombre
de fois, mais l’imagerie Doppler classique utilise des faisceaux ultrasonores focalisés à une profondeur
donnée, nécessitant de changer la focalisation pour chaque ligne de l’image finale. Ainsi, la résolution
temporelle est limitée par le temps de propagation aller-retour des ultrasons et la cadence d’acquisition
imposée pour imager les gros flux sanguins est trop grande.
Ultrafast	
  Doppler	
  Compound	
  
L’Ultrafast Doppler Compound permet de résoudre ces deux problèmes : grande cadence d’acquisition
et grand rapport signal sur bruit. Cette technique a été rendue possible par l’émergence d’échographes
ultrarapides (pouvant acquérir jusqu'à 10 000 images / seconde) et repose sur deux concepts
fondamentaux:
• l’utilisation d’ondes planes non focalisées à l’émission, envoyées avec différents angles par
rapport au plan à imager.
• le groupement des images acquises selon les différents angles afin de former une image
composite (compound) dotée d’un rapport signal/bruit plus important.
L’utilisation d’ondes non focalisées à l’émission et focalisées à la réception permet d’augmenter
considérablement la cadence d’acquisition, car on n’envoie plus qu’un train d’ondes ultrasonores planes
là où il était nécessaire d’en envoyer un pour chaque ligne de l’image. Cependant, l’utilisation d’ondes
planes entraîne une diminution considérable de la puissance d’émission et donc un rapport signal sur
bruit et une résolution faibles. Or, il a été démontré que la sommation des différentes images obtenues
avec les différents angles entre le transducteur et le plan à imager permettait d’augmenter
considérablement le rapport signal sur bruit (on suppose que seul le bruit change entre 10 images
proches i.e. 1ms).
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 9
Ainsi, pour une profondeur d’imagerie de 3 cm et l’utilisation de 10 angles, on est maintenant capable
d’imager à une cadence de 2,5 kHz ce qui est largement suffisant pour imager le flux sanguin, y
compris dans les plus petits vaisseaux. De plus, cette technique permet de privilégier, en fonction du
flux que l’on souhaite imager, soit une acquisition très rapide dont la qualité de l’image sera faible en
réduisant le nombre d’angles utilisés, soit une grande qualité d’image au détriment de la vitesse
d’acquisition, en augmentant le nombre d’angles utilisés. A titre d’exemple, l’utilisation de 17 angles
d’imagerie permet d’imager à une cadence de 1 kHz et de réaliser une angiographie du cerveau de rat,
avec une sensibilité jusqu’à vingt-quatre fois supérieure à celle obtenue en imagerie Doppler classique
(Macé,2011).
Lien	
  avec	
  les	
  grandeurs	
  hémodynamiques	
  
Cette nouvelle technique d’imagerie nous permet d’obtenir pour chaque pixel de l’image un signal
Doppler du sang sb(t). La transformée de Fourier de ce signal contient deux types d’information : l’une
donnée par la fréquence moyenne est reliée à la vitesse des globules rouges (voir formule 1), qui est
donc une mesure directe du flux sanguin cérébral (CBF), la seconde donnée par l’amplitude du signal
intégré sur le temps est reliée à la quantité de globules rouges, donc au volume sanguin cérébral
(CBV). En effet, si l’on considère un pixel de l’image traversé par un capillaire sanguin, l’onde
ultrasonore envoyée va générer un écho sur chacun des N globules rouges se trouvant dans ce pixel.
On démontre que la fréquence de l’onde réfléchie est proportionnelle au flux sanguin (cette fréquence
sera d’autant plus importante que les globules rouges se déplacent vite) et que l’amplitude de l’onde
réfléchie est proportionnelle au nombre de globules rouges compris dans le pixel étudié et reflète donc
le volume sanguin (plus le nombre de globules rouges est grand, plus l’écho est important). En réalité,
le signal sb(t) est proportionnel à √N et c’est l’intégrale temporelle du signal sb(t) élevé au carré qui est
donc proportionnel à N. De plus, on suppose que la densité de globules rouges est constante dans
l’ensemble des vaisseaux cérébraux, pour obtenir un signal proportionnel au volume sanguin cérébral).
Figure 1.3 : Imagerie Doppler Ultra-Fast
Compound (UFDC)
L’UFDC utilise une onde plane à l’émission
et focalisée à la réception ce qui permet de
n’acquérir qu’une image là où on devait
imager toutes les lignes formant l’image en
imagerie Doppler classique (a). On acquiert
cette image pour différents angles entre le
plan de l’onde et le plan à imager (b) ce qui
forme une image composée (c). Une image
composée est obtenue en 1 ms ce qui
permet de répéter l’acquisition jusqu’à 200
fois afin d’augmenter le rapport signal sur
bruit (d). Chaque point de l’image est
ensuite traité par un filtre passe-haut afin de
supprimer les artefacts dus aux événements
basse fréquence tels que la respiration ou le
battement cardiaque pour ne laisser
apparaître que le signal correspondant au
flux sanguin. L’intégrale de ce signal sur
l’ensemble du temps d’acquisition permet
alors d’obtenir l’image finale (e) qui présente
une résolution spatiale bien plus élevée que
celle de l’imagerie Doppler classique.
10 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
On obtient donc deux modalités d’imagerie le Doppler de fréquence qui mesure le flux sanguin et le
Doppler d’intensité qui mesure le volume sanguin. Dans la suite de notre rapport, nous présenterons
nos résultats seulement pour le Doppler d’intensité, qui est une mesure plus précise que la précédente.
Enfin, il convient de rappeler que le lien entre l’activité neurale mesurée par le potentiel de champ local
(LFP) ou les enregistrements multi-unitaires (MUA) est complexe. La réponse hémodynamique
supposée est que l’activation d’une assemblée cellulaire se traduit par un certain nombre de potentiels
d’actions qui consomment les ressources locales, déclenchant en réaction un afflux de sang par
dilatation des vaisseaux (gros vaisseaux en amont et capillaires a proximité) résultant en une
augmentation du volume sanguin. Cependant, des résultats futurs sont nécessaires afin de valider cette
hypothèse. Le lien avec le BOLD est aussi complexe mais il apparaît que la latence des réponses
enregistrées ici serait de l’ordre de la seconde.
Résultats	
  chez	
  l’animal	
  anesthésié	
  
L’imagerie ultrasonore fonctionnelle (fUS) a été mise au point sur le rat anesthésié. Après avoir opéré
une craniotomie, la sonde ultrasonore est placée au dessus de la dure-mère. Un gel permet de combler
l’espace entre le cerveau et la sonde afin de faciliter le transport des ondes ultrasonores. La figure #
reproduit les résultats obtenus : le Doppler d’intensité reflète les activations dans le cortex en tonneaux
d’une rangée de vibrisses, stimulées de manière répétée pendant 30s puis relâchées pendant 1mn.
Ces activations fonctionnelles corrèlent très fortement avec la stimulation mécanique, et ce même pour
la stimulation d’une seule vibrisse (figure C). D’autres résultats ont été présentés chez le rat présentant
des crises épileptiques après injection focale de kaïnate.
Figure 1.4 : Différentes modalités
d’imagerie en technologie UFDC.
Pour chaque pixel de l’image, on récupère
un signal temporel sb(t) correspondant à la
somme des échos de chacun des globules
rouges se trouvant dans ce pixel. La
transformée de Fourier de ce signal conduit
alors à deux types d’informations : une
information d’amplitude liée à la quantité de
globules rouge se trouvant dans le pixel,
donc, si l’on suppose la concentration en
globules rouges constante, au volume
sanguin cérébral (A), et une autre
information fréquentielle, peu précise,
directement liée à la vitesse des globules
rouges donc au flux sanguin cérébral (B).
Figure 1.5 : Activations fonctionnelles fUS chez le rat anesthésié.
(A) Stimulations répétées d’une rangée de vibrisse alternant 30 secondes de stimulation et 1mn de repos (B) Activation
fonctionnelle obtenue pendant stimulation dans la condition A. Le cortex en tonneau et le relais thalamique sont fortement
activés (C) Activation fonctionnelle pour une vibrisse seule. On observe la disparition de l’activation thalamique précédente.
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 11
Vers	
  l’imagerie	
  ultrasonore	
  mobile	
  
Ces résultats ont été mis au point chez le rat anesthésié. Il est probable que l’anesthésie gazeuse
utilisée (isoflurane) joue un rôle suppresseur de l’activité de fond chez l’animal éveillé. Le poids et les
dimensions de la sonde permettent d’envisager un protocole d’imagerie fonctionnelle chez le rat mobile.
Cette approche nécessite un développement technique important (fixation de la sonde, minimisation de
l’entrave au mouvement naturel) mais permettrait de recueillir d’importants résultats non seulement
dans l’étude de l’activité globale du cerveau dans la locomotion, leur lien avec les rythmes observés à
l’EEG ou dans la comparaison avec les données existantes chez le rat anesthésié afin de mieux
comprendre les effets de l’anesthésie et son rôle dans la propagation des crises d’épilepsie.
Figure 1.6 Comparaison Imagerie par Résonance Magnétique petit animal et Imagerie ultrasonore fonctionnelle
(fUS)
12 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
Problématique
L’objectif de ce projet de Master est de mieux comprendre les interactions entre le système limbique et
les aires corticales dans le processus de navigation spatiale en utilisant l’imagerie fUS combiné à
l’électroencéphalogramme (EEG). L’EEG permettra d’identifier les périodes durant lesquelles les
rythmes thêta hippocampique seront générés et, ainsi, les corréler à l’imagerie fUS afin d’observer les
régions impliquées lors de ces rythmes.
Le but était de développer et évaluer l’imagerie fUS su l’animal mobile pour mieux comprendre les
interactions entres le système limbique et les aires corticales dans les processus de navigation spatiale.
Notamment, ce projet repose à la fois sur l’acquisition d’outils expérimentaux (chirurgie), un
développement technique majeur (mise en place d’un protocole d’acquisition d’images de qualité sur
l’animal en mouvement et sur la confrontation de techniques de mesure différentes (EEG et imagerie
ultrasonore fonctionnelle.
L’objet d’étude choisi ici est la navigation spatiale et le projet est particulièrement centré sur le
phénomène de thêta hippocampique. L’axe principal de notre étude est la recherche de régions dont
l’activation observable en imagerie ultrasonore est significativement reliée au thêta. Si elles existent,
nous cherchons à examiner en quoi ces interactions nous permettent de mieux comprendre le
phénomène de navigation spatiale et l’implication des différentes régions dans les oscillations
observées à l’EEG.
Ce projet présentant une part d’incertain lié au développement technique nécessaire au protocole
d’imagerie mobile, nous avons axé notre travail sur trois directions de recherche. La première partie du
projet traite de la navigation spatiale chez le rat sans imagerie mobile. Nous avons mis en place un
protocole d’enregistrement nous permettant d’étudier les relations entre de nombreux paramètres
lorsque le rat entre dans un processus de navigation spatiale (direction de la tête, vitesse, accélération)
afin de préparer l’étude en imagerie mobile. La deuxième partie du projet consiste à présenter et
analyser statistiquement les données d’imagerie entre la condition anesthésiée et éveillée. L’imagerie
ultrasonore fonctionnelle n’a jusqu’à alors été utilisée que sur des rats anesthésiés subissant par
exemple la répétition d’une activation fonctionnelle telle que la stimulation des vibrisses. Il est crucial
pour la suite du projet de bien connaître les fluctuations temporelles du signal fUS dans les différentes
régions du cerveau lorsque l’animal est mobile. La dernière partie du projet montre les corrélations
fonctionnelles entre les activations observées en fUS et les paramètres de la navigation spatiale étudiés
dans la première partie, en examinant à la fois le signal fUS de chaque voxel individuel d’une part et le
signal moyenné sur une certaine région d’autre part (hippocampe gauche par exemple). Cette
démarche nous permet ainsi de présenter des auto-corrélogrammes de régions pour différentes régions
ainsi que des cartes d’activation par pixel.
Il est important de souligner que ce projet a nécessité une part importante de développement technique
et d’acquisition d’outils expérimentaux. Il s’agit d’un travail de recherche sur une technique nouvelle
amené à être poursuivi et enrichi. Il nous a paru particulièrement important d’insérer ce développement
dans une démarche scientifique cohérente.
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 13
Figure 2.1 : Vues transversales de la
tête de l’animal avant et après la
phase de craniotomie
(A) Après incision les soudures
principales sont visibles. Le volet est
percé entre le bregma et le lambda. (B)
Après ouverture, quatre vis de
consolidation sont posées. Deux d’entre
elles sont reliées à la masse. Du ciment
dentaire recouvre la partie dorsale et sert
de point de fixation pour les électrodes.
Démarche et méthodes
Développement	
  technique	
  
L’imagerie ultrasonore fonctionnelle a été testée est mise au point sur des animaux anesthésiés dont la
tête est fixée dans un cadre stéréotaxique. La sonde est immobile fixée dans un bras du cadre, de sorte
que les artefacts liés au mouvement involontaire de l’animal (réflexes, tremblements) sont inexistants. Il
convient juste de filtrer les basses fréquences correspondant à la respiration et aux pulsations cardio-
vasculaires. Dans le cadre de l’imagerie mobile, trois problèmes majeurs apparaissent nécessitant un
développement technique important afin d’obtenir des images de qualité : adapter la chirurgie, fixer la
sonde sur la tête de l’animal en mouvement et limiter l’entrave au mouvement naturel de l’animal. Nous
présentons plus bas les méthodes mises en œuvre afin de surmonter ces contraintes.
Chirurgie	
  
Les ondes ultrasonores utilisées par la méthode fUS sont fortement diffractées par la paroi osseuse
(ceci est dû aux nombreux vaisseaux sanguins qui la traverse), il est nécessaire d’ouvrir un volet
crânien adapté la taille de la sonde, afin de permettre le passage des ultrasons. A terme, le volet est
recouvert par un matériau perméable aux ultrasons afin que l’animal reprenne un fonctionnement
normal dans la période post-opératoire. Le traumatisme lié à l’opération est bénin et disparaît au bout
de quelques jours ; de plus, il n’entraîne pas de déficit cognitif visible jusqu’à 6 semaines après
l’opération (sur 30 rats opérés). Hormis cette opération, la méthode d’imagerie n’est pas invasive car la
sonde est maintenue à la surface du cerveau sans contact avec les méninges qui ne sont pas altérées.
On réfère ainsi à la méthode comme minimalement invasive. La chirurgie complète se déroule en trois
étapes : la craniotomie, la pose d’électrodes par stéréotaxie et le recouvrement du volet. La durée
moyenne de l’intervention et de 6 jours et une période de recouvrement de 3 est respectée avant de
procéder aux enregistrements.
Craniotomie
L’animal est endormi puis maintenu par anesthésie gazeuse à l’isoflurane (Vetflurane). Durant toute la
durée de la chirurgie, l’animal est maintenu dans un cadre stéréotaxique, la tête maintenue par des
barres d’oreilles. Sa température est maintenue entre 36°C et 37°C par un tapis chauffant. Le débit
d’isoflurane est maintenu entre 1,5g.L-1 et 2.0g.L-1. Le débit d’air est d’oxygène sont respectivement de
0.3 et 0.2g.L-1. Après injection locale de lidocaïne (Xylovet), anesthésique local bloquant des canaux
sodiques, on effectue une incision dans le plan sagittal. Les muscles et fibres au contact du crâne sont
ensuite écartés sur les côtés, puis un volet est ouvert en perçant l’os. Les dimensions du volet sont de 5
mm selon l’axe sagittal, 10 mm selon l’axe coronal et 3 à 5 mm selon l’axe dorso-ventral (figure 2.1). Le
volet osseux est retiré à l’aide de pinces en veillant à ne pas percer le sinus veineux pour éviter une
hémorragie importante. On laisse ensuite le cerveau reposer dans un mélange sérum physiologique et
de Bétadine.
14 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
Figure 2.2 : Stéréotaxie
(A) Coordonnées initiales
d’implantation. Les coordonnées
exactes sont déduites de la distance
bregma-lambda (B) Schéma de
l’implantation d’une triode. La flèche
désigne le point de section, après
implantation de la triode (C) Vue
transversale de l’animal après
stéréotaxie puis consolidation par pose
de ciment dentaire (D).
Stéréotaxie
L’étape suivante consiste à implanter des électrodes dans la région CA1 l’hippocampe dorsal, où les
oscillations thêta présentent une amplitude forte. Les rats implantés sont des mâles Sprague Dawley
dont l’âge est compris entre 8 et 10 semaines (l’âge adulte est atteint au bout de 13-15 semaines). Les
coordonnées d’implantation sont dépendantes de l’âge du rat. En pratique, on mesure la distance entre
les deux soudures principales du crâne (distance Bregma-Lambda), puis on calcule les coordonnées
corrigées d’implantation de CA1. Les électrodes utilisées sont des fils de tungstène (diamètre 100µm).
Trois électrodes sont implantées dans chaque hippocampe à des profondeurs différentes espacées de
0.5 à 1 mm. Ces trois électrodes sont enfilées dans un tube en inox (diamètres interne/externe
300µm/500 µm) pour former une triode. L’absence d’os à proximité du site d’implantation nécessite de
donner une forme coudée à chacune des triodes afin de créer un point de fixation sur l’os. On utilise
ensuite du ciment dentaire pour fixer les triodes à l’extrémité dorsale du volet crânien. On implante de
plus une électrode de référence dans le cortex et une électrode de masse à la fois dans le cervelet et
dans le cortex préfrontal.
Recouvrement du volet
Cette étape est critique pour obtenir de bons résultats. Les contraintes sont ici de trois types :
- Stabilité et de perméabilité
Le volet crânien doit être recouvert par un chapeau fixe afin de permettre de placer la sonde. Il est
crucial que ce chapeau soit perméable pour retrouver une forme d’homéostasie après la craniotomie.
- Intégrité physique du rat
Si certaines réactions sont inévitables (destruction des cellules à proximité des électrodes, formation de
tissu cicatriciel) et s’accentuent avec le temps, il est crucial de ne pas utiliser de matériaux qui créent
facilitent les inflammations. Il convient donc d’en vérifier la biocompatibilité, afin de ne pas provoquer de
traumatisme pouvant causer des déficits cognitifs.
- Qualité d’imagerie
Les matériaux utilisés doivent avoir une bonne perméabilité aux ultrasons (homogénéité, non-
echogénéicité) et il est crucial de ne pas piéger de bulles d’air entre le cerveau et le chapeau, celles-ci
empêchent la propagation des ultrasons et créent des zones d’ombre sur l’image.
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 15
Figure 2.3 : Recouvrement du
volet
(A) Après la stéréotaxie, des vis de
fixation sont mises en place. Les
muscles sont maintenus sur les
cotés du volet par des pièces de
plastique. (B) On applique ensuite
une feuille de PVC et l’on comble
par un bain de sérum physiologique
et bétadine. Des écrous sont
ensuite placés pour recevoir le
micro-manipulateur.
La technique actuelle consiste à utiliser une feuille de polychlorure de vinyle (PVC) pour recouvrir le
volet crânien. On comble l’espace entre la feuille de PVC et les méninges par un mélange de sérum
physiologique et de bétadine, afin de ne pas enflammer les méninges. Des vis sont percées dans le
crâne (deux à l’avant, deux à l’arrière) afin de créer des points d’ancrage. Du ciment dentaire est
ensuite coulé sur l’os, les vis et la feuille de PVC, après avoir convenablement séché les surfaces afin
d’assurer une bonne adhérence. On coule ensuite du ciment dans les interstices au dessus de la feuille
de PVC afin de garantir l’étanchéité du montage. A la fin de la procédure, le cerveau est visible à
travers la feuille de plastique est le ciment dentaire recouvre toutes les surfaces qui ne se trouvent pas
sur le trajet du faisceau d’ultrasons.
Fixation de la sonde
Le développement technique majeur de ce projet est de mettre en place un système permettant de fixer
la sonde ultrasonore sur la tête du rat. Pour l’animal anesthésié de telles contraintes ne se posent pas,
les mouvements parasites étant relativement on obtient des images de très bonne résolution avec très
peu de bruit. Cependant, lorsque l’animal se déplace, de nombreux artefacts apparaissent : artefacts
mécaniques liés au mouvement (mouvement brusque, chocs mécaniques), artefacts électriques
(déformation du champ électrique, électricité statique), écoulement du gel, déplacement de la sonde,
apparition de bulles.
Afin de limiter les artéfacts mécaniques, nous avons mis en place un système de fixation vissé de la
sonde sur la tête de l’animal. Un moule de la sonde est utilisé et trois écrous sont fixés sur la tête de
l’animal. Les positions de ces écrous peuvent légèrement varier d’un animal à l’autre. On visse ensuite
sur ces trois écrous une platine fixe qui supporte un micromanipulateur. Ce dernier permet non
seulement de fixer la sonde solidement et d’en supprimer les mouvements parasites, mais surtout de
translater la sonde dans le antéro-postérieur, permettant ainsi de réaliser de multiples coupes coronales.
Ce dispositif permet d’acquérir de nombreuses images du cerveau selon plusieurs plans, augmentant
ainsi la probabilité d’observer un grand nombre de structures et permet de reconstituer les images en
3D.
Lors des épisodes d’enregistrements, le micromanipulateur est vissé sur la tête du rat puis la sonde
ultrasonore est y insérée et maintenue par des vis. Il convient de placer la sonde la plus basse possible
afin que l’espace entre la sonde et la feuille de PVC soit le plus réduit possible. On comblera ensuite cet
espace par du gel de conduction ultrasonore.
16 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
Figure 2.4 : Fixation de la sonde
La dernière phase de l’opération consiste à fixer des écrous
destiner a supporter un micromanipulateur (A). Cette pièce en
plexiglas est composée d’une platine fixée sur la tête de l’animal et
d’une partie supérieure permettant d’ajuster le plan d’imagerie
selon l’axe antéro-postérieur (B). La sonde est ensuite vissée à la
partie supérieure, alors que le rat est anesthésié sous isoflurane
(C). Le bilan final de l’opération consiste à avoir la sonde sur un
plan fixe afin de bénéficier d’une image de qualité tout en
permettant à l’animal d’avoir un comportement normal.
L’animal doit pouvoir se déplacer sans que la contrainte imposée par le micromanipulateur et le
connecteur EEG ne soit trop importante. Actuellement, le poids de la sonde mais surtout la rigidité des
câbles imposent de fortes contraintes mécaniques sur la tête du rat. Celui-ci se déplace en ayant la tête
légèrement surélevée par rapport à sa marche normale. Il lui est possible de pouvoir tourner la tête,
sans pouvoir toutefois effectuer un tour complet sur lui même. Ceci est minimisé lorsque
l’expérimentateur porte le câble de la sonde en faisant contrepoids et suit le mouvement naturel de
l’animal.
Protocole	
  d’enregistrement	
  
Acquisition des épisodes de thêta
Bien que proéminent chez le rat, le rythme thêta n’est pas l’oscillation sur l’EEG hippocampique du rat.
Celui-ci est dominée par une large activité irrégulière (LIA) ou par des oscillations rapides (dans la
bande gamma) lorsque le rat mange et fait sa toilette. Cependant, la mobilité apparaît comme une
condition nécessaire à l’apparition du thêta [réf]. Le rat est donc soumis à une privation bénigne de
nourriture et d’eau (6 heures précédant l’enregistrement), puis installé sur une planche linéaire (120x20
cm), au bout de laquelle se trouve un peu de nourriture. Après quelques répétitions le rat marche
naturellement d’un bout à l’autre de la planche.
De nombreux artefacts électriques lorsque l’environnement est confiné (cage, murs). Ceci est dû aux
charges statiques qui se déposent sur les parois et créent des interférences à l’EEG. L’impédance des
électrodes implantées dans l’hippocampe étant assez haute, de faibles courants peuvent générer des
différences de potentiels importantes. En conséquence, il convient de mettre tous les porteurs de
charges à la masse (le bon contact de l’électrode de masse implantée dans le crâne étant crucial). Le
préamplificateur doit aussi être placé très proche de la tête, car les courants sortant de la tête de
l’animal sont très faibles et donc particulièrement sensibles aux fluctuations du champ
électromagnétique de la pièce pouvant générer des courants induits. Le pré-amplificateur amplifie le
signal à sa sortie, rendant négligeable l’effet des courants induits [réf].
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 17
Figure 2.5 : Schéma du protocole
d’enregistrements synchronisés
fUS-vidéo-EEG
Figure 2.6 : Programme
d’acquisition et d’analyse des
signaux synchronisés
Système de synchronisation EEG-vidéo-fUS
Nous avons développé un programme permettant d’acquérir de manière synchronisée les données
vidéo, EEG et fUS. Le signal vidéo est acquis par une webcam placée en hauteur placée en hauteur de
manière à inclure la totalité de la planche dans le champ visuel. Le signal EEG est d’abord pré-amplifié
(deux options sont possibles : fixer le pré-amplificateur sur la tête de l’animal ou utiliser un câble blindé
reliant le pré-amplificateur en position fixe au connecteur placé sur la tête de l’animal) puis le signal
différentiel (différence entre électrodes placées dans l’hippocampe et référence) est amplifié puis
numérisé pour être traité par le programme. Le programme lui-même est écrit en LabView.
Différentes fonctionnalités sont implémentées notamment un certain nombre de filtres (passe-bas,
coupe-bande, passe-bande). Le signal fUS est traité par une autre machine, mais un canal permet la
synchronisation des images fUS aux données EEG en envoyant un ‘bip’ appelé trigger à l’initiation de
chaque image.
Différents modes d’imagerie
Le signal fUS est acquis par la sonde est traité par un ordinateur indépendant. Actuellement, la
limitation principale est le temps de traitement des données (une image composite est formée à partir
de 1400 jusqu’à 4000 images intermédiaires). Le stockage des données et leur transfert doivent être
assez rapides pour permettre d’accumuler un grand nombre d’images sur une période prolongée.
On utilise deux modes d’imagerie. Le premier consiste à imager en continu, c’est-à-dire à enregistrer
les images intermédiaires (pendant 200ms) puis à former l’image composite correspondant à cette
18 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
période. En fonction de la qualité de l’image formée (nombre d’angles utilisés, résolution), on peut
obtenir entre 1 image toutes les 2 à 5 secondes pendant une période prolongée (plusieurs centaines
d’images correspondant à 30-40 minutes d’enregistrement). Le deuxième mode est plus rapide est
permet de retarder le calcul des images finales en stockant les données prétraitées dans un espace
intermédiaire. On peut ainsi enregistrer des séquences de 30 secondes à 1 minute à une cadence de 1
image toutes les 0.8 secondes. Le temps de traitement est ensuite compris entre 5 et 10 minutes en
fonction de la qualité des images.
Ces deux modes d’imagerie sont utilisés pour acquérir différents types de données. Les épisodes de
thêta étant courts (quelques secondes), nous utilisons majoritairement le mode rapide qui nous permet
d’acquérir un grand nombre d’images pendant des périodes réduites. Cette résolution temporelle nous
permet ainsi d’étudier plus finement les transitions (début, arrêt) de ces épisodes et nous permet d’avoir
plus d’images pour les phénomènes rapides. . Le mode continu est utilisé pour obtenir des activations
sur une durée prolongée (effets de l’anesthésie, sommeil) lorsqu’il est pertinent de pouvoir faire des
moyennes, ou du moins lorsque l’information est contenue dans des intervalles de temps prolongés.
Analyse	
  du	
  signal	
  
Détection du mouvement du rat
La planche de bois est d’abord détectée manuellement sur la vidéo ; on définit donc sur le film les
contours de la planche et l’on restreint l’étude de la vidéo aux pixels contenue dans cette région de
l’image. Le mouvement de l’animal est extrait par une méthode de seuillage : le corps de l’animal étant
blanc, le fond noir, on obtient une évaluation correcte des pixels correspondant au corps de l’animal en
appliquant un seuil : tous les pixels du fond sont donc noirs, et ceux de l’animal sont blancs. On extrait
ensuite l’isobarycentre de ces pixels blancs, ce qui donne une estimation correcte du centre de gravité
du rat. Les coordonnées de ce point (défini sur chaque image) sont donc retranscrites dans le système
de coordonnées de la planche. On extrait ainsi la position et la vitesse instantanée du rat selon chaque
axe, ainsi que la vitesse moyenne.
Détection de la direction de la tête
La direction de la tête est extraite de la détection de deux diodes rouges placées de sorte que le milieu
de ces deux points corresponde à la position du coup de l’animal. La médiatrice du segment formé par
ces deux points donne la direction de la tête de l’animal ; de plus, on extrait la direction du corps (donné
par le milieu des diodes et le barycentre de l’animal). Ceci nous permettra notamment d’accéder à
l’angle tête-corps et à une estimation de la vitesse angulaire de cette variable. On munit le câble d’un
accéléromètre nous donnant l’accélération instantanée de la tête dans chacune des directions de
l’espace. On extrait un signal proportionnel à la puissance de l’accélération totale, qui reflète donc
l’importance des variations de vitesse de la tête de l’animal. Le signal issu de l’accéléromètre étant très
sensible, il est filtré par un filtre passe-bas afin d’éliminer tous les mouvements parasites.
Extraction des épisodes de thêta
Le rythme thêta est détectable à l’œil nu sur l’EEG (oscillations de grandes amplitudes, sur de multiples
canaux, sur une dizaine de périodes). Sa détection automatisée peut être réalisée de plusieurs
manières. Ici, nous avons tout d’abord filtré le signal EEG de chaque canal dans la bande thêta (4-
12Hz) puis effectué une convolution de ce signal élevé au carré. La moyenne des 5 canaux est alors
utilisé comme indice de puissance thêta. En effet, la convolution du signal filtré dans la bande thêta
avec un noyau gaussien est une mesure de l’intégrale temporelle de ce signal et donc une mesure de la
puissance de thêta. Nous obtenons un indice de puissance de thêta si nous divisons le signal obtenu
par la puissance totale. Cet indice est utilisé par la suite pour les études corrélatives subséquentes.
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 19
Figure 2.7 : Différentes étapes du protocole d’analyse
Acquisition des la vidéo (A) Traitement automatique des images (B) Détection de la direction de la tête (C)
Détection des trajectoires (D) Imagerie fUS (E) Recalibrage par atlas stéréoxique (F) Enregistrement synchronisé (G)
Recherche des régions d’intérêt
Les études de corrélation présentées plus bas permettent d’extraire des régions d’intérêt. Tout d’abord
nous recherchons les régions dont l’activité fUS corrèle avec l’indice de puissance de thêta. Il s’agit
d’effectuer une analyse statistique sur les différents animaux enregistrés. Nous examinons d’une part
les corrélations trial-to-trial pour chaque individu. Il est probable d’obtenir des régions dont la
vascularisation a été altérée par l’intervention chirurgicale. Ainsi, nous opérerons deux contrôles :
analyser des épisodes EEG quelconques et vérifier que ces mêmes régions ne ressortent pas puis
opérer une analyse inter-individuelle pour s’affranchir des particularités de chaque animal. Les régions
observées en fUS seront systématiquement identifiées à l’aide d’un atlas stéréotaxique, notamment
pour l’étude inter-individuelle, les plans d’imagerie pouvant être différents d’un animal à l’autre.
Nous extrairons de plus les régions du cerveau qui corrèlent à l’activité hémodynamique de
l’hippocampe. En effet, nous bénéficions d’un outil permettant d’établir une carte de corrélation du
signal fUS avec l’activité d’une région (définie à la main comme un ensemble de pixels). Ainsi nous
pouvons par exemple analyser les asymétries en regardant les régions dont le signal fUS corrèle avec
l’activité de l’hippocampe gauche ou droit. Il est à noter que c’est un outil différent de l’étude corrélative
fUS-EEG. La combinaison de ces deux outils permet donc de relier l’activité électrique observée à
l’EEG et les activations hémodynamiques observées au moyen du fUS.
Enfin, il est aussi intéressant d’examiner les corrélations fonctionnelles entre les différentes régions et
leur implication dans la précession, le début ou l’arrêt d’un épisode de thêta. Il convient donc de
classifier les différents épisodes en fonction de leur longueur puis de les calibrer sur le démarrage de
l’épisode de thêta (on utilise un seuil pour l’indice de puissance de thêta). Ainsi, en analysant la
covariance des différentes images fUS correspondant à un délai particulier, nous extrayons les régions
activées spécifiquement et potentiellement impliquées dans la génération ou l’arrêt d’un épisode.
	
  
20 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
Figure 3.1 : Signaux étudiés pour la navigation spatiale
Signaux bruts EEG (A) Filtrage de chaque canal dans la bande thêta (B) Vitesse de rotation de la tête du rat (C)
Vitesse axiale de l’animal (D) Signal d’acceleration provenant d’un accéléromètre sur 3 axes (E)
Résultats
Etude des variables de la navigation spatiale
Signaux étudiés
Les résultats présentés dans cette section ont été réalisés sur des animaux préparés pour une
implantation hippocampique dorsale seule (trois électrodes dans chaque hippocampe dorsal). Comme
présenté dans la partie, de nombreuses variables associées à la mobilité de l’animal et au
comportement exploratoire sont extraites. Nous avons centré notre étude sur 3 variables : la vitesse de
l’animal, la vitesse de rotation de la tête. Leurs tracés typiques pour une période de 30 secondes sont
présentés sur la figure 3.1. Chacune de ces variables est étudiée relativement à l’indice de puissance
de thêta.
Le choix de ces variables s’explique par le fait qu’elles jouent un rôle important dans la navigation
spatiale. L’examen des corrélations observées nous permet de confronter les hypothèses avancées sur
le rôle du thêta et son implication dans la navigation spatiale. Plus précisément, le lien thêta-vitesse est
crucial pour examiner le rôle du thêta dans la locomotion. Le lien entre thêta et variation de direction de
la tête pourrait jouer un rôle dans l’exploration et l’intégration de données sensorimotrices, lorsque le rat
renifle par exemple ou lorsqu’il explore son environnement. De plus, le signal d’accélération nous
permet de savoir si le thêta est important lorsque l’animal doit gérer un flot d’informations sensorielles
fortement changeant. Comme lors des phénomènes de précession de phase, le thêta peut jouer le rôle
d’une horloge de référence globale pour les informations sensorielles. Il est important de préciser qu’il
convient de filtrer le signal d’accélération. Les très hautes fréquences observées sont causées par des
mouvements parasites lorsque le rat mange ou gratte la boite.
Etudes de corrélation
Lien thêta-vitesse
Les corrélations présentées ici sont calculées à partir de données obtenues sur 10 animaux enregistrés
séparément pendant 1 heure. On calcule la corrélation à partir des variables continues (bien que les
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 21
images soient numériques on dispose de la position du rat à chaque image de la vidéo et du signal
EEG encore plus souvent, on peut donc considérer que les corrélations sont calculées sur la base d’un
signal continu). On obtient donc un coefficient de corrélation pour chaque animal. On obtient ainsi un
coefficient de corrélation moyen de 0.1053 et un écart-type 0,151. Cette corrélation est significative
(P<0.01) pour la taille de l’échantillon observé. Cela suggère qu’il existe un lien entre déplacement et
thêta cependant celui-ci n’est pas aussi fort qu’attendu. Les valeurs de l’écart-type estimé sur dix
animaux suggèrent que les variabilités interindividuelles sont importantes.
	
  
	
  
	
  
Lien thêta-accélération
Les variabilités inter-individuelles observées jouent aussi un rôle sur le coefficient de corrélation moyen
pour le lien thêta accélération. Il est de 0,1475 et son écart-type estimé pour 10 individus est de 0,308.
On peut classer les individus en 3 classes nettes : ceux dont la corrélation est négative (-0,24 -0,32 -
0,17) ceux pour lesquels elle est proche de zéro et une corrélation très forte (0,38 0,41 0,55 0,42) pour
4 individus.
Une explication probable de ces différences tient au fait que le lien thêta-accélération (tel qu’il est
mesuré ici) est plus sensible à la position exacte des électrodes dans l’hippocampe. Si l’animal n’est
pas implanté correctement (l’électrode peut descendre trop profondément ou même ne pas être stable),
il est possible que cela donne une grande variabilité de mesure. On voit ici que le lien étudié est moins
robuste que le précédent bien que plus accentué.
Figure 3.2 : Corrélats comportementaux du rythme thêta
Tracé de la puissance du theta en fonction de la vitesse du rat (A) de
l’accéleration (B) et de la direction de la tete (C)N = 10 animaux, 1h
d’enregistrement
22 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
Lien thêta-vitesse de direction de la tête
Le coefficient de corrélation moyen calculé pour 10 individus est très faible. Son écart-type est de 0,089
ce qui est bien inférieur à ceux observés plus haut. Il semble donc qu’il n’existe pas de lien fonctionnel
entre la puissance de thêta et la vitesse de direction de la tête.
Influence sur la mobilité
Le thêta semble donc lié à la fois à la vitesse de l’animal et à son accélération. Ces résultats sont
consistants avec les résultats précédents suggérant un rôle majeur du thêta dans la locomotion et dans
l’intégration de l’information spatiale. Pour relier le rythme thêta aux activations observées en fUS, il
semble crucial de pouvoir se rapprocher des conditions de mobilité obtenues pour les enregistrements
EEG classiques sur l’animal mobile.
La taille (8cm) et le poids de la sonde (50g), l’inélasticité du câble, le bruit de la machine et le fait que
l’animal sente que son mouvement naturel est entravé au niveau de la tête sont des obstacles majeurs
à la mobilité. Il faut un temps important avant de pouvoir observer l’animal se déplacer librement dans la
boîte. Cependant, il est possible d’obtenir une certaine mobilité selon différents moyens.
Lorsque l’environnement lui devient familier (par exemple lorsqu’il y a déjà couru librement) le rat se
déplace plus spontanément. De plus, nous avons mis en place une méthode basée sur la récompense
qui stimule l’exploration permettant ainsi de stimuler les comportements écologiques de navigation
spatiale. La différence de mobilité moyenne entre les deux conditions est tout de même très significative.
L’animal marche en moyenne 3 fois que dans la condition où il ne porte pas la sonde sur la tête.
Comparaison statistique animal éveillé/anesthésié
Contraste Mobile (M) / Anesthésie
Nous présentons ici les résultats obtenus sur 3 animaux enregistrés dans les mêmes conditions
d’éclairage et de bruit à 1h d’intervalle. L’animal est anesthésié à l’isoflurane (2g.L-1) et l’on enregistre
500 images (1 image toutes les 3 secondes, 25 mn d’enregistrement) avec la sonde fixée sur la tête de
l’animal. Le second enregistrement a lieu 35 minutes après sur l’animal mobile dans sa cage. Un délai
minimum de 15 minutes est respecté entre l’éveil de l’animal et la deuxième session d’enregistrements.
Les résultats sont présentés sur la figure 3.1.
Figure 3.3 :
Différence moyenne de
mobilité du rat avec et sans
fUS
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 23
On observe deux effets majeurs sur les contrastes entre les deux conditions. La majorité des pixels est
plus activée dans la condition anesthésiée. Les fluctuations positives sont obtenues pour des pixels
situés au dessus de la méninge. On n’observe pas de différence majeure entre les structures profondes
et le cortex et les images de contraste sont relativement symétriques. Au niveau du sinus veineux on
observe une vasodilatation importante dans la condition anesthésiée. Cet effet est aussi présent au
niveau des grosses artères qui traverse le cortex longitudinalement, ce qui a pour effet d’introduire des
« reflets » sur l’image de contraste [C]. Il est peu probable que cela soit du a un déplacement de la
sonde. Nous avons en effet recalculé l’image moyenne (M) afin que le cross-corrélogramme entre les
deux conditions soit centré. Ceci ne fait pas disparaître les contrastes observés. Enfin le contraste [C]
fait apparaître l’hippocampe suggérant une différence significative entre les deux conditions, ce qui est
analysé en détails plus loin.
Profil des données
Les coupes coronales sont découpées en douze régions : cortex gauche (3), cortex droit (3),
hippocampe gauche et droit (2) thalamus dorsal gauche et droit (2) et thalamus ventral gauche droit (2),
de sorte que le nombre de pixels par région soit relativement constant. On calcule ensuite pour chaque
image la valeur moyenne des pixels sur une région donnée. On passe ainsi de 90x128 valeurs à 12
valeurs pour chaque image. La figure 3.2 récapitule la distribution des données.
Figure 3.3 : Différence de contraste dans les conditions mobile (M) et anesthesié (A)
Les deux premières figures (A, B) représentent l’image moyenne calculée à partir de la valeur moyenne de chaque pixel
pour les 500 images respectivement dans la condition mobile (M) et anesthésié (A). La figure (C) donne le contraste M-A/M.
L’échelle de couleurs est comprise entre -0,76 et 2,81. La figure (D) est une image binaire donnant les pixels dont la
différence de moyenne entre les conditions est positive (rouge : M>A, 2917 pixels) et négative (bleu : M<A, 8203 pixels).
Les figures E et F donnent l’auto-corrélogramme dans la condition (A) (auto-corrélogramme de l’image moyenne) et le
cross-corrélogramme entre les conditions. On observe une différence due à la condition mobile. La variation des centres
des corrélogrammes est inférieure à 1 pixel.
24 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
Figure 3.4 : Représentations graphiques des données brutes pour chaque condition (A) et (M)
La ligne supérieure est associée à la condition (M) et la ligne inférieure est associée à la condition (A). On a regroupé
l’image moyenne pour chaque pixels sur les 500 images [A, E]. Les fluctuations temporelles des 12 variables aléatoires sont
données sur les figures [B, F]. Les histogrammes des figures [C, G] donnent le nombre de pixels par région en fonction de
l’intensité. Les graphes [D, G] donnent l’écart-type de chaque pixel en fonction de sa valeur moyenne. N = 500 images.
Code couleur : (bleu, cortex), (rouge, hippocampe), (vert, thalamus), (noir, moyenne des 12 régions).
Dans la condition (A) les fluctuations sont faibles. Le niveau de base de chacune des régions est stable.
On observe une ségrégation des différentes régions en fonction de leur niveau de base. Plus la
structure est profonde plus la moyenne est faible (la sensibilité du signal fUS diminue avec la
profondeur). Les variations du cortex sont importantes et l’on observe une différence de niveaux de
base entre le thalamus droit et le thalamus droit. Les deux hippocampes sont stables et leur niveau de
base diffère de la même manière. Dans la condition (M), on retrouve le profil de ségrégation observé
sous anesthésie. Mais les moyennes des régions ne sont pas stationnaires : on observe en effet des
« bouffées » d’activité sur des périodes de 40-50 images (2 à 3 minutes). Ces fluctuations sont encore
plus importantes pour les structures profondes. Il est peu probable que ceci soit dû à des artefacts liés
au mouvement de l’animal car cela concerne des intensités moyennées calculées sur un grand nombre
de pixels. On retrouve la ségrégation observée précédemment sur les histogrammes de répartition. La
distribution de l’écart-type par rapport à la moyenne (basés sur l’estimation dans l’échantillon observé)
donne une mesure de la variabilité des pixels observés. On observe une réduction de l’étendue de ce
nuage de points dans la condition (A). Ainsi dans la condition (M), la classification statistique par région
est plus évidente alors que la distribution a tendance à s’uniformiser sous la condition (A).
Analyse statistique
La figure 3.3 présente a comparaison des moyennes, variance et écart-type dans les différentes régions
entre les deux conditions. On observe deux effets majeurs : une augmentation de la moyenne entre la
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 25
condition (A) et (M). Ceci est dû à la vasodilatation des vaisseaux sanguins par l’isoflurane. On montré
que le signal fUS est proportionnel au volume sanguin. Ainsi, il est naturel d’observer une augmentation
de la moyenne pour toutes les régions. Cet effet, moins évident sur les images de contraste est massif
et généralisé à l’ensemble du cerveau (les tests de significativité donnent P<0.001 pour 11 des 12
régions observées). Il est encore plus prononcé lorsque la région se trouve proche de grosses artères
(thalamus dorsal gauche).
Le deuxième effet majeur est la réduction de la variance par passage à la condition (A). En effet,
comme observé précédemment le signal fUS mobile présente une ligne de base fortement variable.
Ceci affecte énormément le facteur variance. Comparées aux données régulières de la condition (A),
cet effet est amplifié lorsque la région a une ligne de base faible. Pour l’hippocampe droit, l’écart-type
augmente d’un facteur 10. Cet effet se retrouve dans la mesure du coefficient de variation et par le
déplacement systématique du centre des régions sur le graphe 4A.
Ces données présentent des différences majeures entre les conditions (A) et (B) pour les statistiques
de premier ordre. Plusieurs facteurs explicatifs sont à prendre en compte. La différence de sensitivité en
fonction de la profondeur accentue ces effets pour les structures profondes car les variations par
Figure 3.5 : Analyse statistique de la différence entre les conditions mobile (M) et anesthesié (A)
(A) Ecart-type en fonction de la variance Représentation de la moyenne pour chaque région dans la condition A et M. Le
symbole gras correspond à la condition (A) (B, C, D) Diagrammes en barres de la moyenne, l’écart-type et le coefficient de
variation de chaque région. Les régions sont indexées en abscisse (C1L, C2L, C3L)= cortex gauche (C1R, C2R, C3R)=
cortex gauche (HL, HR) hippocampes gauche et droit (TTL, TTR) thalamus dorsal gauche et droit (TL, TR) thalamus droit et
gauche (WHOLE) ensemble du cerveau.
26 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
rapport au niveau de base plus faible que pour les autres régions affectent d’autant plus le calcul de la
variance. La mobilité de l’animal introduit des artefacts de mouvement pour les régions proches des
méninges. En effet, à cause de l’intervention chirurgicale et de l’absence d’os sur le haut du crâne, la
circulation au niveau des méninges est plus importante même lorsque celles-ci sont préservées.
L’anesthésie elle-même provoque une dilatation des vaisseaux qui augmente les moyennes observées.
Il est possible que l’anesthésie ait un effet sur la faible variance observée, car lorsque les vaisseaux
sont dilatés de manière chronique, l’afflux de sang un effet physiologique moindre, ce qui entraîne un
signal fUS moins variable sous anesthésie (notion de seuil d’élasticité des vaisseaux sanguins).
Le facteur principal de cette analyse est la non-stationnarité du signal et l’observation de ‘bouffées
d’activité’ qui modifient radicalement le niveau de base du signal fUS dans la condition ‘animal éveillé’.
Celles-ci correspondent à des modes (à rapprocher des états hauts et bas observées en
électrophysiologie) pendant lesquels les statistiques du signal sont très différentes. Ainsi, les moyennes
et variances calculées sur de grands échantillons et de longues périodes (comme c’est le cas dans
notre étude) ne reflète pas la vraie distribution du signal. En effet il convient de faire des moyennes
glissantes sur des périodes plus afin de détecter les variations du niveau de base, sans quoi les
fluctuations observées cachent les variations fonctionnelles potentielles lors des épisodes de navigation
spatiale.
Corrélations	
  fonctionnelles	
  fUS	
  
Les résultats présentés dans cette partie sont préliminaires. Pour des raisons d’ordre pratique, il n’a pas
été possible d’analyser les données de manière exhaustive. Cependant, les données présentées
donnent des résultats prometteurs et valident la démarche initiale malgré les obstacles techniques
rencontrés.
Figure 3.6 : Cartes de corrélation du signal fUS /EEG
Les signaux EEG de 4 électrodes hippocampiques filtrées dans
la bande thêta. N=1. Les pixels ont un coefficient de Spearman
supérieur ou égal à 2
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 27
Recherche de pixels d’intérêt corrélant avec les indices de navigation spatiale
La figure montre quatre cartes corrélatives pour chaque pixel de l’image sur un enregistrement de 500
images pour un animal. Ici, nous utilisons le signal EEG de chaque électrode, filtré dans la bande thêta.
En procédant de la sorte, on s’affranchit du moyennage sur les différents canaux, procédure qui résulte
en une perte d’information du signal source. On calcule ensuite les corrélations pour chaque pixel de
l’image. Les corrélations présentées en rouge sur le graphique correspondent à un coefficient de
corrélation supérieur à 0.2. Les deux hippocampes corrèlent significativement (P<0.01 pour 500
images) pour 3 des 4 canaux étudiés.
Il s’agit ici d’un phénomène chronique observé sur une période de temps prolongée. Les variations du
signal fUS reflètent le signal neuronal observé à l’EEG. Il s’agit ici de la première piste pour comprendre
le lien entre l’activité neuronale de groupe observée en EEG intracrânien et le signal fUS. Nous
observons le même type de cartes pour d’autres animaux.
Analyse par régions
Une autre méthode pour comprendre le lien entre le signal fUS et activité neuronale consiste à
examiner les corrélations entre régions d’une part et les corrélations croisées avec les variables
étudiées précédemment (accélération, vitesse, direction de la tête). Nous présentons ici les données
pour le même animal que celui présenté plus haut.
Dans un premier temps, nous établissons des cartes d’auto-corrélation inter-régions pour le signal fUS.
La figure montre ces résultats : on retrouve la ségrégation observée dans la partie 2 entre le cortex (les
5 premières zones de la carte), l’hippocampe et le thalamus. Le signal fUS moyenné sur toutes les
régions corrèle fortement avec 11 d’entre elles (sauf le thalamus dorsal gauche), ce qui suggère que les
variations de l’ensemble des régions se retrouve dans le profil moyen. Autrement dit, pour cet
Figure 3.5 : Matrices d’auto corrélation et de corrélation croisée pour les signaux fUS
Les régions sont indexées en abscisse (C1L, C2L, C3L)= cortex gauche (C1R, C2R, C3R)= cortex gauche (HL, HR)
hippocampes gauche et droit (TTL, TTR) thalamus dorsal gauche et droit (TL, TR) thalamus droit et gauche (WHOLE)
ensemble du cerveau. Abscisse du cross-corrélogramme : vitesse du corps, vitesse angulaire de la tête, Accélération basse
fréquence et haute fréquence, Canaux EEG.
28 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
enregistrement, nous observons le même type de fluctuations par ‘bouffées’ qui affectent le niveau de
base de chaque région. Ainsi le signal moyen observé en fUS est une forme de patron du signal de
chaque région, mais l’information contenue dans chaque région est plus complexe. Ainsi, bien que
toutes les zones corrèlent le signal fUS moyen, elles ne corrèlent pas aussi fortement entre elles.
Le corrélogramme croisé présenté dans la seconde figure correspond au même animal. Pour les huit
signaux étudiés ici, respectivement vitesse, vitesse de direction de la tête, accélération basse fréquence
(entre 1 et 10Hz) et haute fréquence (supérieur à 100Hz), et les puissances des 4 signaux EEG de
l’hippocampe, filtrés dans la bande thêta. On remarque que le corrélogramme présente de fortes
régularités selon l’axe vertical, ce qui suggère une indifférenciation des régions par rapport aux signaux
de la navigation spatiale. A nouveau, l’hypothèse probable est que la non-stationnarité du signal fUS
empêche de pouvoir détecter les petites variations qui pourraient refléter des différences entre les
régions. Cependant, l’hippocampe est la seule région significativement corrélée à l’ensemble des quatre
canaux de l’EEG, ce qui explique qu’elle ressorte si fortement pour l’analyse de pixels individuels.
En conclusion nous voyons que les activations individuelles significatives se retrouve dans le
corrélogramme croisé pour les régions. C’est un résultat attendu car si tous les pixels d’une région
corrèlent fortement à un signal donné il est normal que le signal moyen de la région fasse de même.
Cependant la réciproque n’est pas vraie. Nous venons d’établir une mesure indirecte du lien entre
activité neuronale observée à l’EEG et signal fUS. Les mécanismes impliqués dans l’interaction de ces
structures sont complexes, mais le développement de nouvelles approches permet ce genre d’études.
	
  
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 29
Discussion
Le principal objectif de mon stage a été atteint puisqu’il a été possible d’enregistrer une activité
cérébrale de façon minimalement invasive à l’aide des ultrasons (fUS) sur un animal mobile. J’ai mis au
point un système de fermeture étanche et durable du volet crânien, ainsi qu’un système d’ancrage de la
sonde ultrasonore. J’ai appris à maîtriser l’implantation stéréotaxique d’électrodes hippocampiques, que
j’ai adapté pour passer sous la couverture du volet. Une trentaine de rats m’ont permis de mettre au
point la technique et procéder à des enregistrements simultanés EEG, vidéo et fUS. Les questions que
je souhaitais aborder ont ainsi obtenu des éléments de réponse expérimentale. A l’aide
d’enregistrements en EEG-vidéo j’ai pu corréler les différents marqueurs de la navigation spatiale, en
reliant les paramètres objectifs de mobilité et l’activité cérébrale. Il est apparu que le rythme thêta est
surtout relié à l’accélération de la tête, un peu moins à la vitesse du rongeur, et presque pas à la
direction de sa tête. Dans un deuxième temps j’ai ajouté une sonde ultrasonore au dispositif
expérimental, en vérifiant la qualité des images et en explorant les conséquences physiologiques de
l’absence d’anesthésique. J’ai observé que le cerveau éveillé présente une dynamique d’activité plus
ample que le rat sédaté, et ce de façon générale à travers les différents grands domaines cérébraux.
Enfin mes dernières analyses portaient sur la recherche de région cérébrale associée au rythme thêta.
Mes résultats préliminaires suggèrent que l’hippocampe et le principal puits métabolique pendant
l’activité thêta, même si le cortex sensoriel semble potentiellement impliqué.
Plusieurs réserves et observations doivent être considérées en rapport avec les données recueillies. La
plus évidente est la mobilité réduite des rats portant une sonde ultrasonore. La masse de la sonde
disponible était d’environ 50 en 50-100g pour la partie proximale du câble. Le stage a été rendu plus
compliqué par la casse inopinée de la sonde initialement prévue, d’une masse plus légère (environ
30g). Toutefois, les résultats observés sont surtout intéressants pour la qualité de l’image, tant il n’était
pas évident que la stabilité mécanique serait suffisante. La question de mobilité de l’animal peut être
résolue dans un deuxième temps en allégeant la sonde. En effet, la partie active de la sonde les 128
éléments transducteurs ultrasonores, ne pèsent que quelques grammes. Le gros de la masse des
sondes actuellement disponibles se trouve dans le boitier, conçu dans une logique de maniabilité plutôt
que de miniaturisation. Des sondes plus légères sont en phase de conception, incluant également
l’utilisation de câble plus léger. Enfin il est à noter que même avec une mobilité réduite la technique
mise au point peut apporter un avantage pour étudier les phénomènes altérés par l’anesthésie, comme
les épilepsies, les trauma, etc.
La question de la nature du signal observé avec le fUS est souvent posée depuis la communauté d’IRM
et MEG, bénéficiant de plus de recul que la jeune technique de fUS. Des calculs théoriques et des
données expérimentales en court de publications montrent que le signal le plus robuste utilisable en
imagerie ultrasonore est le Doppler de puissance, dont le signal est proportionnel à la quantité
d’échogène (essentiellement globule rouge) dans un voxel, ce qui correspond à la fraction de volume
sanguin (CBV). Ainsi le fUS présente la caractéristique de ne pas dépendre du degré d’oxygénation du
sang. Cela rend l’interprétation de la mesure plus simple, tout en limitant le champ d’études aux
phénomènes induisant une vasodilatation ou une vasoconstriction.
L’effet vasodilatateur de l’isoflurane est connu. On est peu surpris par la comparaison entre le régime
anesthésié et le régime éveillé. Néanmoins, mes observations illustrent bien le fossé séparant les
différents contextes expérimentaux. Au lieu d’étudier des mécanismes encadrés par des protocoles
ciblés sur telle ou telle modalité, l’observation fait face à un signal riche et plus complexe à analyser. En
particulier l’hypothèse de stationnarité n’est plus automatiquement acquise. Une partie de la variance
du signal peut provenir non pas des variables imposées à l’animal ou même observées dans son
comportement, mais à des états internes naturellement fluctuant. Mes observations de pixels corrélés à
30 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
la puissance du rythme thêta sont présentées à titre d’observations préliminaires, tant il me semble utile
d’approfondir la question des tests de significativité pour un régime non stationnaire. L’étude par fUS-
EEG-vidéo, ne nécessitant pas d’agent de contraste, permet une observation en continu et de longue
durée. Des outils d’analyse adaptés sont à développer pour ce contexte expérimental.
Les perspectives de ce travail sont multiples. J’ai montré la faisabilité de l’imagerie sur le rat éveillé et
mobile. Sur le plan cognitif, cette approche offre un avantage considérable par rapport au rat immobilisé
dans une IRM ou sous un cadre de microscope deux-photons. De nombreux tests cognitifs peuvent être
imaginés, avec l’obstacle éventuel d’une complexité excessive des phénomènes en jeu par rapport à la
sensibilité modérée d’une technique indirecte de mesure de l’activité cérébrale à travers les variations
de débit sanguin. La pratique permettra de préciser la limite de sensibilité de la technique que j’ai mise
au point, et d’adapter les protocoles comportementaux et la durée des enregistrements aux questions
abordées. Sans aucun doute le fUS est une voix prometteuse, complémentaires des autres techniques
d’étude des mécanismes du comportement chez le rongeur.
Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 31
Bibliographie
	
  
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Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 33
Cho	
  &	
  Sharp,	
  2011
Place	
  
cell
Grid	
  cell Head	
  direction	
  cell
Annexes
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Figure S1 Cellules de lieu (A) Cellules de grille (B) Cellules de direction de la tête (C)
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Figure S2 : Schéma de principe de l’imagerie ultrasonore classique (échographie)
Une onde ultrasonore focalisée est envoyée par la barrette échographique sur le milieu à imager. A
chaque fois que l’onde rencontre une interface une onde écho est renvoyée sur la barrette. On peut
alors remonter à la position de l’interface ayant généré l’écho par la formule permettant la conversion
temps-distance (on suppose la vitesse homogène au sein d’un tissu biologique avec c≃1500 m/s) et
en déduire sa nature à l’aide de l’enveloppe du signal reçu. On peut utiliser différentes méthodes de
focalisation pour obtenir une ligne : utilisation de transducteurs courbés, utilisation de réseaux
ultrasonores,... L’image 2D est obtenue en imageant les différentes lignes formant l’image et une
image 3D en associant en parallèle différentes images 3D.
34 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL
	
  
Figure S3 : Imagerie Doppler classique
L’imagerie Doppler classique utilise un faisceau focalisé qui image successivement chaque ligne
formant l’image (a). Cette limitation temporelle ne permet pas d’accéder à un niveau de signal sur
bruit suffisant pour imager des vaisseaux plus petits que les artères cérébrales principales (b).
Figure S4 : Coordonnées du site d’implantation des électrodes en fonction de la distance bregma - lambda

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  • 1. C e n t r e   d e   R e c h e r c h e   d e   l ’ I n s t i t u t   d u   C e r v e a u   e t   d e   l a   M o e l l e   E p i n i è r e   P a r i s ,   F r a n c e   Etude  de  la  navigation  spatiale  par   imagerie  ultrasonore  chez  le  rat  mobile   Antoine  Bergel   Encadrant  :  Ivan  CohenLaboratoire  :  Cortex  et  Epilepsie,  INSERM  U975   M2  Cogmaster   2012  
  • 2. 2 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL        
  • 3. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 3 Table des matières TABLE  DES  MATIERES  ..................................................................................................................................  3   INTRODUCTION  ..............................................................................................................................................  4   NAVIGATION  SPATIALE  ......................................................................................................................................................  4   RYTHME  THETA  HIPPOCAMPIQUE  ....................................................................................................................................  5   Description  ............................................................................................................................................................................  5   Corrélats comportementaux  .............................................................................................................................................  6   Génération  ............................................................................................................................................................................  6   Fonction  ................................................................................................................................................................................  6   IMAGERIE  ULTRASONORE  FONCTIONNELLE  (FUS)  ......................................................................................................  7   Principe  de  l’échographie-­‐Doppler  classique  .....................................................................................................  7   Ultrafast  Doppler  Compound  ....................................................................................................................................  8   Lien  avec  les  grandeurs  hémodynamiques  ..........................................................................................................  9   Résultats  chez  l’animal  anesthésié  ......................................................................................................................  10   VERS  L’IMAGERIE  ULTRASONORE  MOBILE  ...................................................................................................................  11   PROBLEMATIQUE  ........................................................................................................................................  12   DEMARCHE  ET  METHODES  ......................................................................................................................  13   DEVELOPPEMENT  TECHNIQUE  ......................................................................................................................................  13   Chirurgie  .........................................................................................................................................................................  13   Fixation de la sonde  ........................................................................................................................................................  15   PROTOCOLE  D’ENREGISTREMENT  .................................................................................................................................  16   Acquisition des épisodes de thêta  ................................................................................................................................  16   Système de synchronisation EEG-vidéo-fUS  .............................................................................................................  17   Différents modes d’imagerie  ..........................................................................................................................................  17   ANALYSE  DU  SIGNAL  ........................................................................................................................................................  18   Détection du mouvement du rat  ....................................................................................................................................  18   Détection de la direction de la tête  ...............................................................................................................................  18   Extraction des épisodes de thêta  ..................................................................................................................................  18   Recherche des régions d’intérêt  ...................................................................................................................................  19   RESULTATS  ....................................................................................................................................................  20   ETUDE DES VARIABLES DE LA NAVIGATION SPATIALE  ......................................................................................................  20   Signaux étudiés  ................................................................................................................................................................  20   Etudes de corrélation  ......................................................................................................................................................  20   Influence sur la mobilité  ..................................................................................................................................................  22   COMPARAISON STATISTIQUE ANIMAL EVEILLE/ANESTHESIE  ............................................................................................  22   Contraste Mobile (M) / Anesthésie  ...............................................................................................................................  22   Profil des données  ...........................................................................................................................................................  23   Analyse statistique  ...........................................................................................................................................................  24   CORRELATIONS  FONCTIONNELLES  FUS  .......................................................................................................................  26   Recherche de pixels d’intérêt corrélant avec les indices de navigation spatiale  ................................................  27   Analyse par régions  .........................................................................................................................................................  27   DISCUSSION  ...................................................................................................................................................  29   BIBLIOGRAPHIE  ...........................................................................................................................................  31   ANNEXES  .........................................................................................................................................................  33  
  • 4. 4 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Introduction   Navigation  spatiale   Se repérer dans un environnement donné met en jeu de multiples fonctions cognitives incluant perception, mémoire, apprentissage et motivation et nécessite une étroite coordination entre les structures impliquées dans ces différentes fonctions. Il paraît donc inapproprié de tenter d’isoler un substrat neuronal spécifique de la navigation spatiale au regard de la diversité des fonctions requises dans cette tâche. Les résultats de ces dernières années ont mis en lumière certaines unités fonctionnelles codant pour un aspect très spécifique de l’information spatiale, suggérant l’existence d’un réseau modulaire spécialisé dans le traitement de ce type d’information. Cependant, l’architecture fonctionnelle des réseaux sous-tendant la navigation spatiale reste incomprise, bien que les propriétés de certains types de neurone fournissent de précieux indices sur leur rôle dans l’intégration globale de l’information spatiale. Certaines cellules exhibant des propriétés spatiales particulières ont été décrites pour la première fois en 1971 par O’Keefe et Dostrovsky (O’Keefe & Dostrovsky, 1971 ; O’Keefe & Nadel, 1978). Ces cellules de l’hippocampe, appelées cellules de lieu, déchargent à haute fréquence lorsque l’animal se trouve dans un endroit donné de l’espace, définissant ainsi un champ récepteur (place field) analogue au champs récepteurs de la vision. Ces champs de lieu sont rapides à mettre en place lorsque l’animal explore un environnement nouveau, ils sont stables au cours du temps et codent à la fois pour le repérage absolu et relatif. Ces champs ne sont pas seulement ‘sensoriels’ mais aussi ‘cognitifs’ et ils exhibent une composante temporelle forte, notamment lors de phénomène tels que la précession de phase. D’autres cellules jouant un rôle particulier dans l’intégration de l’information spatiale ont ensuite été étudiées : les cellules de direction de la tête présentes dans le subiculum le cortex entorhinal et l’hippocampe (Ranck 1984, 1990) déchargent lorsque l’animal tourne sa tête dans une direction particulière, indépendamment de sa position ; les cellules de grille, présentes dans le cortex entorhinal, sont analogues aux cellules de lieu mais leur champ récepteur est un maillage topologique triangulaire de l’espace (Moser, 2005). Il a été proposé que l’information contenue dans le codage des cellules de grille conjointement à celle des cellules de lieu permette une représentation précise de la position et de la vitesse de l’animal dans un espace euclidien. Plus récemment, il a été montré que le taux de décharge de certaines cellules du subiculum corrèle spécifiquement à la distance de l’animal par rapport à certaines frontières de l’environnement comme un fossé, un mur ou repère caractéristique (Lever, O’Keefe, Burgess, 2009). Ces cellules dont l’existence a été suggérée par des modèles computationnels de navigation spatial correspondent à un codage relatif de l’environnement (en opposition à un codage absolu comme celui des cellules de grille. Le type d’information codé par ces différentes cellules de position, bien que divers, reste néanmoins très local. Afin de comprendre comment ces informations s’organisent pour former une représentation robuste et flexible de l’environnement, il est crucial de mettre en lumière comment les mécanismes d’intégration passent d’une information locale (au niveau) à un niveau global. Il a été proposé que la synchronisation d’assemblées cellulaires et la génération de rythmes soit un moyen efficace pour permettre au système d’intégrer les informations locales au niveau global. Des études ont, dès lors, montrées que les cellules de position déchargent pendant des oscillations spécifiques générées dans l’hippocampe, appelé rythme thêta (O’Keefe & Recce 1993/).
  • 5. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 5 Figure 1.1 : Phénomène de précession de phase observé chez le rat. Au fur et à mesure que le rat traverse un champ de lieu donné, on observe un décalage de phase entre l’occurrence des potentiels d’actions de la cellule de lieu associée et la phase du rythme thêta. Lorsque le rat pénètre le champ de lieu, les cellules déchargent au pic de thêta, alors qu’elles déchargent au creux de thêta lorsque l’animal quitte le champ de lieu. Ce phénomène permet d’extraire la position exacte de l’animal dans un champ de lieu donné.   Rythme  thêta  hippocampique   Description Le rythme thêta est une oscillation rythmique de l’électroencéphalogramme (EEG) dans la bande de fréquence 4-10 Hz, généralement stable sur une dizaine de périodes, observé de manière proéminente chez le rat et de nombreuses espèces de mammifères, dont l’homme. Deux profils oscillatoires distincts ont été décrits : le rythme thêta hippocampique et le rythme thêta cortical. Le premier est enregistré dans l’hippocampe et ses structures adjacentes (cortex entorhinal, subiculum, septum) et correspond à une bande de fréquence haute (6-10 Hz) et une forte amplitude. Plus précisément, l’activité thêta est enregistrée dans CA1, CA3, le gyrus denté (Fox et al., 1986), le subiculum (Buzsaki et al., 1986, Buzsaki et al., 1985) et le cortex entorhinal (Alonso & Garcia-Austt, 1987a, Alonso & Garcia-Austt, 1987b), avec en général un déphasage d’une aire à la suivante. Dans le cortex entorhinal les couches superficielles et profondes oscillent en opposition de phase (Alonso & Garcia-Austt, 1987a, Alonso & Garcia-Austt, 1987b, Mitchell & Ranck, 1980). Dans l’hippocampe l’oscillation est synchrone suivant l’axe longitudinal (Bullock et al ., 1990). Le second est une oscillation basse fréquence (4-7Hz) d’amplitude modérée, observé chez le primate au moyen d’un EEG de surface et associée à des états de somnolence ou de sommeil ou lors de tâches de mémoire de travail [Wang 2010]. A ce jour, il n’existe pas de preuve d’un lien quelconque entre les deux types de thêta (hippocampique et cortical). Figure 1.2 : Rythme thêta enregistré chez l’animal en EEG intracrânien. L’épisode de thêta est caractérisé par de fortes amplitudes sur de multiples canaux. Il dure entre dix et quinze périodes en moyenne (1 à 2 secondes).
  • 6. 6 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Corrélats comportementaux On distingue deux types de rythmes thêta dans l’hippocampe: le thêta de type 1, correspond au mouvement volontaire et aux phases de sommeil paradoxal. Le thêta de type 2 est lui rarement observé lorsque le rat est éveillé (éventuellement en présence d’un prédateur lorsque le rat immobile prépare un mouvement de fuite) et plus couramment sous anesthésie à l’uréthane. Ce type de thêta peut être supprimé par injection d’atropine suggérant que les mécanismes de génération de deux types diffèrent. De manière générale, les épisodes de rythme thêta sont conjoints à une activité locomotrice (marche, course, saut), à des comportements d’exploration de l’environnement (reniflement) ou aux phases de sommeil paradoxal (REM sleep) (Vanderwolf, 1969). En revanche, lorsque le rat mange, dort ou fait sa toilette, l’hippocampe montre un profil oscillatoire irrégulier de large amplitude (Large Irregular Activity). . Chez le rat, le rythme est verrouillé sur la phase des reniflements et le mouvement des vibrisses, bien que le déphasage puisse dériver au cours du temps (Komisaruk, 1970), bien que des résultats plus récents remettent en question la validité de ce verrouillage de phase. On observe une augmentation de la fréquence des oscillations thêta avec la vitesse de l’animal. Enfin, on observe un verrouillage de phase entre régions distantes du cerveau (hippocampe et cortex préfrontal) lorsque l’animal réalise des tâches de mémorisation spatiale (Benchenane, 2009). Génération Les mécanismes de génération et modulation d’amplitude du rythme thêta ne sont pas encore connus en détail. Deux hypothèses principales non-exclusives sont avancées pour expliquer la génération du rythme : l’activation de certaines zones spécifiques permet fait émerger les oscillations du réseau (hypothèse permissive) ou une structure donné fournit une oscillation assez puissante et rythmique qui se propage au réseau (hypothèse de ‘l’effet pacemaker’) (Buzsaki, 2002). Les lésions du septum et du cortex entorhinal bloquent spécifiquement la génération du rythme thêta, il a été proposé que la mise en place de ce dernier résulte d’une alternance répétée entre inhibition provenant du septum et excitation provenant du cortex entorhinal (Pignatelli, Review, 2011). Certains éléments du mécanisme de l’activité thêta sont communément admis. Le rôle du septum dans le contrôle de l’activité thêta hippocampique est solidement établi. Le thêta septal et hippocampique apparaissent simultanément in vivo et sont verrouillés en phase. De plus, les études de stimulation et ablation ont montré que le septum est nécessaire pour l’apparition de ce rythme, même si l’activation d’autres aires telles que la formation réticulaire mésencéphalique est corrélée au thêta hippocampique chez certaines espèces (Vertes, 1982). Les cellules principales et des interneurones montrent une activité synchrone en opposition de phase pendant l’activité thêta (Buzsaki, 1986). Leurs potentiels membranaires présentent des oscillations, qui mènent à une décharge à chaque cycle pour les interneurones et moins souvent pour les cellules principales (Nunezet, 1987). L’activité des interneurones augmente pendant les épisodes thêta, tandis que l’activité moyenne des pyramidales est réduite. Les oscillations du potentiel membranaires des cellules pyramidales semblent dues en partie à des séries de PPSI (Leung & Yim, 1986). Ces deux actions peuvent être dues aux deux types de fibres septo-hippocampiques. Les fibres cholinergiques activant des récepteurs muscariniques produiront une excitation lente, tandis que les fibres GABAergiques inhiberont rythmiquement des interneurones hippocampiques, produisant une désinhibition des cellules pyramidales (Freund & Antal, 1988). De plus, l’activation des récepteurs muscariniques peut, à elle seule, provoquer des oscillations du potentiel membranaire dans certains interneurones (Parra, 1998). Fonction La fonction principale du rythme thêta n’a pas été établie de manière définitive. Trois hypothèses principales sont proposées. Il pourrait jouer un rôle dans le codage fin de la position de l’animal dans son environnement (O’Keefe & Burgess 2005, Buzsaki 2005). Autrement, il pourrait jouer un rôle dans
  • 7. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 7 la mémoire et l’apprentissage de tâches spatiales (Hasselmo, 2005). Enfin, il pourrait être crucial dans l’intégration des informations sensori-motrices (Vanderwolf 1969, Bland & Oddie, 2001). Les cellules de position, qui sont actives spécifiquement lorsque l’animal se trouve en certains endroits, déchargent pendant le thêta. Le déphasage entre le rythme thêta et l’activité d’une cellule varie pendant que l’animal s’approche, traverse et quitte son champ de position. Ces observations ont mené à la théorie que le rythme thêta participe à la formation et au stockage d’une carte spatiale permettant la navigation (O'Keefe & Recce, 1993). Il pourrait avoir une fonction d’horloge de référence afin de coder précisément la position de l’animal dans son environnement et de permettre de transcrire les informations locales au niveau global du réseau de navigation spatiale (Battaglia, 2011). Il est important pour la mémoire spatiale, à la fois dans l’encodage et dans la récupération d’information. De plus, on observe une forte synchronisation (pic de cohérence) entre hippocampe et cortex préfontal lorsque l’animal doit faire un choix dans une tâche dirigée vers un but (Benchenane, 2010). Il a de plus été démontré que l’émergence d’un rythme favorise la communication entre régions géographiquement éloignées et pourrait donc sous-tendre la récupération d’informations au moment de la prise de décision (Womelsdorf, 2007). Enfin, certains auteurs attachent au rythme thêta un rôle majeur dans l’intégration des données sensori- motrices : il a été démontré que le démarrage des épisodes de thêta a lieu plusieurs centaines de millisecondes avant le déclenchement du mouvement. Ceci expliquerait l’occurrence du thêta quand l’animal prépare une séquence de mouvement sans pour autant l’initier. Certains modèles d’intégration sensori-motrice imputent un rôle majeur au rythme thêta pour coordonner les entrées motrices à la planification de séquence de mouvement. Tous ces éléments montrent une implication du rythme thêta hippocampique dans la navigation spatiale. Néanmoins, beaucoup d’inconnus subsistent, notamment l’ensemble du réseau, ainsi que les interactions entre les différents sous-réseaux, impliqués lors de la navigation spatiale, et ce, par manque d’outils. Toutefois, une toute nouvelle méthode d’imagerie a été récemment mise en point et pourrait apporter des informations cruciales à la compréhension du processus de la navigation spatiale. Imagerie  ultrasonore  fonctionnelle  (fUS)   L’imagerie ultrasonore fonctionnelle (fUS) est une nouvelle technique d’imagerie adaptée de l’échographie, mise au point il y a une dizaine d’années par des chercheurs de l’institut Langevin (Mickaël Tanter & Mathias Fink). Cette dernière permet d’imager avec une très forte sensitivité les transitions rapides du volume sanguin et du débit sanguin dans le cerveau. La résolution spatio- temporelle est comparable sinon meilleure aux techniques actuelles d’imagerie fonctionnelle. Principe  de  l’échographie-­‐Doppler  classique   L’échographie permet de sonder les propriétés d’un milieu, et a fortiori d’un milieu biologique, à l’aide d’ondes ultrasonores dont la fréquence varie entre 1 MHz et 100 MHz dans le cas des applications médicales. Ses principaux avantages résident dans le fait qu’il s’agit d’une technique non-invasive, relativement peu coûteuse, réalisée à l’aide de sondes portatives sur des périodes prolongées et présentant une haute résolution temporelle. L’onde ultrasonore est générée par un transducteur piézo- électrique, dont le rôle est de convertir un signal électrique en onde acoustique et inversement. Lorsque le train d’ondes généré traverse une interface dans le milieu se produit un phénomène d’écho : une partie de l’onde est réfractée à travers l’interface alors qu’une autre partie est réfléchie. C’est l’amplitude et le retard de cette onde réfléchie qui permet de reconstruire une image de la structure du milieu. Il s’agit donc d’une méthode d’imagerie purement structurelle.
  • 8. 8 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   L’imagerie Doppler classique est basée sur l’effet Doppler-Fizeau qui permet d’évaluer la vitesse d’une particule en mouvement entre l’émission et la réception d’un train d’ondes. Elle est utilisée ici pour calculer le flux sanguin cérébral, en évaluant la vitesse de déplacement des globules rouges. Il est démontré que la fréquence de l’onde réfléchie, dite fréquence Doppler fd, renvoyée par un globule rouge se déplaçant à la vitesse v dans un champ ultrasonore de fréquence fus est donnée par la formule suivante: Dans le cas de l’imagerie du flux sanguin cérébral, les vitesses considérées sont comprises entre 5 mm.s-1 à 2 cm.s-1 pour les petits vaisseaux (capillaires et artérioles) et peuvent atteindre 40 cm.s-1 pour les plus gros vaisseaux. Ainsi, imager un flux sanguin de 2 cm.s-1 à l’aide d’une sonde émettant à 15 MHz, requiert une fréquence Doppler de 400 MHz, ce qui impose une fréquence d’acquisition supérieure à 800 MHz pour obtenir une échantillonnage correct du signal (théorème de Shannon). Cette méthode nécessite donc une cadence d’acquisition particulièrement élevée. Par ailleurs, on rencontre un problème d’échogénéicité (le sang n’ayant pas le même degré d’échogénéicité que les tissus environnants), qui résulte en une perte de signal et l’apparition d’une intensité Doppler minimale. Le rapport signal/bruit peut cependant être amélioré en répétant l’acquisition du signal un grand nombre de fois, mais l’imagerie Doppler classique utilise des faisceaux ultrasonores focalisés à une profondeur donnée, nécessitant de changer la focalisation pour chaque ligne de l’image finale. Ainsi, la résolution temporelle est limitée par le temps de propagation aller-retour des ultrasons et la cadence d’acquisition imposée pour imager les gros flux sanguins est trop grande. Ultrafast  Doppler  Compound   L’Ultrafast Doppler Compound permet de résoudre ces deux problèmes : grande cadence d’acquisition et grand rapport signal sur bruit. Cette technique a été rendue possible par l’émergence d’échographes ultrarapides (pouvant acquérir jusqu'à 10 000 images / seconde) et repose sur deux concepts fondamentaux: • l’utilisation d’ondes planes non focalisées à l’émission, envoyées avec différents angles par rapport au plan à imager. • le groupement des images acquises selon les différents angles afin de former une image composite (compound) dotée d’un rapport signal/bruit plus important. L’utilisation d’ondes non focalisées à l’émission et focalisées à la réception permet d’augmenter considérablement la cadence d’acquisition, car on n’envoie plus qu’un train d’ondes ultrasonores planes là où il était nécessaire d’en envoyer un pour chaque ligne de l’image. Cependant, l’utilisation d’ondes planes entraîne une diminution considérable de la puissance d’émission et donc un rapport signal sur bruit et une résolution faibles. Or, il a été démontré que la sommation des différentes images obtenues avec les différents angles entre le transducteur et le plan à imager permettait d’augmenter considérablement le rapport signal sur bruit (on suppose que seul le bruit change entre 10 images proches i.e. 1ms).
  • 9. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 9 Ainsi, pour une profondeur d’imagerie de 3 cm et l’utilisation de 10 angles, on est maintenant capable d’imager à une cadence de 2,5 kHz ce qui est largement suffisant pour imager le flux sanguin, y compris dans les plus petits vaisseaux. De plus, cette technique permet de privilégier, en fonction du flux que l’on souhaite imager, soit une acquisition très rapide dont la qualité de l’image sera faible en réduisant le nombre d’angles utilisés, soit une grande qualité d’image au détriment de la vitesse d’acquisition, en augmentant le nombre d’angles utilisés. A titre d’exemple, l’utilisation de 17 angles d’imagerie permet d’imager à une cadence de 1 kHz et de réaliser une angiographie du cerveau de rat, avec une sensibilité jusqu’à vingt-quatre fois supérieure à celle obtenue en imagerie Doppler classique (Macé,2011). Lien  avec  les  grandeurs  hémodynamiques   Cette nouvelle technique d’imagerie nous permet d’obtenir pour chaque pixel de l’image un signal Doppler du sang sb(t). La transformée de Fourier de ce signal contient deux types d’information : l’une donnée par la fréquence moyenne est reliée à la vitesse des globules rouges (voir formule 1), qui est donc une mesure directe du flux sanguin cérébral (CBF), la seconde donnée par l’amplitude du signal intégré sur le temps est reliée à la quantité de globules rouges, donc au volume sanguin cérébral (CBV). En effet, si l’on considère un pixel de l’image traversé par un capillaire sanguin, l’onde ultrasonore envoyée va générer un écho sur chacun des N globules rouges se trouvant dans ce pixel. On démontre que la fréquence de l’onde réfléchie est proportionnelle au flux sanguin (cette fréquence sera d’autant plus importante que les globules rouges se déplacent vite) et que l’amplitude de l’onde réfléchie est proportionnelle au nombre de globules rouges compris dans le pixel étudié et reflète donc le volume sanguin (plus le nombre de globules rouges est grand, plus l’écho est important). En réalité, le signal sb(t) est proportionnel à √N et c’est l’intégrale temporelle du signal sb(t) élevé au carré qui est donc proportionnel à N. De plus, on suppose que la densité de globules rouges est constante dans l’ensemble des vaisseaux cérébraux, pour obtenir un signal proportionnel au volume sanguin cérébral). Figure 1.3 : Imagerie Doppler Ultra-Fast Compound (UFDC) L’UFDC utilise une onde plane à l’émission et focalisée à la réception ce qui permet de n’acquérir qu’une image là où on devait imager toutes les lignes formant l’image en imagerie Doppler classique (a). On acquiert cette image pour différents angles entre le plan de l’onde et le plan à imager (b) ce qui forme une image composée (c). Une image composée est obtenue en 1 ms ce qui permet de répéter l’acquisition jusqu’à 200 fois afin d’augmenter le rapport signal sur bruit (d). Chaque point de l’image est ensuite traité par un filtre passe-haut afin de supprimer les artefacts dus aux événements basse fréquence tels que la respiration ou le battement cardiaque pour ne laisser apparaître que le signal correspondant au flux sanguin. L’intégrale de ce signal sur l’ensemble du temps d’acquisition permet alors d’obtenir l’image finale (e) qui présente une résolution spatiale bien plus élevée que celle de l’imagerie Doppler classique.
  • 10. 10 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   On obtient donc deux modalités d’imagerie le Doppler de fréquence qui mesure le flux sanguin et le Doppler d’intensité qui mesure le volume sanguin. Dans la suite de notre rapport, nous présenterons nos résultats seulement pour le Doppler d’intensité, qui est une mesure plus précise que la précédente. Enfin, il convient de rappeler que le lien entre l’activité neurale mesurée par le potentiel de champ local (LFP) ou les enregistrements multi-unitaires (MUA) est complexe. La réponse hémodynamique supposée est que l’activation d’une assemblée cellulaire se traduit par un certain nombre de potentiels d’actions qui consomment les ressources locales, déclenchant en réaction un afflux de sang par dilatation des vaisseaux (gros vaisseaux en amont et capillaires a proximité) résultant en une augmentation du volume sanguin. Cependant, des résultats futurs sont nécessaires afin de valider cette hypothèse. Le lien avec le BOLD est aussi complexe mais il apparaît que la latence des réponses enregistrées ici serait de l’ordre de la seconde. Résultats  chez  l’animal  anesthésié   L’imagerie ultrasonore fonctionnelle (fUS) a été mise au point sur le rat anesthésié. Après avoir opéré une craniotomie, la sonde ultrasonore est placée au dessus de la dure-mère. Un gel permet de combler l’espace entre le cerveau et la sonde afin de faciliter le transport des ondes ultrasonores. La figure # reproduit les résultats obtenus : le Doppler d’intensité reflète les activations dans le cortex en tonneaux d’une rangée de vibrisses, stimulées de manière répétée pendant 30s puis relâchées pendant 1mn. Ces activations fonctionnelles corrèlent très fortement avec la stimulation mécanique, et ce même pour la stimulation d’une seule vibrisse (figure C). D’autres résultats ont été présentés chez le rat présentant des crises épileptiques après injection focale de kaïnate. Figure 1.4 : Différentes modalités d’imagerie en technologie UFDC. Pour chaque pixel de l’image, on récupère un signal temporel sb(t) correspondant à la somme des échos de chacun des globules rouges se trouvant dans ce pixel. La transformée de Fourier de ce signal conduit alors à deux types d’informations : une information d’amplitude liée à la quantité de globules rouge se trouvant dans le pixel, donc, si l’on suppose la concentration en globules rouges constante, au volume sanguin cérébral (A), et une autre information fréquentielle, peu précise, directement liée à la vitesse des globules rouges donc au flux sanguin cérébral (B). Figure 1.5 : Activations fonctionnelles fUS chez le rat anesthésié. (A) Stimulations répétées d’une rangée de vibrisse alternant 30 secondes de stimulation et 1mn de repos (B) Activation fonctionnelle obtenue pendant stimulation dans la condition A. Le cortex en tonneau et le relais thalamique sont fortement activés (C) Activation fonctionnelle pour une vibrisse seule. On observe la disparition de l’activation thalamique précédente.
  • 11. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 11 Vers  l’imagerie  ultrasonore  mobile   Ces résultats ont été mis au point chez le rat anesthésié. Il est probable que l’anesthésie gazeuse utilisée (isoflurane) joue un rôle suppresseur de l’activité de fond chez l’animal éveillé. Le poids et les dimensions de la sonde permettent d’envisager un protocole d’imagerie fonctionnelle chez le rat mobile. Cette approche nécessite un développement technique important (fixation de la sonde, minimisation de l’entrave au mouvement naturel) mais permettrait de recueillir d’importants résultats non seulement dans l’étude de l’activité globale du cerveau dans la locomotion, leur lien avec les rythmes observés à l’EEG ou dans la comparaison avec les données existantes chez le rat anesthésié afin de mieux comprendre les effets de l’anesthésie et son rôle dans la propagation des crises d’épilepsie. Figure 1.6 Comparaison Imagerie par Résonance Magnétique petit animal et Imagerie ultrasonore fonctionnelle (fUS)
  • 12. 12 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Problématique L’objectif de ce projet de Master est de mieux comprendre les interactions entre le système limbique et les aires corticales dans le processus de navigation spatiale en utilisant l’imagerie fUS combiné à l’électroencéphalogramme (EEG). L’EEG permettra d’identifier les périodes durant lesquelles les rythmes thêta hippocampique seront générés et, ainsi, les corréler à l’imagerie fUS afin d’observer les régions impliquées lors de ces rythmes. Le but était de développer et évaluer l’imagerie fUS su l’animal mobile pour mieux comprendre les interactions entres le système limbique et les aires corticales dans les processus de navigation spatiale. Notamment, ce projet repose à la fois sur l’acquisition d’outils expérimentaux (chirurgie), un développement technique majeur (mise en place d’un protocole d’acquisition d’images de qualité sur l’animal en mouvement et sur la confrontation de techniques de mesure différentes (EEG et imagerie ultrasonore fonctionnelle. L’objet d’étude choisi ici est la navigation spatiale et le projet est particulièrement centré sur le phénomène de thêta hippocampique. L’axe principal de notre étude est la recherche de régions dont l’activation observable en imagerie ultrasonore est significativement reliée au thêta. Si elles existent, nous cherchons à examiner en quoi ces interactions nous permettent de mieux comprendre le phénomène de navigation spatiale et l’implication des différentes régions dans les oscillations observées à l’EEG. Ce projet présentant une part d’incertain lié au développement technique nécessaire au protocole d’imagerie mobile, nous avons axé notre travail sur trois directions de recherche. La première partie du projet traite de la navigation spatiale chez le rat sans imagerie mobile. Nous avons mis en place un protocole d’enregistrement nous permettant d’étudier les relations entre de nombreux paramètres lorsque le rat entre dans un processus de navigation spatiale (direction de la tête, vitesse, accélération) afin de préparer l’étude en imagerie mobile. La deuxième partie du projet consiste à présenter et analyser statistiquement les données d’imagerie entre la condition anesthésiée et éveillée. L’imagerie ultrasonore fonctionnelle n’a jusqu’à alors été utilisée que sur des rats anesthésiés subissant par exemple la répétition d’une activation fonctionnelle telle que la stimulation des vibrisses. Il est crucial pour la suite du projet de bien connaître les fluctuations temporelles du signal fUS dans les différentes régions du cerveau lorsque l’animal est mobile. La dernière partie du projet montre les corrélations fonctionnelles entre les activations observées en fUS et les paramètres de la navigation spatiale étudiés dans la première partie, en examinant à la fois le signal fUS de chaque voxel individuel d’une part et le signal moyenné sur une certaine région d’autre part (hippocampe gauche par exemple). Cette démarche nous permet ainsi de présenter des auto-corrélogrammes de régions pour différentes régions ainsi que des cartes d’activation par pixel. Il est important de souligner que ce projet a nécessité une part importante de développement technique et d’acquisition d’outils expérimentaux. Il s’agit d’un travail de recherche sur une technique nouvelle amené à être poursuivi et enrichi. Il nous a paru particulièrement important d’insérer ce développement dans une démarche scientifique cohérente.
  • 13. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 13 Figure 2.1 : Vues transversales de la tête de l’animal avant et après la phase de craniotomie (A) Après incision les soudures principales sont visibles. Le volet est percé entre le bregma et le lambda. (B) Après ouverture, quatre vis de consolidation sont posées. Deux d’entre elles sont reliées à la masse. Du ciment dentaire recouvre la partie dorsale et sert de point de fixation pour les électrodes. Démarche et méthodes Développement  technique   L’imagerie ultrasonore fonctionnelle a été testée est mise au point sur des animaux anesthésiés dont la tête est fixée dans un cadre stéréotaxique. La sonde est immobile fixée dans un bras du cadre, de sorte que les artefacts liés au mouvement involontaire de l’animal (réflexes, tremblements) sont inexistants. Il convient juste de filtrer les basses fréquences correspondant à la respiration et aux pulsations cardio- vasculaires. Dans le cadre de l’imagerie mobile, trois problèmes majeurs apparaissent nécessitant un développement technique important afin d’obtenir des images de qualité : adapter la chirurgie, fixer la sonde sur la tête de l’animal en mouvement et limiter l’entrave au mouvement naturel de l’animal. Nous présentons plus bas les méthodes mises en œuvre afin de surmonter ces contraintes. Chirurgie   Les ondes ultrasonores utilisées par la méthode fUS sont fortement diffractées par la paroi osseuse (ceci est dû aux nombreux vaisseaux sanguins qui la traverse), il est nécessaire d’ouvrir un volet crânien adapté la taille de la sonde, afin de permettre le passage des ultrasons. A terme, le volet est recouvert par un matériau perméable aux ultrasons afin que l’animal reprenne un fonctionnement normal dans la période post-opératoire. Le traumatisme lié à l’opération est bénin et disparaît au bout de quelques jours ; de plus, il n’entraîne pas de déficit cognitif visible jusqu’à 6 semaines après l’opération (sur 30 rats opérés). Hormis cette opération, la méthode d’imagerie n’est pas invasive car la sonde est maintenue à la surface du cerveau sans contact avec les méninges qui ne sont pas altérées. On réfère ainsi à la méthode comme minimalement invasive. La chirurgie complète se déroule en trois étapes : la craniotomie, la pose d’électrodes par stéréotaxie et le recouvrement du volet. La durée moyenne de l’intervention et de 6 jours et une période de recouvrement de 3 est respectée avant de procéder aux enregistrements. Craniotomie L’animal est endormi puis maintenu par anesthésie gazeuse à l’isoflurane (Vetflurane). Durant toute la durée de la chirurgie, l’animal est maintenu dans un cadre stéréotaxique, la tête maintenue par des barres d’oreilles. Sa température est maintenue entre 36°C et 37°C par un tapis chauffant. Le débit d’isoflurane est maintenu entre 1,5g.L-1 et 2.0g.L-1. Le débit d’air est d’oxygène sont respectivement de 0.3 et 0.2g.L-1. Après injection locale de lidocaïne (Xylovet), anesthésique local bloquant des canaux sodiques, on effectue une incision dans le plan sagittal. Les muscles et fibres au contact du crâne sont ensuite écartés sur les côtés, puis un volet est ouvert en perçant l’os. Les dimensions du volet sont de 5 mm selon l’axe sagittal, 10 mm selon l’axe coronal et 3 à 5 mm selon l’axe dorso-ventral (figure 2.1). Le volet osseux est retiré à l’aide de pinces en veillant à ne pas percer le sinus veineux pour éviter une hémorragie importante. On laisse ensuite le cerveau reposer dans un mélange sérum physiologique et de Bétadine.
  • 14. 14 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Figure 2.2 : Stéréotaxie (A) Coordonnées initiales d’implantation. Les coordonnées exactes sont déduites de la distance bregma-lambda (B) Schéma de l’implantation d’une triode. La flèche désigne le point de section, après implantation de la triode (C) Vue transversale de l’animal après stéréotaxie puis consolidation par pose de ciment dentaire (D). Stéréotaxie L’étape suivante consiste à implanter des électrodes dans la région CA1 l’hippocampe dorsal, où les oscillations thêta présentent une amplitude forte. Les rats implantés sont des mâles Sprague Dawley dont l’âge est compris entre 8 et 10 semaines (l’âge adulte est atteint au bout de 13-15 semaines). Les coordonnées d’implantation sont dépendantes de l’âge du rat. En pratique, on mesure la distance entre les deux soudures principales du crâne (distance Bregma-Lambda), puis on calcule les coordonnées corrigées d’implantation de CA1. Les électrodes utilisées sont des fils de tungstène (diamètre 100µm). Trois électrodes sont implantées dans chaque hippocampe à des profondeurs différentes espacées de 0.5 à 1 mm. Ces trois électrodes sont enfilées dans un tube en inox (diamètres interne/externe 300µm/500 µm) pour former une triode. L’absence d’os à proximité du site d’implantation nécessite de donner une forme coudée à chacune des triodes afin de créer un point de fixation sur l’os. On utilise ensuite du ciment dentaire pour fixer les triodes à l’extrémité dorsale du volet crânien. On implante de plus une électrode de référence dans le cortex et une électrode de masse à la fois dans le cervelet et dans le cortex préfrontal. Recouvrement du volet Cette étape est critique pour obtenir de bons résultats. Les contraintes sont ici de trois types : - Stabilité et de perméabilité Le volet crânien doit être recouvert par un chapeau fixe afin de permettre de placer la sonde. Il est crucial que ce chapeau soit perméable pour retrouver une forme d’homéostasie après la craniotomie. - Intégrité physique du rat Si certaines réactions sont inévitables (destruction des cellules à proximité des électrodes, formation de tissu cicatriciel) et s’accentuent avec le temps, il est crucial de ne pas utiliser de matériaux qui créent facilitent les inflammations. Il convient donc d’en vérifier la biocompatibilité, afin de ne pas provoquer de traumatisme pouvant causer des déficits cognitifs. - Qualité d’imagerie Les matériaux utilisés doivent avoir une bonne perméabilité aux ultrasons (homogénéité, non- echogénéicité) et il est crucial de ne pas piéger de bulles d’air entre le cerveau et le chapeau, celles-ci empêchent la propagation des ultrasons et créent des zones d’ombre sur l’image.
  • 15. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 15 Figure 2.3 : Recouvrement du volet (A) Après la stéréotaxie, des vis de fixation sont mises en place. Les muscles sont maintenus sur les cotés du volet par des pièces de plastique. (B) On applique ensuite une feuille de PVC et l’on comble par un bain de sérum physiologique et bétadine. Des écrous sont ensuite placés pour recevoir le micro-manipulateur. La technique actuelle consiste à utiliser une feuille de polychlorure de vinyle (PVC) pour recouvrir le volet crânien. On comble l’espace entre la feuille de PVC et les méninges par un mélange de sérum physiologique et de bétadine, afin de ne pas enflammer les méninges. Des vis sont percées dans le crâne (deux à l’avant, deux à l’arrière) afin de créer des points d’ancrage. Du ciment dentaire est ensuite coulé sur l’os, les vis et la feuille de PVC, après avoir convenablement séché les surfaces afin d’assurer une bonne adhérence. On coule ensuite du ciment dans les interstices au dessus de la feuille de PVC afin de garantir l’étanchéité du montage. A la fin de la procédure, le cerveau est visible à travers la feuille de plastique est le ciment dentaire recouvre toutes les surfaces qui ne se trouvent pas sur le trajet du faisceau d’ultrasons. Fixation de la sonde Le développement technique majeur de ce projet est de mettre en place un système permettant de fixer la sonde ultrasonore sur la tête du rat. Pour l’animal anesthésié de telles contraintes ne se posent pas, les mouvements parasites étant relativement on obtient des images de très bonne résolution avec très peu de bruit. Cependant, lorsque l’animal se déplace, de nombreux artefacts apparaissent : artefacts mécaniques liés au mouvement (mouvement brusque, chocs mécaniques), artefacts électriques (déformation du champ électrique, électricité statique), écoulement du gel, déplacement de la sonde, apparition de bulles. Afin de limiter les artéfacts mécaniques, nous avons mis en place un système de fixation vissé de la sonde sur la tête de l’animal. Un moule de la sonde est utilisé et trois écrous sont fixés sur la tête de l’animal. Les positions de ces écrous peuvent légèrement varier d’un animal à l’autre. On visse ensuite sur ces trois écrous une platine fixe qui supporte un micromanipulateur. Ce dernier permet non seulement de fixer la sonde solidement et d’en supprimer les mouvements parasites, mais surtout de translater la sonde dans le antéro-postérieur, permettant ainsi de réaliser de multiples coupes coronales. Ce dispositif permet d’acquérir de nombreuses images du cerveau selon plusieurs plans, augmentant ainsi la probabilité d’observer un grand nombre de structures et permet de reconstituer les images en 3D. Lors des épisodes d’enregistrements, le micromanipulateur est vissé sur la tête du rat puis la sonde ultrasonore est y insérée et maintenue par des vis. Il convient de placer la sonde la plus basse possible afin que l’espace entre la sonde et la feuille de PVC soit le plus réduit possible. On comblera ensuite cet espace par du gel de conduction ultrasonore.
  • 16. 16 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Figure 2.4 : Fixation de la sonde La dernière phase de l’opération consiste à fixer des écrous destiner a supporter un micromanipulateur (A). Cette pièce en plexiglas est composée d’une platine fixée sur la tête de l’animal et d’une partie supérieure permettant d’ajuster le plan d’imagerie selon l’axe antéro-postérieur (B). La sonde est ensuite vissée à la partie supérieure, alors que le rat est anesthésié sous isoflurane (C). Le bilan final de l’opération consiste à avoir la sonde sur un plan fixe afin de bénéficier d’une image de qualité tout en permettant à l’animal d’avoir un comportement normal. L’animal doit pouvoir se déplacer sans que la contrainte imposée par le micromanipulateur et le connecteur EEG ne soit trop importante. Actuellement, le poids de la sonde mais surtout la rigidité des câbles imposent de fortes contraintes mécaniques sur la tête du rat. Celui-ci se déplace en ayant la tête légèrement surélevée par rapport à sa marche normale. Il lui est possible de pouvoir tourner la tête, sans pouvoir toutefois effectuer un tour complet sur lui même. Ceci est minimisé lorsque l’expérimentateur porte le câble de la sonde en faisant contrepoids et suit le mouvement naturel de l’animal. Protocole  d’enregistrement   Acquisition des épisodes de thêta Bien que proéminent chez le rat, le rythme thêta n’est pas l’oscillation sur l’EEG hippocampique du rat. Celui-ci est dominée par une large activité irrégulière (LIA) ou par des oscillations rapides (dans la bande gamma) lorsque le rat mange et fait sa toilette. Cependant, la mobilité apparaît comme une condition nécessaire à l’apparition du thêta [réf]. Le rat est donc soumis à une privation bénigne de nourriture et d’eau (6 heures précédant l’enregistrement), puis installé sur une planche linéaire (120x20 cm), au bout de laquelle se trouve un peu de nourriture. Après quelques répétitions le rat marche naturellement d’un bout à l’autre de la planche. De nombreux artefacts électriques lorsque l’environnement est confiné (cage, murs). Ceci est dû aux charges statiques qui se déposent sur les parois et créent des interférences à l’EEG. L’impédance des électrodes implantées dans l’hippocampe étant assez haute, de faibles courants peuvent générer des différences de potentiels importantes. En conséquence, il convient de mettre tous les porteurs de charges à la masse (le bon contact de l’électrode de masse implantée dans le crâne étant crucial). Le préamplificateur doit aussi être placé très proche de la tête, car les courants sortant de la tête de l’animal sont très faibles et donc particulièrement sensibles aux fluctuations du champ électromagnétique de la pièce pouvant générer des courants induits. Le pré-amplificateur amplifie le signal à sa sortie, rendant négligeable l’effet des courants induits [réf].
  • 17. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 17 Figure 2.5 : Schéma du protocole d’enregistrements synchronisés fUS-vidéo-EEG Figure 2.6 : Programme d’acquisition et d’analyse des signaux synchronisés Système de synchronisation EEG-vidéo-fUS Nous avons développé un programme permettant d’acquérir de manière synchronisée les données vidéo, EEG et fUS. Le signal vidéo est acquis par une webcam placée en hauteur placée en hauteur de manière à inclure la totalité de la planche dans le champ visuel. Le signal EEG est d’abord pré-amplifié (deux options sont possibles : fixer le pré-amplificateur sur la tête de l’animal ou utiliser un câble blindé reliant le pré-amplificateur en position fixe au connecteur placé sur la tête de l’animal) puis le signal différentiel (différence entre électrodes placées dans l’hippocampe et référence) est amplifié puis numérisé pour être traité par le programme. Le programme lui-même est écrit en LabView. Différentes fonctionnalités sont implémentées notamment un certain nombre de filtres (passe-bas, coupe-bande, passe-bande). Le signal fUS est traité par une autre machine, mais un canal permet la synchronisation des images fUS aux données EEG en envoyant un ‘bip’ appelé trigger à l’initiation de chaque image. Différents modes d’imagerie Le signal fUS est acquis par la sonde est traité par un ordinateur indépendant. Actuellement, la limitation principale est le temps de traitement des données (une image composite est formée à partir de 1400 jusqu’à 4000 images intermédiaires). Le stockage des données et leur transfert doivent être assez rapides pour permettre d’accumuler un grand nombre d’images sur une période prolongée. On utilise deux modes d’imagerie. Le premier consiste à imager en continu, c’est-à-dire à enregistrer les images intermédiaires (pendant 200ms) puis à former l’image composite correspondant à cette
  • 18. 18 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   période. En fonction de la qualité de l’image formée (nombre d’angles utilisés, résolution), on peut obtenir entre 1 image toutes les 2 à 5 secondes pendant une période prolongée (plusieurs centaines d’images correspondant à 30-40 minutes d’enregistrement). Le deuxième mode est plus rapide est permet de retarder le calcul des images finales en stockant les données prétraitées dans un espace intermédiaire. On peut ainsi enregistrer des séquences de 30 secondes à 1 minute à une cadence de 1 image toutes les 0.8 secondes. Le temps de traitement est ensuite compris entre 5 et 10 minutes en fonction de la qualité des images. Ces deux modes d’imagerie sont utilisés pour acquérir différents types de données. Les épisodes de thêta étant courts (quelques secondes), nous utilisons majoritairement le mode rapide qui nous permet d’acquérir un grand nombre d’images pendant des périodes réduites. Cette résolution temporelle nous permet ainsi d’étudier plus finement les transitions (début, arrêt) de ces épisodes et nous permet d’avoir plus d’images pour les phénomènes rapides. . Le mode continu est utilisé pour obtenir des activations sur une durée prolongée (effets de l’anesthésie, sommeil) lorsqu’il est pertinent de pouvoir faire des moyennes, ou du moins lorsque l’information est contenue dans des intervalles de temps prolongés. Analyse  du  signal   Détection du mouvement du rat La planche de bois est d’abord détectée manuellement sur la vidéo ; on définit donc sur le film les contours de la planche et l’on restreint l’étude de la vidéo aux pixels contenue dans cette région de l’image. Le mouvement de l’animal est extrait par une méthode de seuillage : le corps de l’animal étant blanc, le fond noir, on obtient une évaluation correcte des pixels correspondant au corps de l’animal en appliquant un seuil : tous les pixels du fond sont donc noirs, et ceux de l’animal sont blancs. On extrait ensuite l’isobarycentre de ces pixels blancs, ce qui donne une estimation correcte du centre de gravité du rat. Les coordonnées de ce point (défini sur chaque image) sont donc retranscrites dans le système de coordonnées de la planche. On extrait ainsi la position et la vitesse instantanée du rat selon chaque axe, ainsi que la vitesse moyenne. Détection de la direction de la tête La direction de la tête est extraite de la détection de deux diodes rouges placées de sorte que le milieu de ces deux points corresponde à la position du coup de l’animal. La médiatrice du segment formé par ces deux points donne la direction de la tête de l’animal ; de plus, on extrait la direction du corps (donné par le milieu des diodes et le barycentre de l’animal). Ceci nous permettra notamment d’accéder à l’angle tête-corps et à une estimation de la vitesse angulaire de cette variable. On munit le câble d’un accéléromètre nous donnant l’accélération instantanée de la tête dans chacune des directions de l’espace. On extrait un signal proportionnel à la puissance de l’accélération totale, qui reflète donc l’importance des variations de vitesse de la tête de l’animal. Le signal issu de l’accéléromètre étant très sensible, il est filtré par un filtre passe-bas afin d’éliminer tous les mouvements parasites. Extraction des épisodes de thêta Le rythme thêta est détectable à l’œil nu sur l’EEG (oscillations de grandes amplitudes, sur de multiples canaux, sur une dizaine de périodes). Sa détection automatisée peut être réalisée de plusieurs manières. Ici, nous avons tout d’abord filtré le signal EEG de chaque canal dans la bande thêta (4- 12Hz) puis effectué une convolution de ce signal élevé au carré. La moyenne des 5 canaux est alors utilisé comme indice de puissance thêta. En effet, la convolution du signal filtré dans la bande thêta avec un noyau gaussien est une mesure de l’intégrale temporelle de ce signal et donc une mesure de la puissance de thêta. Nous obtenons un indice de puissance de thêta si nous divisons le signal obtenu par la puissance totale. Cet indice est utilisé par la suite pour les études corrélatives subséquentes.
  • 19. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 19 Figure 2.7 : Différentes étapes du protocole d’analyse Acquisition des la vidéo (A) Traitement automatique des images (B) Détection de la direction de la tête (C) Détection des trajectoires (D) Imagerie fUS (E) Recalibrage par atlas stéréoxique (F) Enregistrement synchronisé (G) Recherche des régions d’intérêt Les études de corrélation présentées plus bas permettent d’extraire des régions d’intérêt. Tout d’abord nous recherchons les régions dont l’activité fUS corrèle avec l’indice de puissance de thêta. Il s’agit d’effectuer une analyse statistique sur les différents animaux enregistrés. Nous examinons d’une part les corrélations trial-to-trial pour chaque individu. Il est probable d’obtenir des régions dont la vascularisation a été altérée par l’intervention chirurgicale. Ainsi, nous opérerons deux contrôles : analyser des épisodes EEG quelconques et vérifier que ces mêmes régions ne ressortent pas puis opérer une analyse inter-individuelle pour s’affranchir des particularités de chaque animal. Les régions observées en fUS seront systématiquement identifiées à l’aide d’un atlas stéréotaxique, notamment pour l’étude inter-individuelle, les plans d’imagerie pouvant être différents d’un animal à l’autre. Nous extrairons de plus les régions du cerveau qui corrèlent à l’activité hémodynamique de l’hippocampe. En effet, nous bénéficions d’un outil permettant d’établir une carte de corrélation du signal fUS avec l’activité d’une région (définie à la main comme un ensemble de pixels). Ainsi nous pouvons par exemple analyser les asymétries en regardant les régions dont le signal fUS corrèle avec l’activité de l’hippocampe gauche ou droit. Il est à noter que c’est un outil différent de l’étude corrélative fUS-EEG. La combinaison de ces deux outils permet donc de relier l’activité électrique observée à l’EEG et les activations hémodynamiques observées au moyen du fUS. Enfin, il est aussi intéressant d’examiner les corrélations fonctionnelles entre les différentes régions et leur implication dans la précession, le début ou l’arrêt d’un épisode de thêta. Il convient donc de classifier les différents épisodes en fonction de leur longueur puis de les calibrer sur le démarrage de l’épisode de thêta (on utilise un seuil pour l’indice de puissance de thêta). Ainsi, en analysant la covariance des différentes images fUS correspondant à un délai particulier, nous extrayons les régions activées spécifiquement et potentiellement impliquées dans la génération ou l’arrêt d’un épisode.  
  • 20. 20 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Figure 3.1 : Signaux étudiés pour la navigation spatiale Signaux bruts EEG (A) Filtrage de chaque canal dans la bande thêta (B) Vitesse de rotation de la tête du rat (C) Vitesse axiale de l’animal (D) Signal d’acceleration provenant d’un accéléromètre sur 3 axes (E) Résultats Etude des variables de la navigation spatiale Signaux étudiés Les résultats présentés dans cette section ont été réalisés sur des animaux préparés pour une implantation hippocampique dorsale seule (trois électrodes dans chaque hippocampe dorsal). Comme présenté dans la partie, de nombreuses variables associées à la mobilité de l’animal et au comportement exploratoire sont extraites. Nous avons centré notre étude sur 3 variables : la vitesse de l’animal, la vitesse de rotation de la tête. Leurs tracés typiques pour une période de 30 secondes sont présentés sur la figure 3.1. Chacune de ces variables est étudiée relativement à l’indice de puissance de thêta. Le choix de ces variables s’explique par le fait qu’elles jouent un rôle important dans la navigation spatiale. L’examen des corrélations observées nous permet de confronter les hypothèses avancées sur le rôle du thêta et son implication dans la navigation spatiale. Plus précisément, le lien thêta-vitesse est crucial pour examiner le rôle du thêta dans la locomotion. Le lien entre thêta et variation de direction de la tête pourrait jouer un rôle dans l’exploration et l’intégration de données sensorimotrices, lorsque le rat renifle par exemple ou lorsqu’il explore son environnement. De plus, le signal d’accélération nous permet de savoir si le thêta est important lorsque l’animal doit gérer un flot d’informations sensorielles fortement changeant. Comme lors des phénomènes de précession de phase, le thêta peut jouer le rôle d’une horloge de référence globale pour les informations sensorielles. Il est important de préciser qu’il convient de filtrer le signal d’accélération. Les très hautes fréquences observées sont causées par des mouvements parasites lorsque le rat mange ou gratte la boite. Etudes de corrélation Lien thêta-vitesse Les corrélations présentées ici sont calculées à partir de données obtenues sur 10 animaux enregistrés séparément pendant 1 heure. On calcule la corrélation à partir des variables continues (bien que les
  • 21. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 21 images soient numériques on dispose de la position du rat à chaque image de la vidéo et du signal EEG encore plus souvent, on peut donc considérer que les corrélations sont calculées sur la base d’un signal continu). On obtient donc un coefficient de corrélation pour chaque animal. On obtient ainsi un coefficient de corrélation moyen de 0.1053 et un écart-type 0,151. Cette corrélation est significative (P<0.01) pour la taille de l’échantillon observé. Cela suggère qu’il existe un lien entre déplacement et thêta cependant celui-ci n’est pas aussi fort qu’attendu. Les valeurs de l’écart-type estimé sur dix animaux suggèrent que les variabilités interindividuelles sont importantes.       Lien thêta-accélération Les variabilités inter-individuelles observées jouent aussi un rôle sur le coefficient de corrélation moyen pour le lien thêta accélération. Il est de 0,1475 et son écart-type estimé pour 10 individus est de 0,308. On peut classer les individus en 3 classes nettes : ceux dont la corrélation est négative (-0,24 -0,32 - 0,17) ceux pour lesquels elle est proche de zéro et une corrélation très forte (0,38 0,41 0,55 0,42) pour 4 individus. Une explication probable de ces différences tient au fait que le lien thêta-accélération (tel qu’il est mesuré ici) est plus sensible à la position exacte des électrodes dans l’hippocampe. Si l’animal n’est pas implanté correctement (l’électrode peut descendre trop profondément ou même ne pas être stable), il est possible que cela donne une grande variabilité de mesure. On voit ici que le lien étudié est moins robuste que le précédent bien que plus accentué. Figure 3.2 : Corrélats comportementaux du rythme thêta Tracé de la puissance du theta en fonction de la vitesse du rat (A) de l’accéleration (B) et de la direction de la tete (C)N = 10 animaux, 1h d’enregistrement
  • 22. 22 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Lien thêta-vitesse de direction de la tête Le coefficient de corrélation moyen calculé pour 10 individus est très faible. Son écart-type est de 0,089 ce qui est bien inférieur à ceux observés plus haut. Il semble donc qu’il n’existe pas de lien fonctionnel entre la puissance de thêta et la vitesse de direction de la tête. Influence sur la mobilité Le thêta semble donc lié à la fois à la vitesse de l’animal et à son accélération. Ces résultats sont consistants avec les résultats précédents suggérant un rôle majeur du thêta dans la locomotion et dans l’intégration de l’information spatiale. Pour relier le rythme thêta aux activations observées en fUS, il semble crucial de pouvoir se rapprocher des conditions de mobilité obtenues pour les enregistrements EEG classiques sur l’animal mobile. La taille (8cm) et le poids de la sonde (50g), l’inélasticité du câble, le bruit de la machine et le fait que l’animal sente que son mouvement naturel est entravé au niveau de la tête sont des obstacles majeurs à la mobilité. Il faut un temps important avant de pouvoir observer l’animal se déplacer librement dans la boîte. Cependant, il est possible d’obtenir une certaine mobilité selon différents moyens. Lorsque l’environnement lui devient familier (par exemple lorsqu’il y a déjà couru librement) le rat se déplace plus spontanément. De plus, nous avons mis en place une méthode basée sur la récompense qui stimule l’exploration permettant ainsi de stimuler les comportements écologiques de navigation spatiale. La différence de mobilité moyenne entre les deux conditions est tout de même très significative. L’animal marche en moyenne 3 fois que dans la condition où il ne porte pas la sonde sur la tête. Comparaison statistique animal éveillé/anesthésié Contraste Mobile (M) / Anesthésie Nous présentons ici les résultats obtenus sur 3 animaux enregistrés dans les mêmes conditions d’éclairage et de bruit à 1h d’intervalle. L’animal est anesthésié à l’isoflurane (2g.L-1) et l’on enregistre 500 images (1 image toutes les 3 secondes, 25 mn d’enregistrement) avec la sonde fixée sur la tête de l’animal. Le second enregistrement a lieu 35 minutes après sur l’animal mobile dans sa cage. Un délai minimum de 15 minutes est respecté entre l’éveil de l’animal et la deuxième session d’enregistrements. Les résultats sont présentés sur la figure 3.1. Figure 3.3 : Différence moyenne de mobilité du rat avec et sans fUS
  • 23. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 23 On observe deux effets majeurs sur les contrastes entre les deux conditions. La majorité des pixels est plus activée dans la condition anesthésiée. Les fluctuations positives sont obtenues pour des pixels situés au dessus de la méninge. On n’observe pas de différence majeure entre les structures profondes et le cortex et les images de contraste sont relativement symétriques. Au niveau du sinus veineux on observe une vasodilatation importante dans la condition anesthésiée. Cet effet est aussi présent au niveau des grosses artères qui traverse le cortex longitudinalement, ce qui a pour effet d’introduire des « reflets » sur l’image de contraste [C]. Il est peu probable que cela soit du a un déplacement de la sonde. Nous avons en effet recalculé l’image moyenne (M) afin que le cross-corrélogramme entre les deux conditions soit centré. Ceci ne fait pas disparaître les contrastes observés. Enfin le contraste [C] fait apparaître l’hippocampe suggérant une différence significative entre les deux conditions, ce qui est analysé en détails plus loin. Profil des données Les coupes coronales sont découpées en douze régions : cortex gauche (3), cortex droit (3), hippocampe gauche et droit (2) thalamus dorsal gauche et droit (2) et thalamus ventral gauche droit (2), de sorte que le nombre de pixels par région soit relativement constant. On calcule ensuite pour chaque image la valeur moyenne des pixels sur une région donnée. On passe ainsi de 90x128 valeurs à 12 valeurs pour chaque image. La figure 3.2 récapitule la distribution des données. Figure 3.3 : Différence de contraste dans les conditions mobile (M) et anesthesié (A) Les deux premières figures (A, B) représentent l’image moyenne calculée à partir de la valeur moyenne de chaque pixel pour les 500 images respectivement dans la condition mobile (M) et anesthésié (A). La figure (C) donne le contraste M-A/M. L’échelle de couleurs est comprise entre -0,76 et 2,81. La figure (D) est une image binaire donnant les pixels dont la différence de moyenne entre les conditions est positive (rouge : M>A, 2917 pixels) et négative (bleu : M<A, 8203 pixels). Les figures E et F donnent l’auto-corrélogramme dans la condition (A) (auto-corrélogramme de l’image moyenne) et le cross-corrélogramme entre les conditions. On observe une différence due à la condition mobile. La variation des centres des corrélogrammes est inférieure à 1 pixel.
  • 24. 24 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Figure 3.4 : Représentations graphiques des données brutes pour chaque condition (A) et (M) La ligne supérieure est associée à la condition (M) et la ligne inférieure est associée à la condition (A). On a regroupé l’image moyenne pour chaque pixels sur les 500 images [A, E]. Les fluctuations temporelles des 12 variables aléatoires sont données sur les figures [B, F]. Les histogrammes des figures [C, G] donnent le nombre de pixels par région en fonction de l’intensité. Les graphes [D, G] donnent l’écart-type de chaque pixel en fonction de sa valeur moyenne. N = 500 images. Code couleur : (bleu, cortex), (rouge, hippocampe), (vert, thalamus), (noir, moyenne des 12 régions). Dans la condition (A) les fluctuations sont faibles. Le niveau de base de chacune des régions est stable. On observe une ségrégation des différentes régions en fonction de leur niveau de base. Plus la structure est profonde plus la moyenne est faible (la sensibilité du signal fUS diminue avec la profondeur). Les variations du cortex sont importantes et l’on observe une différence de niveaux de base entre le thalamus droit et le thalamus droit. Les deux hippocampes sont stables et leur niveau de base diffère de la même manière. Dans la condition (M), on retrouve le profil de ségrégation observé sous anesthésie. Mais les moyennes des régions ne sont pas stationnaires : on observe en effet des « bouffées » d’activité sur des périodes de 40-50 images (2 à 3 minutes). Ces fluctuations sont encore plus importantes pour les structures profondes. Il est peu probable que ceci soit dû à des artefacts liés au mouvement de l’animal car cela concerne des intensités moyennées calculées sur un grand nombre de pixels. On retrouve la ségrégation observée précédemment sur les histogrammes de répartition. La distribution de l’écart-type par rapport à la moyenne (basés sur l’estimation dans l’échantillon observé) donne une mesure de la variabilité des pixels observés. On observe une réduction de l’étendue de ce nuage de points dans la condition (A). Ainsi dans la condition (M), la classification statistique par région est plus évidente alors que la distribution a tendance à s’uniformiser sous la condition (A). Analyse statistique La figure 3.3 présente a comparaison des moyennes, variance et écart-type dans les différentes régions entre les deux conditions. On observe deux effets majeurs : une augmentation de la moyenne entre la
  • 25. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 25 condition (A) et (M). Ceci est dû à la vasodilatation des vaisseaux sanguins par l’isoflurane. On montré que le signal fUS est proportionnel au volume sanguin. Ainsi, il est naturel d’observer une augmentation de la moyenne pour toutes les régions. Cet effet, moins évident sur les images de contraste est massif et généralisé à l’ensemble du cerveau (les tests de significativité donnent P<0.001 pour 11 des 12 régions observées). Il est encore plus prononcé lorsque la région se trouve proche de grosses artères (thalamus dorsal gauche). Le deuxième effet majeur est la réduction de la variance par passage à la condition (A). En effet, comme observé précédemment le signal fUS mobile présente une ligne de base fortement variable. Ceci affecte énormément le facteur variance. Comparées aux données régulières de la condition (A), cet effet est amplifié lorsque la région a une ligne de base faible. Pour l’hippocampe droit, l’écart-type augmente d’un facteur 10. Cet effet se retrouve dans la mesure du coefficient de variation et par le déplacement systématique du centre des régions sur le graphe 4A. Ces données présentent des différences majeures entre les conditions (A) et (B) pour les statistiques de premier ordre. Plusieurs facteurs explicatifs sont à prendre en compte. La différence de sensitivité en fonction de la profondeur accentue ces effets pour les structures profondes car les variations par Figure 3.5 : Analyse statistique de la différence entre les conditions mobile (M) et anesthesié (A) (A) Ecart-type en fonction de la variance Représentation de la moyenne pour chaque région dans la condition A et M. Le symbole gras correspond à la condition (A) (B, C, D) Diagrammes en barres de la moyenne, l’écart-type et le coefficient de variation de chaque région. Les régions sont indexées en abscisse (C1L, C2L, C3L)= cortex gauche (C1R, C2R, C3R)= cortex gauche (HL, HR) hippocampes gauche et droit (TTL, TTR) thalamus dorsal gauche et droit (TL, TR) thalamus droit et gauche (WHOLE) ensemble du cerveau.
  • 26. 26 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   rapport au niveau de base plus faible que pour les autres régions affectent d’autant plus le calcul de la variance. La mobilité de l’animal introduit des artefacts de mouvement pour les régions proches des méninges. En effet, à cause de l’intervention chirurgicale et de l’absence d’os sur le haut du crâne, la circulation au niveau des méninges est plus importante même lorsque celles-ci sont préservées. L’anesthésie elle-même provoque une dilatation des vaisseaux qui augmente les moyennes observées. Il est possible que l’anesthésie ait un effet sur la faible variance observée, car lorsque les vaisseaux sont dilatés de manière chronique, l’afflux de sang un effet physiologique moindre, ce qui entraîne un signal fUS moins variable sous anesthésie (notion de seuil d’élasticité des vaisseaux sanguins). Le facteur principal de cette analyse est la non-stationnarité du signal et l’observation de ‘bouffées d’activité’ qui modifient radicalement le niveau de base du signal fUS dans la condition ‘animal éveillé’. Celles-ci correspondent à des modes (à rapprocher des états hauts et bas observées en électrophysiologie) pendant lesquels les statistiques du signal sont très différentes. Ainsi, les moyennes et variances calculées sur de grands échantillons et de longues périodes (comme c’est le cas dans notre étude) ne reflète pas la vraie distribution du signal. En effet il convient de faire des moyennes glissantes sur des périodes plus afin de détecter les variations du niveau de base, sans quoi les fluctuations observées cachent les variations fonctionnelles potentielles lors des épisodes de navigation spatiale. Corrélations  fonctionnelles  fUS   Les résultats présentés dans cette partie sont préliminaires. Pour des raisons d’ordre pratique, il n’a pas été possible d’analyser les données de manière exhaustive. Cependant, les données présentées donnent des résultats prometteurs et valident la démarche initiale malgré les obstacles techniques rencontrés. Figure 3.6 : Cartes de corrélation du signal fUS /EEG Les signaux EEG de 4 électrodes hippocampiques filtrées dans la bande thêta. N=1. Les pixels ont un coefficient de Spearman supérieur ou égal à 2
  • 27. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 27 Recherche de pixels d’intérêt corrélant avec les indices de navigation spatiale La figure montre quatre cartes corrélatives pour chaque pixel de l’image sur un enregistrement de 500 images pour un animal. Ici, nous utilisons le signal EEG de chaque électrode, filtré dans la bande thêta. En procédant de la sorte, on s’affranchit du moyennage sur les différents canaux, procédure qui résulte en une perte d’information du signal source. On calcule ensuite les corrélations pour chaque pixel de l’image. Les corrélations présentées en rouge sur le graphique correspondent à un coefficient de corrélation supérieur à 0.2. Les deux hippocampes corrèlent significativement (P<0.01 pour 500 images) pour 3 des 4 canaux étudiés. Il s’agit ici d’un phénomène chronique observé sur une période de temps prolongée. Les variations du signal fUS reflètent le signal neuronal observé à l’EEG. Il s’agit ici de la première piste pour comprendre le lien entre l’activité neuronale de groupe observée en EEG intracrânien et le signal fUS. Nous observons le même type de cartes pour d’autres animaux. Analyse par régions Une autre méthode pour comprendre le lien entre le signal fUS et activité neuronale consiste à examiner les corrélations entre régions d’une part et les corrélations croisées avec les variables étudiées précédemment (accélération, vitesse, direction de la tête). Nous présentons ici les données pour le même animal que celui présenté plus haut. Dans un premier temps, nous établissons des cartes d’auto-corrélation inter-régions pour le signal fUS. La figure montre ces résultats : on retrouve la ségrégation observée dans la partie 2 entre le cortex (les 5 premières zones de la carte), l’hippocampe et le thalamus. Le signal fUS moyenné sur toutes les régions corrèle fortement avec 11 d’entre elles (sauf le thalamus dorsal gauche), ce qui suggère que les variations de l’ensemble des régions se retrouve dans le profil moyen. Autrement dit, pour cet Figure 3.5 : Matrices d’auto corrélation et de corrélation croisée pour les signaux fUS Les régions sont indexées en abscisse (C1L, C2L, C3L)= cortex gauche (C1R, C2R, C3R)= cortex gauche (HL, HR) hippocampes gauche et droit (TTL, TTR) thalamus dorsal gauche et droit (TL, TR) thalamus droit et gauche (WHOLE) ensemble du cerveau. Abscisse du cross-corrélogramme : vitesse du corps, vitesse angulaire de la tête, Accélération basse fréquence et haute fréquence, Canaux EEG.
  • 28. 28 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   enregistrement, nous observons le même type de fluctuations par ‘bouffées’ qui affectent le niveau de base de chaque région. Ainsi le signal moyen observé en fUS est une forme de patron du signal de chaque région, mais l’information contenue dans chaque région est plus complexe. Ainsi, bien que toutes les zones corrèlent le signal fUS moyen, elles ne corrèlent pas aussi fortement entre elles. Le corrélogramme croisé présenté dans la seconde figure correspond au même animal. Pour les huit signaux étudiés ici, respectivement vitesse, vitesse de direction de la tête, accélération basse fréquence (entre 1 et 10Hz) et haute fréquence (supérieur à 100Hz), et les puissances des 4 signaux EEG de l’hippocampe, filtrés dans la bande thêta. On remarque que le corrélogramme présente de fortes régularités selon l’axe vertical, ce qui suggère une indifférenciation des régions par rapport aux signaux de la navigation spatiale. A nouveau, l’hypothèse probable est que la non-stationnarité du signal fUS empêche de pouvoir détecter les petites variations qui pourraient refléter des différences entre les régions. Cependant, l’hippocampe est la seule région significativement corrélée à l’ensemble des quatre canaux de l’EEG, ce qui explique qu’elle ressorte si fortement pour l’analyse de pixels individuels. En conclusion nous voyons que les activations individuelles significatives se retrouve dans le corrélogramme croisé pour les régions. C’est un résultat attendu car si tous les pixels d’une région corrèlent fortement à un signal donné il est normal que le signal moyen de la région fasse de même. Cependant la réciproque n’est pas vraie. Nous venons d’établir une mesure indirecte du lien entre activité neuronale observée à l’EEG et signal fUS. Les mécanismes impliqués dans l’interaction de ces structures sont complexes, mais le développement de nouvelles approches permet ce genre d’études.  
  • 29. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 29 Discussion Le principal objectif de mon stage a été atteint puisqu’il a été possible d’enregistrer une activité cérébrale de façon minimalement invasive à l’aide des ultrasons (fUS) sur un animal mobile. J’ai mis au point un système de fermeture étanche et durable du volet crânien, ainsi qu’un système d’ancrage de la sonde ultrasonore. J’ai appris à maîtriser l’implantation stéréotaxique d’électrodes hippocampiques, que j’ai adapté pour passer sous la couverture du volet. Une trentaine de rats m’ont permis de mettre au point la technique et procéder à des enregistrements simultanés EEG, vidéo et fUS. Les questions que je souhaitais aborder ont ainsi obtenu des éléments de réponse expérimentale. A l’aide d’enregistrements en EEG-vidéo j’ai pu corréler les différents marqueurs de la navigation spatiale, en reliant les paramètres objectifs de mobilité et l’activité cérébrale. Il est apparu que le rythme thêta est surtout relié à l’accélération de la tête, un peu moins à la vitesse du rongeur, et presque pas à la direction de sa tête. Dans un deuxième temps j’ai ajouté une sonde ultrasonore au dispositif expérimental, en vérifiant la qualité des images et en explorant les conséquences physiologiques de l’absence d’anesthésique. J’ai observé que le cerveau éveillé présente une dynamique d’activité plus ample que le rat sédaté, et ce de façon générale à travers les différents grands domaines cérébraux. Enfin mes dernières analyses portaient sur la recherche de région cérébrale associée au rythme thêta. Mes résultats préliminaires suggèrent que l’hippocampe et le principal puits métabolique pendant l’activité thêta, même si le cortex sensoriel semble potentiellement impliqué. Plusieurs réserves et observations doivent être considérées en rapport avec les données recueillies. La plus évidente est la mobilité réduite des rats portant une sonde ultrasonore. La masse de la sonde disponible était d’environ 50 en 50-100g pour la partie proximale du câble. Le stage a été rendu plus compliqué par la casse inopinée de la sonde initialement prévue, d’une masse plus légère (environ 30g). Toutefois, les résultats observés sont surtout intéressants pour la qualité de l’image, tant il n’était pas évident que la stabilité mécanique serait suffisante. La question de mobilité de l’animal peut être résolue dans un deuxième temps en allégeant la sonde. En effet, la partie active de la sonde les 128 éléments transducteurs ultrasonores, ne pèsent que quelques grammes. Le gros de la masse des sondes actuellement disponibles se trouve dans le boitier, conçu dans une logique de maniabilité plutôt que de miniaturisation. Des sondes plus légères sont en phase de conception, incluant également l’utilisation de câble plus léger. Enfin il est à noter que même avec une mobilité réduite la technique mise au point peut apporter un avantage pour étudier les phénomènes altérés par l’anesthésie, comme les épilepsies, les trauma, etc. La question de la nature du signal observé avec le fUS est souvent posée depuis la communauté d’IRM et MEG, bénéficiant de plus de recul que la jeune technique de fUS. Des calculs théoriques et des données expérimentales en court de publications montrent que le signal le plus robuste utilisable en imagerie ultrasonore est le Doppler de puissance, dont le signal est proportionnel à la quantité d’échogène (essentiellement globule rouge) dans un voxel, ce qui correspond à la fraction de volume sanguin (CBV). Ainsi le fUS présente la caractéristique de ne pas dépendre du degré d’oxygénation du sang. Cela rend l’interprétation de la mesure plus simple, tout en limitant le champ d’études aux phénomènes induisant une vasodilatation ou une vasoconstriction. L’effet vasodilatateur de l’isoflurane est connu. On est peu surpris par la comparaison entre le régime anesthésié et le régime éveillé. Néanmoins, mes observations illustrent bien le fossé séparant les différents contextes expérimentaux. Au lieu d’étudier des mécanismes encadrés par des protocoles ciblés sur telle ou telle modalité, l’observation fait face à un signal riche et plus complexe à analyser. En particulier l’hypothèse de stationnarité n’est plus automatiquement acquise. Une partie de la variance du signal peut provenir non pas des variables imposées à l’animal ou même observées dans son comportement, mais à des états internes naturellement fluctuant. Mes observations de pixels corrélés à
  • 30. 30 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   la puissance du rythme thêta sont présentées à titre d’observations préliminaires, tant il me semble utile d’approfondir la question des tests de significativité pour un régime non stationnaire. L’étude par fUS- EEG-vidéo, ne nécessitant pas d’agent de contraste, permet une observation en continu et de longue durée. Des outils d’analyse adaptés sont à développer pour ce contexte expérimental. Les perspectives de ce travail sont multiples. J’ai montré la faisabilité de l’imagerie sur le rat éveillé et mobile. Sur le plan cognitif, cette approche offre un avantage considérable par rapport au rat immobilisé dans une IRM ou sous un cadre de microscope deux-photons. De nombreux tests cognitifs peuvent être imaginés, avec l’obstacle éventuel d’une complexité excessive des phénomènes en jeu par rapport à la sensibilité modérée d’une technique indirecte de mesure de l’activité cérébrale à travers les variations de débit sanguin. La pratique permettra de préciser la limite de sensibilité de la technique que j’ai mise au point, et d’adapter les protocoles comportementaux et la durée des enregistrements aux questions abordées. Sans aucun doute le fUS est une voix prometteuse, complémentaires des autres techniques d’étude des mécanismes du comportement chez le rongeur.
  • 31. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 31 Bibliographie   Alonso, A. & Garcia-Austt, E. (1987a). Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res 67, 493-501. Alonso, A. & Garcia-Austt, E. (1987b). Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. II. Phase relations between unit discharges and theta field potentials. Exp Brain Res 67, 502-9. Battaglia F and McNaughton B L, Polyrhythms of the Brain, Neurone 72, Pages 6-8, 6 Octobre 2011, doi : 10.1016/neuron.2011.09.019. Benchenane K, Peyrache A, Khamassi M, Tierney PL, Gioanni Y, Battaglia FP, and Wiener SI, Coherent Theta Oscillations and Reorganization of Spike Timing in the Hippocampal-Prefrontal Network upon Learning, Neuron 66, Pages 921-936, 24 Juin 2010, doi: 10.1016/j.neuron.2010.05.013. Benchenane K, Tiesinga PH and Battaglia FP, Oscillations in the prefrontal cortex: a gateway to memory and attention, Current Opinion in Neurobiology, 2011, 21:475-485, doi: 10.1016/j.conb.2011.01.004. Berg RW, Whitmer D and Kleinfeld D, Exploratory Whisking by Rat Is Not Phase Locked to the Hippocampal Theta Rhythm, The Journal of Neuroscience, 14 Juin 2006, 26 (24) : 6518-6522 Bland BH, Oddie SC, Theta band oscillation and synchrony in the hippocampal formation and associated structures: the case for its role in sensorimotor integration, Behavioural Brain Research 127 (2001), Pages 119-136 Bullock, T. H., Buzsaki, G. & McClune, M. C. (1990). Coherence of compound field potentials reveals discontinuities in the CA1-subiculum of the hippocampus in freely-moving rats. Neuroscience 38, 609- 19. Burgess N and O’Keefe J, Models of Place and Grid Cell Firing and Theta Rhythmicity, Current Opinion in Neurobiology, 21(5) : 734–744, Octobre 2011, doi:10.1016/j.conb.2011.07.002. Buzsaki, G. (1986). Hippocampal sharp waves: their origin and significance. Brain Res 398, 242-52. Buzsaki G, Theta Rhythm of Navigation: Link Between Path Integration and Landmark Navigation, Episodic and Semantic Memory, Hippocampus 15:827–840 (2005), doi : 10.1002/hipo.20113. Buzsaki G, Neuronal Oscillations in Cortical Networks, Science 304, 1926 (2004), doi: 10.1126/science.1099745. Ekstrom AD, Caplan JB, Ho E, Shattuck K, Fried I, and Kahana MJ, Human Hippocampal Theta Activity During Virtual Navigation, Hippocampus 15:881–889 (2005), doi: 10.1002/hipo.20109 Ekstrom AD, Suthana N, Millett D, Fried I and Susan, Correlation Between BOLD fMRI and Theta-Band Local Field Potentials in the Human Hippocampal Area, Journal of Neurophysiology 101:2668-2678, 2009, doi: 10.1152/jn.91252.2008. Fox, S. E., Wolfson, S. & Ranck, J. B., Jr. (1986). Hippocampal theta rhythm and the firing of neurons in walking and urethane anesthetized rats. Exp Brain Res 62, 495-508. Hasselmo ME, Hay J, Ilyn J, Gorchetchnikov A, Neuromodulation, theta rhythm and rat spatial navigation, Neural Networks 15 (2002) 689–707
  • 32. 32 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Hasselmo, ME (2005). "What is the Function of Hippocampal Theta Rhythm?–– Linking Behavioral Data to Phasic Properties of Field Potential and Unit Recording Data". Hippocampus 15 (7): 936–49 Hyman JM, Hasselmo ME and Seamans JK, What is the functional relevance of prefrontal cortex entrainment to hippocampal theta rhythms, Frontiers in Neuroscience (5) Art. 24, 2011, doi: 10.3389/fnins.2011.00024. Macé E, Montaldo G, Cohen I, Baulac M, Fink M and Tanter M, Functional ultrasound imaging of the brain, Nature Methods, 2011, doi:10.1038/nmeth.1641. Mitchell, S. J. & Ranck, J. B., Jr. (1980). Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res 189, 49-66. Wang Xiao-Jing, Pacemaker Neurons for the Theta Rhythm and Their Synchronization in the Septohippocampal Reciprocal Loop, The Journal of Neurophysiology, 87 : 889 – 900, 2002, doi: 10.1152/jn.00135.2001. Womelsdorf T, et al., Modulation of Neuronal Interactions Through Neuronal Synchronization, Science 316, 1609 (2007), doi: 10.1126/science.1139597 Young CK and McNaughton N, Coupling of Theta Oscillations between Anterior and Posterior Midline Cortex and with the Hippocampus in Freely Behaving Rats, Cerebral Cortex, 19 Janvier 2011 :24--40, doi:10.1093/cercor/bhn055 Vanderwolf, CH (1969). "Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat". EEG Clin Neurophysiol 26 (4): 407–418 Vertes, RP (2005). "Hippocampal theta rhythm: a tag for short-term memory". Hippocampus 15 (7): 923–35.
  • 33. Etude de la navigation spatiale par imagerie ultrasonore chez le rat mobile 33 Cho  &  Sharp,  2011 Place   cell Grid  cell Head  direction  cell Annexes                   Figure S1 Cellules de lieu (A) Cellules de grille (B) Cellules de direction de la tête (C)           Figure S2 : Schéma de principe de l’imagerie ultrasonore classique (échographie) Une onde ultrasonore focalisée est envoyée par la barrette échographique sur le milieu à imager. A chaque fois que l’onde rencontre une interface une onde écho est renvoyée sur la barrette. On peut alors remonter à la position de l’interface ayant généré l’écho par la formule permettant la conversion temps-distance (on suppose la vitesse homogène au sein d’un tissu biologique avec c≃1500 m/s) et en déduire sa nature à l’aide de l’enveloppe du signal reçu. On peut utiliser différentes méthodes de focalisation pour obtenir une ligne : utilisation de transducteurs courbés, utilisation de réseaux ultrasonores,... L’image 2D est obtenue en imageant les différentes lignes formant l’image et une image 3D en associant en parallèle différentes images 3D.
  • 34. 34 Mémoire M2 CogMaster - Antoine BERGEL   Figure S3 : Imagerie Doppler classique L’imagerie Doppler classique utilise un faisceau focalisé qui image successivement chaque ligne formant l’image (a). Cette limitation temporelle ne permet pas d’accéder à un niveau de signal sur bruit suffisant pour imager des vaisseaux plus petits que les artères cérébrales principales (b). Figure S4 : Coordonnées du site d’implantation des électrodes en fonction de la distance bregma - lambda