ATIVAÇÃO DE PDGFRβ ESPINHAL NA MICRÓGLIA PROMOVE AUTOFAGIA NEURONAL VIA P38 MAPK EM RATOS TOLERANTES A MORFINA

1. NEUROQUÍMICA
PROFESSORES: CARLA I. TASCA, NELSON GABILAN E RODRIGO B. LEAL.
ESTUDANTE: BEATRIZ MALAQUIAS PIMENTA
ME – PPGNEURO/UFSC
2022

2. ATIVAÇÃO DE PDGFRΒ
ESPINHAL NA MICRÓGLIA PROMOVE
AUTOFAGIA NEURONAL VIA P38 MAPK
EM RATOS TOLERANTES A MORFINA
ARTIGO:
Publicado em 2021 na revista:
Journal of Neurochemistry
Fator de Impacto de 5.372 ( A1)

3. INTRODUÇÃO

4. MORFINA
• A morfina é um fármaco narcótico de alto poder analgésico usado
para aliviar dores severas
• Pertence ao grupo dos opióides
• O uso prolongado inevitavelmente leva ao desenvolvimento de
tolerância antinociceptiva, que limita a sua utilização no tratamento
clínico

5. Numerosos estudos têm sido dedicados a esclarecer os
mecanismos subjacentes à tolerância a morfina, incluindo:
• Vias de sinalização óxido nítrico/guanosina monofosfato cíclico
• Receptores noradrenérgicos alfa-2
• Sistema canabinóide
• Hiperexcitabilidade do SNC
No entanto, a neurobiologia dos mecanismos de tolerância á morfina são multifacetados
e apenas parcialmente compreendidos

6. • É um processo catabólico celular que dá
origem à degradação e reciclagem de
componentes do citosol e organelas
celulares danificadas utilizando os
lisossomas, p/ manutenção da homeostase
AUTOFAGIA
O termo autofagia deriva do grego e significa "comer a si próprio", ou seja, a célula digere partes de si mesma

7. AUTOFAGIA E TOLERÂNCIA A
MORFINA
Recentemente foi descoberto que a morfina poderia induzir a autofagia
em neurônios do hipocampo e em neurônios dopaminérgicos no
cérebro, bem como na medula espinhal de camundongos deficientes em
catepsina B.

8. PDGFRs
Receptores do fator de crescimento derivado de plaquetas
Incluindo PDGFRα e PDGFRβ
• São receptores de tirosina-quinase
• A ativação por PDGF-BB e PDGF-DD, resulta em várias respostas
celulares, como sobrevivência, migração, proliferação e diferenciação
Estudos recentes relataram que a administração de morfina em doenças
crônicas poderia ativar a sinalização de PDGFRβ, que é considerado um
mediador específico para regular tolerância a opióides.

9. PDGFBB
O PDGFBB pode induzir autofagia , regulando a expressão
de autofagia associada a proteínas em células do músculo
liso da artéria pulmonar, fibroblastos humanos e em
células HSC-T6
E também exibe efeito neuroprotetor durante alteração
sináptica induzida por morfina

10. HIPÓTESE
A administração repetida de morfina poderia ativar
PDGFRβ e posteriormente, regular a autofagia na
medula espinhal

11. OBJETIVO
Investigar a relação entre PDGFR e autofagia durante o
desenvolvimento de tolerância a morfina e explorar os
mecanismos intrínsecos associados com a autofagia

12. MATERIAIS E MÉTODOS
• Animais: 131 ratos Sprague Dawley machos
adultos
• 7 semanas
• Administração de drogas:
- cloridrato de morfina
- 3-MA (inibidor de autofagia)
- PDGFRβ (inibidor de imatinib)
- Inibidor de p38 MAPK cloridrato de SB203580
- Cloridrato minociclina
• Cateterismo intratecal de pentobarbital sódico
(no líquido céfalo-raquidiano)
• Tolerância á morfina: administração 2x ao dia
por 7 dias consecutivos
• Teste comportamental: limiar de dor térmica por
teste caudal de água quente
• Western Blot, imunofluorescência e microscopia
eletrônica de transmissão.

13. RESULTADOS
1- A administração crônica de morfina induziu
tolerância antinociceptiva
Grupo sem tratamento
Solução salina normal
Tolerância morfina
% MPE: Efeito antinociceptivo máximo possível
Nenhuma diferença significativa no nível
de %MPE foi detectado entre ratos não
tratados e tratados com solução salina
durante o período de 7 dias.
O nível de %MPE em MT foi o principal
mantido em um nível alto no dia 1
Administração repetida de morfina
produziu um declínio progressivo do nível
%MPE a partir do dia 3
Esses resultados indicaram que a tolerância crônica à morfina foi estabelecida com
sucesso
1-b
% MPE: O limiar de dor térmica foi avaliado com um teste caudal de
água quente

14. RESULTADOS
2 - A autofagia espinhal contribuiu para o
desenvolvimento da tolerância à morfina
Naive: Grupo sem tratamento
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância morfina
LC3-II e p62 são marcadores específicos
de autofagia
A expressão de LC3-II e p62 aumentou
significativamente após a administração
de morfina por 7 dias comparados com
ratos sem tratamento e tratados com
solução salina
Na medula espinhal
2-a) e b)
Expressão aumentada no Western
Blot

15. RESULTADOS
Naive: Grupo sem tratamento
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância morfina
NO CORNO DORSAL ESPINHAL
Os resultados mostraram que LC3B e p62 no corno dorsal espinhal de todos os ratos foram co-
localizados com NeuN (marcador específico de núcleos neuronais), em vez de iba1 ou GFAP.
LC3B e p62 são marcadores específicos
de autofagia
NeuN: nos núcleos neuronais, Iba1: na micróglia
GFAP: nos astrócitos
2- c) e d)

16. RESULTADOS
3-MA não apresentou efeito analgésico durante o período de observação de 7 dias
3- a)
% MPE:
Efeito
antinociceptiv
o máximo
possível
NS: Solução salina normal
3-MA: Inibidor de autofagia
MT: Tolerância a morfina
M + 3-MA: morfina + inibidor de autofag
%MPE em ratos M + 3-
MA foram
significativamente
maiores do que aqueles
com MT do dia 5 ao 7.
Indicando que 3-MA
poderia efetivamente
prevenir o
desenvolvimento da
tolerância à morfina.

17. RESULTADOS
LC3-II e p62 são marcadores específicos de autofagia
3- b) e c)
Em comparação com
ratos NS, os ratos
tratados com morfina
tiveram aumento da
expressão de LC3-II e
p62 na medula espinhal
E o 3-MA inibiu a
expressão de LC3-II e
p62 nos ratos tratados
com morfina
NS: Solução salina normal
3-MA: Inibidor de autofagia
MT: Tolerância a morfina
M + 3-MA: morfina + inibidor de autofagia
Esses resultados indicam que a autofagia espinhal em neurônios contribui para o
desenvolvimento da tolerância a morfina
GAPDH: Controle de carga-proteína de carga
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
Expressão inibida no Western
Blot

18. RESULTADOS
3- d)
Em ratos tratados com
solução salina apenas
alguns vacúolos
autofágicos foram
observados
Já nos ratos tratados com
morfina um acúmulo de
vacúolos autofágicos com
organelas foi identificado.
NS: Solução salina normal MT: Tolerância a
morfina
Detecção de vacúolos autofágicos na medula espinhal por microscopia eletrônica
de transmissão

19. RESULTADOS
4-a) e b)
A expressão de p-PDGFRbeta e p-
p38 em ratos tratados com morfina
foi aumentada quando comparada
com NS
PDGFRbeta: receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas beta
3 – Ativação de PDGFRbeta e p38 na tolerância à
morfina
Considerando que PDGFRbeta e p38 desempenham papéis significativos na
tolerância à morfina, os respectivos foram analisados por Western Blot na medula
Os níveis de proteína de
PDGFRbeta e p38 não mudaram,
sugerindo que PDGFRbeta e p38
foram ativados durante o
desenvolvimento de tolerância a
morfina

20. RESULTADOS
4- c
A expressão de p-PDGFRbeta no corno
dorsal espinhal foi co-localizado
principalmente com NeuN, em vez de
Iba1 ou GFAP, em ratos sem tratamento
e NS.
PDGFRbeta: receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas beta
Mas foi co-localizado principalmente
com Iba1 em ratos tratados com
morfina.
NeuN: nos núcleos neuronais,
Iba1: na micróglia
GFAP: nos astrócitos
Este resultado indica que a ativação das via de sinalização PDGFRbeta na
micróglia pode estar envolvida no desenvolvimento da tolerância à morfina.

21. RESULTADOS
4- d) e e)
P-p38 no corno dorsal espinhal
foi co-localizado principalmente
com NeuN, em vez de iba1 ou
GFAP, em ratos SN.
Em contrapartida foi co-
localizado principalmente com
Iba1, alguns com NeuN em MT.
NeuN: nos núcleos neuronais
Iba1: na micróglia
GFAP: nos astrócitos
Este resultado indica que a ativação das via de sinalização p-p38 a na micróglia
pode estar envolvida no desenvolvimento da tolerância à morfina.
O nº de células de p-p38+Iba1
em ratos tratados com morfina foi
significativamente maior quando
comparado com os ratos sem
tratamento e os ratos NS.
p38 desempenha papel significativos na tolerância à morfina,

22. RESULTADOS
5- a) e b)
Imatinib pode prevenir
parcialmente o desenvolvimento
da tolerância a morfina
% MPE: Efeito antinociceptivo
máximo possível (limiar)
PDGFRbeta: receptor do fator de
crescimento derivado de plaquetas
Imatinib é um inibidor seletivo
que pode suprimir a ativação
de PGDFRbeta
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
IMA: Imatinib
M+IMA: Morfina + imatinib
4 –PDGFRbeta é ativado após tratamento com
morfina e o p-PDGFRbeta medeia a autofagia na
medula espinhal

23. RESULTADOS
5- c) e d)
A expressão de LCE-II e
p62 induzida pelo
tratamento repetido com
morfina é inibida por
Imatinib
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
IMA: Imatinib
M+IMA: Morfina + imatinib
LC3-II e p62 são marcadores específicos de autofagia
Esses resultados indicam
que o PDGFRbeta é
ativado durante o
desenvolvimento da
tolerância à morfina e o p-
PDGFRbeta medeia a
autofagia induzida pela
administração crônica de
morfina.
Imatinib é um inibidor seletivo que
pode suprimir a ativação de
PGDFRbeta

24. RESULTADOS
6- a)
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
SB203580 é um inibidor de p38 MAPK
%MPE em ratos
coadministrados com morfina e
SB203580 foi
significativamente maior do que
em ratos MT do 3º ao 7º dia
5- Envolvimento da via de sinalização p38 MAPK na autofagia
mediada por PDGFRbeta durante o desenvolvimento de
tolerância à morfina
% MPE: Efeito
antinociceptiv
o máximo
possível
(limiar) Indicando que SB203580 pode
impedir o desenvolvimento de
tolerância a morfina

25. RESULTADOS
6- b) e c)
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
Imatinib pode prevenir o
aumento da expressão de p-
p38 em ratos administrados
com morfina
SB203580 poderia
significativamente regular
negativamente a expressão de
p-p38 induzida por
administração repetida de
morfina
Imatinib é um inibidor seletivo que pode
suprimir a ativação de PGDFRbeta
SB203580 é um inibidor de p38
MAPK
p38 desempenha papel significativos na tolerância à morfina,

26. RESULTADOS
6- d) e e)
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
SB203580 poderia
significativamente regular
negativamente a expressão de
LC3-II e p62 induzida por
administração repetida de
morfina
SB203580 é um inibidor de p38
MAPK
LC3-II e p62 são marcadores específicos de autofagia
Estes resultados indicam que
SB203580 pode inibir autofagia

27. RESULTADOS
7- a)
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
Minociclina: é um inibidor da ativação da micróglia
6- A minociclina inibiu autofagia em neurônios induzida pela
administração crônica de morfina
A minociclina em si não teve
efeito sobre o %MPE em ratos,
embora pudesse atenuar o
desenvolvimento da tolerância
a morfina
% MPE: Efeito
antinociceptivo máximo
possível (limiar)

28. RESULTADOS
7- b) e c)
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
Minociclina: é um inibidor da ativação da micróglia
O efeito da minociclina na
tolerância a morfina está
associada com a ativação da
micróglia, não com astrócitos
Iba1: na micróglia
GFAP: nos astrócitos

29. RESULTADOS
7- d) e e)
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
Minociclina: é um inibidor da ativação da micróglia
A expressão aumentada de p-
PDGFRbeta e p-p38 induzida
pela administração repetida de
morfina, foi inibida por minociclina

30. RESULTADOS
7- f) e g)
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
Minociclina: é um inibidor da ativação da micróglia
A expressão aumentada de p-
LC3-II e p628 induzida pela
administração repetida de
morfina, foi inibida por minociclina
Esses resultados indicaram que
PDGFRbeta fosforilado e p38 na
micróglia são mediados por
autofagia em neurônios, induzida
pela administração crônica de
morfina
LC3-II e p62 são marcadores específicos de autofagia

31. RESULTADOS
8- a) e b)
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
Os resultados mostraram que quase
todos os pontos LC3B e p62 no corno
dorsal espinhal de todos os ratos
foram localizados em neurônios
positivos para GABA
7- A autofagia induzida pela morfina foi específica para
neurônios positivos para ácido gama-aminobutírico espinhal
(GABA)
LC3-II e p62 são marcadores específicos de autofagia

32. RESULTADOS
8- c) e d)
NS: Solução salina normal
MT: Tolerância a morfina
O Nº de células de LC3+ GABA+ no corno dorsal espinhal foi comparável com células LC3+ em ratos
tolerantes a morfina, assim como p62
LC3-II e p62 são marcadores específicos de autofagia
Esses dados indicaram que a autofagia induzida pela morfina é específica em interneurônios GABAérgicos
no corno dorsal da coluna vertebral.

33. • A administração crônica de morfina induziu autofagia, representada
pela regulação de LC3-II e p62 que foram expressos em
interneurônios GABAérgicos nas camadas superficiais da medula
espinhal
• Considerando que a inibição da autofagia atenuou o
desenvolvimento à morfina, na micróglia o PDGFRbeta fosforilado
provou desempenhar papel crítico na tolerância a morfina.
DISCUSSÃO

34. • A ativação de PDGFR na micróglia espinhal podeinduzir autofagia
em neurônios GABAérgicos via p38 MAPK em ratos tolerantes a
morfina.
• PDGFRbeta tem papel importante como regulador no progresso da
autofagia durante o desenvolvimento de tolerância a morfina.
DISCUSSÃO

35. CONCLUSÕES
• Em conjunto, os autores acreditam que a via PDGFRbeta – p38 é um importante
regulador positivo na autofagia da coluna em interneurônios GABAérgicos
durante o desenvolvimento da tolerância a morfina.
• Os mecanismos entre PDGFR e autofagia merecem mais exploração
• Os inibidores da via PDGFRbeta-p38 ou da autofagia podem ser um alvo
terapêutico promissor na profilaxia no tratamento de tolerância antinociceptiva
opióide.

36. ELES CUMPRIRAM O OBEJTIVO?
Investigar a relação entre PDGFR e autofagia durante o
desenvolvimento de tolerância a morfina e explorar os
mecanismos intrínsecos associados com a autofagia?

37. MUITO OBRIGADA POR SUA ATENÇÃO