QUÍMICA BIOLÓGICA
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2022
LABORATORIO 9: ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Objetivo: - Determinación de la actividad enzimática de invertasa de levadura de cerveza.
Fundamento: Las reacciones químicas en los sistemas biológicos, raramente ocurren en ausencia de
catalizadores; estos catalizadores son proteínas específicas denominadas enzimas. Casi todas las funciones
celulares dependen directa o indirectamente de ellas. La invertasa de la levadura es una enzima que hidroliza
uniones glicosídicas de fructósidos y, en especial, de sacarosa; en este trabajo práctico se trabajará con
distintas diluciones de extracto enzimático frente a cantidades constantes de sacarosa como sustrato.
La característica de todas las enzimas es su poder catalítico y su especificidad. La cantidad de enzima
presente en un extractivo se mide en unidades de enzima (UE), de acuerdo a la magnitud de los efectos que
dicha enzima produce sobre el sustrato, en condiciones especificadas.
Se llama actividad de una cantidad dada de enzima al correspondiente número de unidades enzimáticas
presentes en esa cantidad. Por acuerdo internacional se define la unidad de actividad enzimática como la
cantidad de enzima que determina la transformación de 1µmol de sustrato por minuto, a 25ºC y en
condiciones óptimas de medida; estas están dadas en función del sustrato sobre el cual actúa la enzima.
La unidad de enzima se da también en función del producto de la reacción catalizada; en este caso se
define la unidad de enzima como la cantidad de extracto enzimático capaz de producir o liberar X µmoles de
producto por minuto, en las condiciones de trabajo.
Para nuestro caso particular definimos la unidad de invertasa (UI) como la cantidad de extracto enzimático
que en 1 mL de mezcla de reacción (sacarosa 0,1mol L-1
, extracto enzimático, buffer CH3COOH-NaCH3COO
0,1mol L-1
, pH 4,6 y temperatura de incubación 40ºC) es capaz de liberar un poder reductor equivalente a
0,3 µmoles de glucosa por minuto, al comienzo de la reacción (por ejemplo, dentro de los 2 primeros minutos
de reacción) y en las condiciones especificadas de trabajo.
La determinación de la cantidad de glúcido reductor presente en una muestra, se basa en el poder
reductor conferido por la existencia de grupos aldehídicos o cetónicos libres (o potencialmente libres), que
en medio alcalino y en caliente, reducen iones metálicos tales como el Cu (II).
En forma general, todo monosacárido u oligosacárido con grupo funcional aldehídico o cetónico libre:

⎯COH ó C=O + Cu (II) + -
OH Cu2O + prod. de oxidación
Esta reacción no es estequiométrica debido a que los glúcidos, en medio alcalino, dan productos de
degradación y cada fragmento puede reducir al ión metálico. A pesar de la complejidad de la reacción, la
oxidación puede emplearse eficazmente para la estimación cuantitativa de azúcares, normalizando
estrictamente las condiciones de la reacción (temperatura, concentración de álcali, concentración de
oxidante y especialmente el tiempo).
En estas condiciones, el conocido Método de Somogyi-Nelson es perfectamente reproducible, y los
resultados son expresados generalmente en términos de poder reductor de glucosa, la cual es los mismos
con el reactivo cuprotartárico, en solución de alcalinidad moderada, a una temperatura de 100°C y en un
tiempo determinado.
El complejo cúprico, en medio alcalino, es de color azul y en presencia del glúcido se forma Cu2 O
(precipitado de color rojo-ladrillo). Este Cu2 O actúa, en frío y en medio ácido, reduciendo al reactivo
arsenomolíbdico, formándose productos de color verde azulado, cuya absorbancia se mide en
espectrofotómetro, a una longitud de onda de 540 nm.
Materiales: tubos de ensayo, gradilla, pipetas, 2 buretas x 25 mL, soporte universal, pinzas para bureta,
embudos, matraces x 10mL y x 100 mL, mortero, espátulas, cubetas de vidrio para espectrofotómetro.

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Reactivos: glucosa 0,1 mol L-1
x 25 mL (Solución madre), glucosa 10-3
mol L-1
(Solución patrón, esta solución
debe ser preparada en el momento de ser usada y no se conserva más de 12 hs en heladera), sacarosa 0,1
mol L-1
x 25 mL, 100 mL de solución buffer de CH3COOH-NaCH3COO 0,1 mol L-1
, pH 4,6
Reactivo de Nelson: Este reactivo se prepara en el momento de usarlo mezclando 12 partes de Solución A +
3 partes de Solución B (esta solución se conoce como reactivo Nelson de uso).
Solución A:
carbonato de sodio anhidro .......... 25 g
carbonato ácido de sodio.............. 20 g
tartrato de sodio y potasio.... ......... 25 g
sulfato de sodio anhidro............... 144 g
agua destilada c.s.p............... .... 800 mL
En Erlenmeyer aforado a 800 mL, se incorpora el carbonato, bicarbonato y tartrato; se disuelve en unos
700 mL de agua destilada.
A la solución, se agrega el sulfato de sodio, agitando a disolución total y controlando que la temperatura
no sobrepase los 37 ºC. Se agrega agua hasta la marca de 800 mL y se homogeneiza. Se trasvasa a un frasco
de color caramelo y se mantiene en estufa a 37°C durante 24 hs. El agua utilizada se debe hervir previamente,
y luego enfriar a temperatura de laboratorio.
Solución B:
sulfato de cobre pentahidratado 4 g
sulfato de sodio anhidro 36 g
ácido sulfúrico concentrado. 1 gota
agua destilada c.s.p. 200 mL
Preparada la solución, se trasvasa a frasco color caramelo y se mantiene 24 h en estufa a 37 °C.
Reactivo de Somogyi :
molibdato de amonio 25 g
ácido sulfúrico concentrado 21 mL
arseniato ácido de sodio 3 g
agua destilada c.s.p. 475 mL
Se disuelve el molibdato de amonio en 450 mL de agua, se agrega el ácido sulfúrico y se incorpora el
arseniato ácido de sodio, que previamente fue disuelto en 25 mL de agua. Se mezcla, y mantiene a 37°C 24
hs. Se guarda en frasco oscuro con tapón de vidrio.
Equipos: Balanza, espectrofotómetro UV-Visible, placa calefactora, termostato
1) Curva de calibración de glucosa
Procedimiento: Siguiendo las instrucciones del protocolo rotule los tubos A-E y agregue a cada uno los
reactivos correspondientes indicados en el protocolo para la curva de calibración a partir de la solución
patrón de glucosa y en ausencia de enzima.
Represente gráficamente Absorbancia leída a 540 nm vs. g de glucosa. La ecuación de la recta obtenida para
esta curva de calibración puede utilizarse para la determinación cuantitativa de azúcares reductores en
cualquier muestra desconocida.

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Protocolo para Curva de Calibración de Glucosa y para determinar cuantitativamente el contenido de
hidratos de carbono con poder reductor (utilizando el método de Somogyi-Nelson) que se han obtenido como
producto de la hidrólisis enzimática de la sacarosa en presencia de invertasa.
Actividad Enzimática Curva de Calibración (Glucosa)
Tubos B.E1
1 2 3 4 B.G2
A B C D E
Sac.
0,1M
0,5 0,50 0,50 0,50 0,50 --- ---- --- --- --- ---
Gl.
Pat.
10-3
M
--- --- --- --- --- --- 0,10 0,25 0,50 0,70 1,00
Buffer
HAc-
Ac
0,1 --- --- --- --- 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 ---
A.D. 0,4 0,40 0,40 0,40 0,40 0,90 0,80 0,65 0,40 0,20 ---
Ext.
Enz.
--- 0,1
(1/16)
0,1
(1/8)
0,1
(1/4)
0,1
(1/2)
--- --- --- --- --- ---
Volfinal 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Incubar a 40ºC 2 minutos y enfriar 3
--- --- --- --- --- ---
Nelson
de uso
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
A.D 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
4
15 minutos-100ºC, luego enfriar
Rvo
Som.5
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
A.D. 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Absor
b.
540 nm
1-
Blanco de enzima; 2-
blanco de glucosa; 3-
agregar inmediatamente el reactivo Nelson de uso para detener
la reacción enzimática por la presencia de OH- necesarios para que el hidrato de carbono reductor se oxide,
4-
colocar todos los tubos en gradilla metálica tapados con una bolita de vidrio y sumergirlos juntos en el baño
de agua en ebullición. Transcurridos los 15 minutos, se enfrían en chorro de agua de canilla; 5-
rotar
suavemente cada tubo para lograr la redisolución del Cu2O precipitado y reducción del arsenomolibdato.
Una vez disuelto el precipitado, se incorpora el agua destilada y se homogeneiza por inversión suave hasta
que cese el desprendimiento de burbujas.
2) Obtención del extracto enzimático crudo a partir de levadura de cerveza
Procedimiento: Se pesan 5 gramos de levadura fresca prensada de panadería y se coloca en un mortero
de vidrio o porcelana. Se incorporan 0,5 g de (NH4)2HPO4 y 1 mL de tolueno disgregando bien la levadura,
hasta que la pasta esté perfectamente homogénea. Se deja reposar 15 minutos en baño de agua a 35ºC.

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Luego se van agregando, en pequeñas porciones, 95 mL de agua destilada (precalentada a 35 ºC) mientras
se homogeneiza la pasta con el pilón del mortero procurando deshacer y suspender bien todo el material.
Se trasvasa a Erlenmeyer y se deja reposar 15 min. a 35 ºC, con agitación ocasional. Se incorpora
cuidadosamente el sobrenadante límpido a tubos cónicos de centrífuga y se centrifuga a 3000 rpm-15 min.
Luego de centrifugar aparecen tres capas: la inferior corresponde a un residuo de restos celulares; la
intermedia corresponde al extracto enzimático y la superior es tolueno. Con pipeta de doble aforo se
atraviesa la capa de tolueno y se extrae la capa intermedia. Al quitar la pipeta conviene secarla exteriormente
para evitar incorporar tolueno al extracto. Con el extracto enzimático crudo se preparan diluciones 1/16, 1/8,
1/4 y ½ utilizando la solución buffer de CH3COOH-NaCH3COO 0,1 mol L-1
, pH 4,6. Mezcle por suave inversión
y evitando la formación de espuma. Conservar en freezer unos mililitros de la dilución ¼ de enzima para ser
utilizada en el TP de cinética enzimática.
3) Determinación de la actividad enzimática de la invertasa de levadura
Procedimiento: Completar los tubos de acuerdo al protocolo (B.E, 1-4) utilizando una solución de sacarosa
0,1 mol L-1
recién preparada.
Los tubos con los diferentes extractos enzimáticos y los tubos del protocolo que contienen sacarosa (1 al
4) se deben pre-incubar a 30-35º C.
Complete de a uno los tubos con el extracto e incube de a uno cada tubo durante 2 minutos en el baño a
40ºC. Continúe el agregado de reactivos como indica el protocolo
Calcule la actividad enzimática de la invertasa de la levadura utilizando la curva de calibración y en función
de la definición de unidad de invertasa.
Interprete con ecuaciones las reacciones químicas que permiten esta determinación.
Extraiga conclusiones acerca de los valores de actividad enzimática determinados en cada tubo.
Informe: Póster para evento científico.
DFR: deseche todos los residuos que contienen Cu en el bidón de sales regenerables.