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POLYMERASE CHAIN
REACTION
La République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche
Scientifique
Université de TISMSSILTE
Travail de faire :
 ARAB FATIMA
 CHAKAR ABD RAHMANE
 LAKAF MALIKA
Dirigé par :
Mm. Setti
sommaire
 Introduction
 Définition
 Historique
 Principe
 La réaction de la PCR:
 Les étapes de la réaction PCR
 La réalisation de la PCR
 Variantes associées à la PCR
 Les Applications de la PC
 Les avantages et les inconvénients de la PCR
POLYMERASE CHAIN
REACTION
1. Introduction :
La PCR est une technique qui a révolutionné la biologie
moléculaire et qui a pris rapidement sa place dans les
laboratoires. Son énorme succès apparait par le nombre
d’articles publiés sur le site PubMed : 438134 articles depuis
sa découverte (pubMed, mars 2018) ce qui donne une idée
assez claire de l’importance de celle-ci dans le monde
scientifique
Dans cette partie nous allons nous intéresser à la PCR, à son principe, à ses
avantages et inconvénients, à son protocole de réalisation et l’instrumentation
PCR
 PCR : La PCR est une technique qui permet la
réplication moléculaire des séquences
d’acides nucléiques ciblées de façon
exponentielle et in vitro, plusieurs millions de
fois en quelques heures.
 . Inventée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel en
1993)
Essor très rapide
utilisation à l’ensemble des laboratoires de biologie moléculaire
moins de 3 ans après sa mise au point
Kary B. Mullis
Découverte en 1983-1985
Prix Nobel de chimie en 1993
L’Historique
 Principe de la PCR
La PCR est une suite de cycles, qui se
répètent en boucle, comportant chacun
trois paliers de température :
- Température de dénaturation
- Température d’hybridation
- Température d’extension
Composants de PCR
Séquence
cible DNA
dNTPs
A, G, C, T
Mg2+
Le Magnésium
Amorces
DNA polymerase
DNA cible
La séquence cible représente le segment
d'ADN qui sera amplifié (recopié de
nombreuses fois)
Amorces
 Les amorces sont de petits brins
d'ADN d'environ 20 bases, (appelés
oligonucléotides) capables de
s'hybrider de façon spécifique, grâce
à la complémentarité des bases, sur
le brin d'ADN ou sur son brin
complémentaire.
Deoxynucleosides Triphosphate
 Les dNTPs sont des molécules
de base, qui constituent l’ADN,
utilisés par la Taq polymérase
pour la synthèse du nouveau
brin d’ADN complémentaire.
DNA Polymerase
 une polymérase, c'est-à-dire
qu’elle peut synthétiser un
nouveau brin d’ADN à partir du
brin d’ADN matrice après s’être
fixée à une amorce.
. Caractéristiques de certaines ADN
polymérases utilisées pour la PCR
Pourquoi utiliser de la polymérase thermorésistante?
On ne veut pas qu’elle soit dénaturée à l’étape ou l’on
chauffe ADN.
Si elle n’était pas thermorésistante, il faudrait ajouter
de l’enzyme à chaque cycle.
PCR
 Les ions Mg++ se trouvent souvent
dans une solution de MgCl2, ce sont
des cofacteurs de l’enzyme. Ils
permettent son bon fonctionnement
de l’enzyme.
Le Magnésium
Le thermocycleur appareil pour fonction
de chauffer et refroidir un mélange d'ADN
et d'enzymes contenus dans des
microtubes, sur des durées de quelques
secondes à quelques minutes.
Thermocycleur
Calcul de la température de
fusion
Tm= 2 C° X (nombre de bases A et T)+4 C°X
(nombre de bases G et C).
la température de fusion ou Tm (melting temperature). En
pratique, le Tm correspond à la température de dissociation
de 50 % de l’ADN en solution (c'est-à-dire 50 % de l'ADN
est sous forme simple brin et 50 % de l'ADN sous forme
double brin)
Protocole de réalisation de la
PCR
 De manière générale, avant
l’analyse des acides nucléiques ces
derniers doivent être extraits, puis
amplifiés. Nous allons donc
brièvement rappeler les principales
étapes d’analyse d’un échantillon par
PCR
Les étapes de la PCR
 La réaction de PCR se déroule selon trois
principales étapes cycliques :
 1 Dénaturation
 2 Hybridation
 3 Elongation
Polymerase Chain
Reaction
Nombre de cycles
 Le nombre de cycles requis pour une
amplification optimale varie en fonction de la
quantité du matériau de départ.
 La plupart des PCR ne devraient donc
comprendre que de 25 à 35 cycles. À mesure
que le cycle augmente, des produits non
spécifiques peuvent s’accumuler.
 Après 20 à 40 cycles de chauffage et de
refroidissement, plus d’un million de copies de
molécules d’ADN originales s’accumulent.
Cinétique de la PCR
L'évolution de cette amplification peut être représentée par
une courbe . Cette courbe peut être divisée en trois phases
Cinétique de la PCR
 Exponentiel : Le doublement exact du produit
s’accumule à chaque cycle (en supposant une
efficacité de réaction de 100 %). La réaction est
très spécifique et précise
 Linéaire : Les composants de la réaction sont
consommés; la réaction ralentit et les produits
commencent à se dégrader
 Plateau : La réaction s’est arrêtée; plus aucun
produit n’est fabriqué et s’il reste assez
longtemps, les produits de PCR commenceront à
se dégrader.
GEL ELECTROPHORESIS
GEL ELECTROPHORESIS
Retirer les peignes
Couler le gel
Charger les
produits PCR Faire migrer les
produits PCR
Visualiser des produits PCR
sous plaque d ’UV puis
photographier le gel
Bain du gel avec un Intercalant
de l ’ADN (BET ou SYBR green)
Agarose Gel Electrophoresis
 Lorsque la quantité des produits
d'amplification est suffisante, ceux-ci sont
soumis à une électrophorèse en gel
d'agarose
 La visualisation des acides nucléiques se
fait après addition de bromure d'éthidium
(BET), qui se glisse entre les bases des
acides nucléiques (à manier avec
précaution car cancérigène). Le BET va
émettre une fluorescence orangée sous
lumière ultraviolette de longueur d'onde de
312 nm
PCR Product DNA Molecular Marker
 Les fragments amplifiés peuvent être visualisés facilement
après la coloration avec bromure d’éthidium.
 Les fragments d’ADN sont séparés par la charge et les
tailles
 des fragments sont déterminées en comparant à d’ADN
standard
Avantages et inconvénients de la
PCR
Les avantages :
 Pouvoir travailler sur une toute petite
quantité de matériel biologique
(sensibilité)
 Pouvoir travailler sur de l’ADN dégradé
 Pouvoir discriminer entre différentes cibles
(spécificité)
 La rapidité
 La capacité d’analyse
Inconvénients de la PCR
 Risque de contamination par des substances dans le
mélange réactionnel ce qui donne des faux positifs
 Risque d’inhibition de la Taq-polymérase par des
substances telles que les colorants, l'hème ou des
substances d’origine biologiques comme l’urine ou le
liquide céphalorachidien, ce qui donne des faux positifs
 Utilisation du bromure d’ethidium pour la révélation
(agent cancérigène)
 Manipulation post-PCR : PCR et analyse sont deux
étapes séparées
 Coût élevé
Les variantes de la PCR
 La RT-PCR (Reverse
transcriptase-PCR).
 PCR nichée (Nested-PCR).
 PCR quantitative ou PCR en
temps réel –(Quantitative PCR).
 La PCR multiplex (Multiplex-
PCR).
Reverse Transcriptase - PCR
RT-PCR une technique permettant de réaliser une
amplification à partir d’ARN.
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transcription inverse d’un ARNm en ADN
complémentaire( ADNc)
RT- PCR
Nested PCR
Nested PCR est une
amplification PCR très
spécifique.
Nested PCR utiliser deux
paires (au lieu d’une paire)
d’amorces PCR pour amplifier
un fragmen
Nested - PCR
La PCR multiplex
Cette variante de la PCR s’intéresse à
l’amplification d’ADN de différentes
origines (issu de plusieurs échantillons)
dans un seul et même tube. Sa
réalisation exige l’utilisation de plusieurs
couples d’amorces avec des
températures d’hybridation et des
longueurs des produits amplifiés
semblables ainsi que l’utilisation de la
Taq polymérase.
PCR multiplex
Figure 10 : PCR multiplex .
Real Time PCR
Real Time PCR
Real-time PCR La PCR en temps réel est
une révolution dans l’utilisation de la PCR.
Cette technique consiste à mesurer la
quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle
(temps réel) grâce à un marqueur
fluorescent. Elle permet par son principe de
faire des mesures quantitatives ,mais elle
nécessite des thermocycleurs particuliers.
Pour ne confondre avec la RT-PCR (Reverse
Transcription PCR), on préférera donc les
Principe de la PCR en temps
réel
 Marquage du produit au cours de sa synthèse
 Chimies de marquage en temps réel
 Matériel de détection
 Intensité de fluorescence proportionnelle
quantité de produit formé
= Agent intercalant dont l'émission de fluorescence augmente
lorsqu'il est lié à l'ADN double brin
h‫ע‬
F
Après amplification
F
ADN double brin
h‫ע‬
Avant amplification
SYBR Green
Le SYBR Green en solution
émet peu de fluorescence
Durant l'élongation, il se fixe sur l'ADN
double brin naissant, entraînant une
augmentation de la fluorescence
Principe PCR quantitative SYBR ®Green
L'émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque cycle d'élongation
(l'émission de fluorescence décroît lorsque l'ADN est dénaturé à l'étape suivante)
PCR quantitative avec une sonde TaqMan®
Sonde marquée par 2 fluorophores:
- extrêmité 5’ de la sonde = fluorophore donneur
ou émetteur
- extrêmité 3’ = fluorophore extincteur ou
quencher
Le quencher étant à proximité du donneur
inhibe l’émission de fluorescence par ce dernier.
Lorsque la sonde est hydrolysée par la Taq
polymérase, le fluorophore et le quencher
s’éloignent entrainant une émission de
fluorescence proportionnelle à la quantité de
cible hydrolysée.
Principe de la PCR en temps réel Taqman
Reporter
Quencher
- Sonde fluorescente :
- Taq DNA pol :
Activité 5’Exonuclease
 Cette méthode repose sur deux principes :
 -la présence de deux fluorochromes sur la même sonde
 -l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol
-Spécificité l’amorce pour
la PCR
-Spécificité de
l’hybridation de la sonde
TaqMan
lorsque la polymérisation est
complétée, pour chaque molécule
d’ADN synthétisée un reporteur
émet de la fluorescence.
maine d'application de la
PCR
Do
En médecine
la PCR peut être utilisée dans :
 La détection des maladies génétiques
 La détection des mutations au niveau du
génome, leur nature, leurs tailles et leurs
positions
 La détection des maladies infectieuses.
exemples : SIDA, l’hépatite C, ou les
infections à chlamydia
 Le dépistage prénatal comme la trisomie
En biologie cellulaire et
moléculaire
 L’isolement et la purification des gènes
 L’identification des espèces animales et
végétales
 L’identification des microorganismes dans
des tests de qualités alimentaires
 Le clonage moléculaire
 Les tests de paternité
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d’une personne (en criminologie par
exemple)
MERCI POURVOTRE
ATTENTION
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La pcr

  • 1.
  • 2. POLYMERASE CHAIN REACTION La République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université de TISMSSILTE Travail de faire :  ARAB FATIMA  CHAKAR ABD RAHMANE  LAKAF MALIKA Dirigé par : Mm. Setti
  • 3. sommaire  Introduction  Définition  Historique  Principe  La réaction de la PCR:  Les étapes de la réaction PCR  La réalisation de la PCR  Variantes associées à la PCR  Les Applications de la PC  Les avantages et les inconvénients de la PCR
  • 4. POLYMERASE CHAIN REACTION 1. Introduction : La PCR est une technique qui a révolutionné la biologie moléculaire et qui a pris rapidement sa place dans les laboratoires. Son énorme succès apparait par le nombre d’articles publiés sur le site PubMed : 438134 articles depuis sa découverte (pubMed, mars 2018) ce qui donne une idée assez claire de l’importance de celle-ci dans le monde scientifique Dans cette partie nous allons nous intéresser à la PCR, à son principe, à ses avantages et inconvénients, à son protocole de réalisation et l’instrumentation
  • 5. PCR  PCR : La PCR est une technique qui permet la réplication moléculaire des séquences d’acides nucléiques ciblées de façon exponentielle et in vitro, plusieurs millions de fois en quelques heures.  . Inventée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel en 1993) Essor très rapide utilisation à l’ensemble des laboratoires de biologie moléculaire moins de 3 ans après sa mise au point Kary B. Mullis Découverte en 1983-1985 Prix Nobel de chimie en 1993
  • 7.
  • 8.
  • 9.  Principe de la PCR La PCR est une suite de cycles, qui se répètent en boucle, comportant chacun trois paliers de température : - Température de dénaturation - Température d’hybridation - Température d’extension
  • 10. Composants de PCR Séquence cible DNA dNTPs A, G, C, T Mg2+ Le Magnésium Amorces DNA polymerase
  • 11. DNA cible La séquence cible représente le segment d'ADN qui sera amplifié (recopié de nombreuses fois)
  • 12. Amorces  Les amorces sont de petits brins d'ADN d'environ 20 bases, (appelés oligonucléotides) capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur le brin d'ADN ou sur son brin complémentaire.
  • 13. Deoxynucleosides Triphosphate  Les dNTPs sont des molécules de base, qui constituent l’ADN, utilisés par la Taq polymérase pour la synthèse du nouveau brin d’ADN complémentaire.
  • 14. DNA Polymerase  une polymérase, c'est-à-dire qu’elle peut synthétiser un nouveau brin d’ADN à partir du brin d’ADN matrice après s’être fixée à une amorce.
  • 15. . Caractéristiques de certaines ADN polymérases utilisées pour la PCR
  • 16. Pourquoi utiliser de la polymérase thermorésistante? On ne veut pas qu’elle soit dénaturée à l’étape ou l’on chauffe ADN. Si elle n’était pas thermorésistante, il faudrait ajouter de l’enzyme à chaque cycle. PCR
  • 17.  Les ions Mg++ se trouvent souvent dans une solution de MgCl2, ce sont des cofacteurs de l’enzyme. Ils permettent son bon fonctionnement de l’enzyme. Le Magnésium
  • 18. Le thermocycleur appareil pour fonction de chauffer et refroidir un mélange d'ADN et d'enzymes contenus dans des microtubes, sur des durées de quelques secondes à quelques minutes. Thermocycleur
  • 19. Calcul de la température de fusion Tm= 2 C° X (nombre de bases A et T)+4 C°X (nombre de bases G et C). la température de fusion ou Tm (melting temperature). En pratique, le Tm correspond à la température de dissociation de 50 % de l’ADN en solution (c'est-à-dire 50 % de l'ADN est sous forme simple brin et 50 % de l'ADN sous forme double brin)
  • 20. Protocole de réalisation de la PCR  De manière générale, avant l’analyse des acides nucléiques ces derniers doivent être extraits, puis amplifiés. Nous allons donc brièvement rappeler les principales étapes d’analyse d’un échantillon par PCR
  • 21.
  • 22. Les étapes de la PCR  La réaction de PCR se déroule selon trois principales étapes cycliques :  1 Dénaturation  2 Hybridation  3 Elongation
  • 24.
  • 25.
  • 26.
  • 27. Nombre de cycles  Le nombre de cycles requis pour une amplification optimale varie en fonction de la quantité du matériau de départ.  La plupart des PCR ne devraient donc comprendre que de 25 à 35 cycles. À mesure que le cycle augmente, des produits non spécifiques peuvent s’accumuler.  Après 20 à 40 cycles de chauffage et de refroidissement, plus d’un million de copies de molécules d’ADN originales s’accumulent.
  • 28.
  • 29.
  • 30. Cinétique de la PCR L'évolution de cette amplification peut être représentée par une courbe . Cette courbe peut être divisée en trois phases
  • 31. Cinétique de la PCR  Exponentiel : Le doublement exact du produit s’accumule à chaque cycle (en supposant une efficacité de réaction de 100 %). La réaction est très spécifique et précise  Linéaire : Les composants de la réaction sont consommés; la réaction ralentit et les produits commencent à se dégrader  Plateau : La réaction s’est arrêtée; plus aucun produit n’est fabriqué et s’il reste assez longtemps, les produits de PCR commenceront à se dégrader.
  • 33. GEL ELECTROPHORESIS Retirer les peignes Couler le gel Charger les produits PCR Faire migrer les produits PCR Visualiser des produits PCR sous plaque d ’UV puis photographier le gel Bain du gel avec un Intercalant de l ’ADN (BET ou SYBR green)
  • 34. Agarose Gel Electrophoresis  Lorsque la quantité des produits d'amplification est suffisante, ceux-ci sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose  La visualisation des acides nucléiques se fait après addition de bromure d'éthidium (BET), qui se glisse entre les bases des acides nucléiques (à manier avec précaution car cancérigène). Le BET va émettre une fluorescence orangée sous lumière ultraviolette de longueur d'onde de 312 nm
  • 35. PCR Product DNA Molecular Marker  Les fragments amplifiés peuvent être visualisés facilement après la coloration avec bromure d’éthidium.  Les fragments d’ADN sont séparés par la charge et les tailles  des fragments sont déterminées en comparant à d’ADN standard
  • 36. Avantages et inconvénients de la PCR Les avantages :  Pouvoir travailler sur une toute petite quantité de matériel biologique (sensibilité)  Pouvoir travailler sur de l’ADN dégradé  Pouvoir discriminer entre différentes cibles (spécificité)  La rapidité  La capacité d’analyse
  • 37. Inconvénients de la PCR  Risque de contamination par des substances dans le mélange réactionnel ce qui donne des faux positifs  Risque d’inhibition de la Taq-polymérase par des substances telles que les colorants, l'hème ou des substances d’origine biologiques comme l’urine ou le liquide céphalorachidien, ce qui donne des faux positifs  Utilisation du bromure d’ethidium pour la révélation (agent cancérigène)  Manipulation post-PCR : PCR et analyse sont deux étapes séparées  Coût élevé
  • 38. Les variantes de la PCR  La RT-PCR (Reverse transcriptase-PCR).  PCR nichée (Nested-PCR).  PCR quantitative ou PCR en temps réel –(Quantitative PCR).  La PCR multiplex (Multiplex- PCR).
  • 39. Reverse Transcriptase - PCR RT-PCR une technique permettant de réaliser une amplification à partir d’ARN. une PCR classique avec ADN néo synthèse après transcription inverse d’un ARNm en ADN complémentaire( ADNc)
  • 41.
  • 42. Nested PCR Nested PCR est une amplification PCR très spécifique. Nested PCR utiliser deux paires (au lieu d’une paire) d’amorces PCR pour amplifier un fragmen
  • 44. La PCR multiplex Cette variante de la PCR s’intéresse à l’amplification d’ADN de différentes origines (issu de plusieurs échantillons) dans un seul et même tube. Sa réalisation exige l’utilisation de plusieurs couples d’amorces avec des températures d’hybridation et des longueurs des produits amplifiés semblables ainsi que l’utilisation de la Taq polymérase.
  • 45. PCR multiplex Figure 10 : PCR multiplex .
  • 47. Real Time PCR Real-time PCR La PCR en temps réel est une révolution dans l’utilisation de la PCR. Cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur fluorescent. Elle permet par son principe de faire des mesures quantitatives ,mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers. Pour ne confondre avec la RT-PCR (Reverse Transcription PCR), on préférera donc les
  • 48. Principe de la PCR en temps réel  Marquage du produit au cours de sa synthèse  Chimies de marquage en temps réel  Matériel de détection  Intensité de fluorescence proportionnelle quantité de produit formé
  • 49.
  • 50. = Agent intercalant dont l'émission de fluorescence augmente lorsqu'il est lié à l'ADN double brin h‫ע‬ F Après amplification F ADN double brin h‫ע‬ Avant amplification SYBR Green Le SYBR Green en solution émet peu de fluorescence Durant l'élongation, il se fixe sur l'ADN double brin naissant, entraînant une augmentation de la fluorescence Principe PCR quantitative SYBR ®Green
  • 51. L'émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque cycle d'élongation (l'émission de fluorescence décroît lorsque l'ADN est dénaturé à l'étape suivante)
  • 52. PCR quantitative avec une sonde TaqMan® Sonde marquée par 2 fluorophores: - extrêmité 5’ de la sonde = fluorophore donneur ou émetteur - extrêmité 3’ = fluorophore extincteur ou quencher Le quencher étant à proximité du donneur inhibe l’émission de fluorescence par ce dernier. Lorsque la sonde est hydrolysée par la Taq polymérase, le fluorophore et le quencher s’éloignent entrainant une émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de cible hydrolysée.
  • 53.
  • 54.
  • 55. Principe de la PCR en temps réel Taqman Reporter Quencher - Sonde fluorescente : - Taq DNA pol : Activité 5’Exonuclease  Cette méthode repose sur deux principes :  -la présence de deux fluorochromes sur la même sonde  -l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol -Spécificité l’amorce pour la PCR -Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.
  • 57. En médecine la PCR peut être utilisée dans :  La détection des maladies génétiques  La détection des mutations au niveau du génome, leur nature, leurs tailles et leurs positions  La détection des maladies infectieuses. exemples : SIDA, l’hépatite C, ou les infections à chlamydia  Le dépistage prénatal comme la trisomie
  • 58. En biologie cellulaire et moléculaire  L’isolement et la purification des gènes  L’identification des espèces animales et végétales  L’identification des microorganismes dans des tests de qualités alimentaires  Le clonage moléculaire  Les tests de paternité  L’identification des informations génétiques d’une personne (en criminologie par exemple)
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