En términos generales biotecnología se puede definir como el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre.

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BIOTECNOLOGIA
• En términos generales biotecnología se puede definir como el uso de organismos
vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de
valor para el hombre.
• Por tanto, podemos decir que la biotecnología abarca desde la biotecnología
tradicional, muy conocidas y establecidas, y por tanto utilizadas, como por ejemplo la
fermentación de alimentos, hasta la biotecnología moderna, basada en la utilización
de las nuevas técnicas del DNA recombinante (ingeniería genética), los anticuerpos
monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y tejidos.
• La biotecnología moderna está compuesta por una variedad de técnicas derivadas
de la investigación en biología celular y molecular.
• Estas técnicas involucran la manipulación deliberada de moléculas de DNA con la
finalidad de la aplicación comercial de organismos vivos modificados o de sus
productos.
• Pueden ser utilizadas en cualquier industria que utilice microorganismos o células
vegetales o animales.

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Biotecnología microbiana
Es la disciplina que utiliza los microorganismos vivos o sus
productos en procesos industriales.
La biotecnología microbiana se puede dividir en dos fases distintas:
1. Tecnología microbiana tradicional, que se refiere a la fabricación
a gran escala de productos que los microorganismos son capaces
de fabricar.
2. Tecnología microbiana con organismos alterados genéticamente
mediante procesos de ingeniería genética.

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Microorganismos Industriales y Productos Industriales
• Su fuente es la naturaleza
• No todos los microorganismos (MOs) tienen uso industrial
• Los hongos (levaduras y mohos) y algunos procariotas (Streptomyces) son los mas
usados.
• Se seleccionan los que producen uno o mas productos de interés
• Se modifican géneticamente por mutación o recombinación para aumentar el o los
metabolitos de interés.
• Las vías metabólicas menores se reprimen o eliminan.
• Pueden presentar propiedades de desarrollo pobres, pérdida en la capacidad de
esporulación, propiedades bioquímicas y celulares alteradas.
• Las cepas modificadas son conservadas en los laboratorios de microbiología de las
industrias y en distintas colecciones nacionales de microorganismos tipo.

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Colecciones Nacionales de microorganismos tipo
Están disponibles para fines docentes, de investigación o industriales.
Las cepas que producen los mejores rendimientos (con derechos de propiedad o
patentadas) no están en estas colecciones.

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Mejoramiento de la cepa de Penicillum chrysogenum,
productora de la penicilina.
A través de los años y de numerosos procesos la
producción de penicilina por el hongo Penicillum
chrysogenum pasó de 1-10 ug/ml a 50.000 ug/ml.
Este incremento de 50.000 veces se obtuvo por el
mejoramiento de la cepa a través de mutación y
selección sin incluir manipulación genética y por
cambios en el medio y en las condiciones de
crecimiento. La introducción de nuevas técnicas
genéticas condujo posteriormente a incrementos
mucho mas modestos en el rendimiento.
Conjunto de mutaciones realizadas por cuatro grupos de
investigadores para obtener una cepa de Penicillum
chrysogenum capaz de sintetizar penicilina para una
exportación comercial. “S”, mutación espontánea; “X”, rayos
X; “UV”, radiación ultra violeta; “NM”, gas mostaza.
Los métodos fermentativos habituales rinden más de 20 g/litr

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Requisitos de un microorganismo industrial
El microorganismo debe:
1- Producir la sustancia de interés
2- Obtenerse en cultivo puro
3- Ser genéticamente estable.
4- Poder desarrollarse en cultivos a gran escala.
5- Poder mantener el cultivo del MO durante períodos largos en el
laboratorio y en la planta industrial.
6- Tener un tiempo de duplicación bajo y fabricar el producto deseado
en un período corto.
Crecimiento rápido → ocupar menos tiempo los equipos industriales
→ disminuir los riesgos de contaminación.
→ mejor control de los factores ambientales
7- Ser susceptible de manipulación genética.
8-Crecer en medio de cultivo líquido relativamente barato y que se
obtenga en grandes cantidades.

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Medios de cultivo industriales
Se usan muchas veces como medios de cultivo a gran escala
desechos carbonados provenientes de otras industrias.
-licor de maceración del maíz (rico en nitrógeno y factores de
crecimiento).
- suero de leche (contiene lactosa y minerales)
-otros materiales residuales de la industria con elevado contenido
en carbono orgánico.
9- En la industria se prefieren los MOs grandes como los hongos,
levaduras y bacterias filamentosas para poder separar las células
microbianas del medio de cultivo con facilidad ya que este proceso es
muy costoso a gran escala. Es mas económico efectuar la separación
por filtración que por centrifugación.

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Condiciones que no debe tener un microorganismo industrial
Los microorganismos industriales no deben:
• 1- ser peligrosos para el hombre, animales y plantas de interés
económico.
• 2- liberar toxinas, o si lo hacen deben poder ser eliminadas
fácilmente.

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Los productos industriales de interés pueden ser de varios tipos:
1- Las células propiamente dichas, por ej. las levaduras cultivadas
para alimentos, panadería o cerveza.
2- Las sustancias producidas por las células. Ejemplos de estas
últimas son:
- las enzimas como la glucosa isomerasa
- agentes farmacológicos activos como los antibióticos,
esteroides y alcaloides
- productos químicos y aditivos alimentarios como el aspartame,
edulcorante de alimentos y bebidas de bajas calorías (fabricado
a partir de L-fenilalanina mas L-ácido aspártico); el L-glutamato,
utilizado para reforzar el sabor y para ablandar las carnes; el L-
aspartato y alanina para enriquecer el sabor de jugos de fruta;
la glicina para mejorar el sabor de alimentos edulcorados; la L-
lisina y la DL-metionina como aditivos nutritivos en alimentos
para animales.

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Productos Industriales
Varias enzimas importantes de uso comercial son producidas por MOs, incluyendo enzimas que
digieren el almidón (amilasas), proteínas (proteasas, renina) y las grasas (lipasas). Penicilina
acilasa es usada para producir penicilinas sintéticas. Los metabolitos microbianos son otro grupo
importante de productos industriales. Estos metabolitos pueden ser productos de la fermentación
como el etanol, ac. acético o ac. láctico; factores de crecimiento claves como los aminoácidos, las
vitaminas, antibióticos, esteroides, alcaloides, etc.
Los agentes farmacológicamente activos están por lo general en la categoría de
metabolitos secundarios.

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Crecimiento y formación de productos en procesos industriales
El crecimiento microbiano comprende distintas etapas: fase de
latencia, fase exponencial y fase estacionaria.
Procesos donde lo que interesa es el metabolito microbiano.
Hay dos tipos básicos de metabolito microbiano:
1- metabolito primario es el que se fabrica durante la fase
exponencial del crecimiento del microorganismo.
2- metabolito secundario es el que se fabrica cerca del final de la
fase logarítmica de crecimiento, con frecuencia , cerca de la fase
estacionaria de crecimiento.

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Comparación entre metabolitos primarios y secundarios
Metabolitos microbianos primarios
Un proceso típico microbiano en el cual el producto de
interés se forma durante la fase primaria de
crecimiento es la fermentación alcohólica (etanólica).
El etanol es un producto del metabolismo anaeróbico
de la levadura y de ciertas bacterias, y se forma como
parte del metabolismo energético. Dado que el
crecimiento sólo se puede dar si se efectúa la
producción de energía, la producción de etanol corre
paralelamente con el crecimiento.
Metabolismo microbiano secundario
Los metabolitos producidos durante la fase
estacionaria suelen llamarse metabolitos secundarios y
son algunos de los más comunes e importantes de
interés industrial. Este es el caso de la mayoría de los
compuestos de interés farmacológico como es el caso
de los antibióticos por ejemplo.

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Comparación entre metabolitos primarios y secundarios
a) Metabolismo primario: formación de
alcohol por la levadura. b) Metabolismo
secundario: formación de penicilina por
el hongo Penicillium chrysogenum,
presentando la separación de la fase de
crecimiento (trofofase), y la fase de
producción (idiofase). Nótese en b) que
la penicilina no se produce hasta que el
crecimiento ha entrado en la fase media
y mayor parte del producto se forma
después de que el crecimiento ha
entrado a la fase estacionaria. En
ambos gráficos a) y b) los ejes son
aritméticos y no logarítmicos.
a
b

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Trofofase e idiofase.
En el metabolismo secundario, las dos fases distintas del
metabolismo se denominan trofofase e idiofase. La trofofase es la
fase de crecimiento (el prefijo trofos, significa "crecimiento" )
mientras que la fase de producción de metabolitos es la idiofase. Si
estamos tratando con un metabolito secundario debemos asegurar
que durante la trofofase se proporcionen las condiciones apropiadas
para un excelente crecimiento y que las condiciones se alteren
adecuadamente y en el momento oportuno para que la formación del
producto sea excelente.

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Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas
las células, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre
un organismo y otro.
Las características reconocidas del metabolismo secundario son:
1- Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos
organismos.
2- Los metabolitos secundarios aparentemente no son esenciales para
el crecimiento y la reproducción.
3- La formación de metabolitos secundarios depende fundamentalmente
de las condiciones de cultivo, sobre todo de la composición del medio.
Con frecuencia, se produce la represión de la formación del metabolito
secundario.
4- Los metabolitos secundarios se producen como un grupo de
estructuras muy relacionadas. Por ejemplo, se ha encontrado que una
sola cepa de Streptomyces produce alrededor de 30 antibióticos
distintos, pero relacionados, del tipo antraciclina.
5- Se puede incrementar enormemente la sobreproducción de los
metabolitos secundarios, mientras que los metabolitos primarios
asociados al metabolismo primario, habitualmente no pueden
sobreproducirse en la misma medida.

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Las vía metabólicas del metabolismo secundario surgen
del metabolismo primario.
• El metabolito secundario, generalmente se produce a partir de varios
productos intermediarios acumulados ya sea en el medio de cultivo o en las
células, durante el metabolismo primario.
• Las enzimas que intervienen en la producción de metabolito secundario se
regulan por separado de las del metabolismo primario.
• En algunos casos se han identificado inductores de metabolitos
secundarios por ejemplo, se ha identificado un inductor específico para la
producción de estreptomicina, compuesto que se llama factor-A.
• La mayor parte de los metabolitos secundarios son moléculas orgánicas
complejas que requieren una gran cantidad de reacciones enzimáticas
específicas para su síntesis, (72 etapas para tetraciclina; 25 etapas para
eritromicina).

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Características de la fermentación en gran escala
En microbiología industrial, el término fermentación se refiere a cualquier
proceso microbiano a gran escala, tanto si se realiza aeróbica como
anaeróbicamente, es decir tanto si es o no bioquímicamente una fermentación.
De hecho la mayor parte de las fermentaciones industriales son
aeróbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentación industrial se
llama fermentador y el microorganismo que se utiliza se llama fermento.
El fermentador puede variar de tamaño de la escala pequeña de laboratorio (5
-10 litros) a la enorme escala industrial (400.000 litros). Las dimensiones
dependen del tipo de proceso y de cómo opera. Los procesos manejados en
lote o batch requieren fermentadores más grandes que los que operan en
forma contínua o semicontínua.
Los fermentadores industriales se pueden dividir en dos clase
principales, para procesos anaeróbicos y para procesos aeróbicos. Los
fermentadores anaeróbicos requieren poco equipo especial, excepto para la
remoción del calor generado durante la fermentación, en tanto que los
fermentadores aeróbicos requieren equipo mucho más elaborado para
asegurar la correcta mezcla y aireación.

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Construcción de un fermentador aeróbico
Los fermentadores a gran escala son casi siempre de acero inoxidable. Es
prácticamente un cilindro grande cerrado por arriba y por abajo, dentro
del cual se han ajustado varios tubos y válvulas. Tiene una cubierta
externa de enfriamiento, a través de la cual se hace pasar vapor o agua
de enfriamiento. En el caso de fermentadores muy grandes el intercambio
de calor a través de la cubierta es insuficiente de modo que hay que
adaptar serpentines internos a través de los cuales se pasa vapor o agua
de enfriamiento.
En equipos a gran escala se necesita optimizar el sistema de aireación ya
que la transferencia de oxígeno del gas al líquido es un proceso muy difícil
porque el oxígeno es poco soluble en agua y un fermentador con una gran
población microbiana tiene una tremenda demanda de oxígeno para el
cultivo. Se necesitan dos dispositivos diferentes para asegurar la
adecuada aireación: un dispositivo de aireación llamado difusor, y un
dispositivo de agitación llamado impulsor. Para lograr una mezcla más
eficiente se utilizan deflectores.
El microbiólogo industrial debe conocer muy bien la extremadamente
compleja dinámica de los fluidos en los fermentadores para diseñar y
operar de un modo eficiente los mismos

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Fermentadores: a) de laboratorio; b) esquema de fermentador
industrial; c) interior de un fermentador industrial.

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a) Conjunto de fermentadores pequeños para investigación usado en el
desarrollo del proceso. b) Gran batería de fermentadores al aire libre (240
m3) que se utiliza para la fabricación de alcohol en Japón. Dada la gran
diferencia de sus tamaños, la misma fermentación microbiana tendría que
dirigirse en forma muy distinta en los dos tipos de fermentadores.

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Control y monitoreo del proceso
Debido a los altos costos de producción, los fermentadores industriales
están cuidadosamente controlados. No solo se controla el crecimiento y la
producción del producto , sino que se deben controlar otros factores
ambientales a medida que el proceso se efectúa.
Los factores ambientales controlados más frecuentes son: la
concentración de oxígeno, pH, masa celular, temperatura y
concentración del producto. También hay que controlar la formación de
espuma. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar los
procesos de fermentación ya sea en la obtención de datos o en el
control de varios factores ambientales.
La obtención de datos a medida que el proceso de fermentación tiene lugar
se llama adquisición inmediata. Las computadoras también pueden
graficar los datos obtenidos permitiendo al operador tener una
representación visual del progreso de la fermentación. Las computadoras
permiten también almacenar los datos para poder analizarlos. Las
computadoras permiten un control inmediato del proceso a través de la
modificación de los parámetros ambientales a medida que la fermentación
progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del
crecimiento evitando que el mismo sea metabolizado a productos
indeseables.

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a) Una gran planta de fermentación.
Sólo se ve la parte superior de los
fermentadores, que pueden tener
una altura de varios pisos.
b) Habitación de control por ordenador
para una gran planta de
fermentación
Los procesos microbianos deben ser
controlados en forma continua,
usualmente esto se hace por medio de
computadoras, a fin de asegurar
rendimientos satisfactorios de los
productos que se desean.

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Escalado de la fermentación
Escalado o cambio de escala es la adaptación de un proceso
industrial desde las condiciones de un pequeño laboratorio a las de una
fermentación comercial a gran escala.
La mezcla y la aireación son mucho mas eficientes en el matraz de
laboratorio pequeño que en el fermentador industrial grande. A medida
que cambia el tamaño del equipo, cambia la relación
superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayor
para un área superficial determinada.
El escalado de la fermentación en el fermentador industrial es la tarea
del ingeniero bioquímico, quien esta familiarizado con la transferencia
de gases, la dinámica de fluidos y la termodinámica. El papel del
microbiólogo industrial en el proceso de escalado es trabajar
estrechamente con el ingeniero bioquímico para asegurar que se han
abarcado los parámetros necesarios para una fermentación exitosa y
que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una
fermentación en gran escala.

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Las distintas etapas de escalado que deben realizarse para llegar
de un proceso de laboratorio a un proceso industrial son las
siguientes:
1- Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la
primera indicación que es posible un proceso de interés industrial.
2- El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequeña,
generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el
fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio
de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos
tanto en el equipo como en los medios de cultivo.
3- La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de
300 a 3000 litros. Aquí las condiciones se acercan mas a la escala
industrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En el
fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa
instrumentación y un control con computadora, de modo que las
condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del
fermentador industrial.
4- El fermentador industrial mismo, generalmente de 10.000 a 400.000
litros

26. 26
En los estudios de escalado para los procesos aeróbicos, el
parámetro de mayor importancia que se debe controlar durante el
aumento de escala es la velocidad de transferencia de oxigeno; se
debe mantener la tasa de oxigeno constante al incrementar las
dimensiones del fermentador.
La tasa de oxigeno expresa el consumo de oxigeno en
mMoles de O2/l/hora que se requiere para obtener el
optimo rendimiento.

27. 27
Esquema general de un proceso de
fermentación a gran escala.
El producto comercial esta
usualmente en las células o en la
fracción libre de células, pero no en
ambas fracciones. De acuerdo a esto
una de ambas fracciones debe ser
posteriormente procesada (señalada
con el símbolo “+”) o descartada
(señalada con el símbolo “-”).

28. 28
Antibióticos: aislamiento y caracterización
Los antibióticos son sustancias químicas producidas por los MOs que
matan o inhiben el crecimiento de otros MOs.
Los antibióticos son metabolitos secundarios típicos.
Los que se usan comercialmente son producidos por hongos filamentosos
y por bacterias del grupo de los actinomicetos.
La mayoría se usa para el tratamiento de enfermedades bacteriana y
algunos pocos son contra enfermedades fúngicas.
Los géneros mas comunes son Streptomyces, Penicillum y Bacillus.
Fabricar o producir comercialmente un antibiótico requiere además de un
alto rendimiento, desarrollar un método eficiente de purificación. Por
ejemplo si el antibiótico es soluble en un compuesto orgánico inmiscible
en agua esto implica una purificación sencilla y de bajo costo por la
facilidad de poder concentrarlo. Si el antibiótico no es soluble en algún
disolvente, hay que separarlo por: a) adsorción; b) intercambio iónico; c)
precipitación química. La meta es obtener un producto cristalino de
elevada pureza.
Para obtener cepas con altos rendimientos el químico debe obtener cepas
que no produzcan impurezas indeseables o desarrollar métodos para
eliminarlas.

29. 29
Aislamiento de antibióticos y método para probar el
espectro de actividad antibiótico de un microorganismo
La forma tradicional por la que se descubren nuevos antibióticos
consiste en el rastreo (screening). Con este tipo de aproximaciones se
aísla de la naturaleza, un gran número de posibles MOs productores
de antibióticos (a). En estos aislamientos se ensaya la producción de
antibióticos viendo si producen cualquier sustancia difusible que inhiba
el crecimiento de ciertas bacterias representativas de patógenos
bacterianos usadas como control en el test (b). Aquellos aislamientos
que sean candidatos de la producción de antibióticos se estudian
posteriormente, a fin de saber si los antibióticos que produce son
nuevos o no. Cuando se descubre un MO que produce un nuevo
antibiótico, éste se produce en cantidades suficientes para poder
analizar su estructura y determinar luego su toxicidad y actividad
terapéutica en animales infectados. La mayoría de los antibióticos
nuevos fallan en el test en animales de experimentación. No obstante
la búsqueda continúa ya que se estima que las especies del género
Streptomyces producen unos 100.000 antibióticos diferente.

30. 30
Aislamiento de antibioticos
Placa de agar
Halo de inhibiciónHongo
Cultivo bacteriano

31. 31

32. 32
Producción mundial anual y consumo de antibióticos.
- Cada año se manufacturan más de 500 toneladas de agentes
quimioterapéuticos.
- Agente quimioterapéutico es todo compuesto químico que puede usarse
por vía interna para controlar las enfermedades infecciosas. Son de gran
utilidad en medicina clínica y veterinaria, así como en agricultura.
- El elemento clave de todo agente quimioterapéutico es la toxicidad
selectiva, es decir , la capacidad de inhibir a las bacterias u otros agentes
patógenos sin afectar al hospedador. Se los puede agrupar en dos
categorías generales, los agentes sintéticos y los antibióticos.
Cefalosporinas inhiben la síntesis de la
pared celular.
Macrólidos ej. Eritromicina inhibe
subunidad 50S (síntesis de proteínas).
Quinolonas ej. Ácido nalidíxico
interaccionan la DNA girasa.
Penicilinas. Inhiben síntesis de pared
Aminoglicósidos ej Estreptomicina
inhibe subunidad 30S (síntesis de
proteínas).

33. 33
Modo de acción de los principales
quimioterapéuticos antimicrobianos

34. 34
Espectro de acción antimicrobiana de algunos
agentes quimioterapéuticos seleccionados

35. 35
Producción industrial de la penicilina
El anillo β-lactámico característico de las penicilinas se muestra en color
marrón oscuro. Son producidas por varios hongos de los géneros
Penicillum y Aspergillis y por algunos procariotas. La fermentación normal
conduce a la producción de penicilinas naturales. Si durante la
fermentación de añaden precursores específicos, se forman algunas
penicilinas biosintéticas. Las penicilinas semisintéticas se producen
añadiendo por métodos químicos una cadena lateral específica al núcleo
del ácido 6-aminopenicilánico en la posición R. Las penicilinas
semisintéticas son las que tienen la mayor utilidad clínica, puesto que por
lo general son activas frente a bacterias Gram negativas y pueden
administrarse por vía oral.

36. 36
Estructuras de algunas penicilinas importantes

37. 37
Cinética de fermentación de la penicilina con Penicillum chrysogenum.
La producción de penicilina es un proceso
aeróbico, se requiere una aireación muy eficiente.
La penicilina es un metabolito secundario. Durante
la fase de crecimiento se produce muy poca
penicilina, pero una vez que se ha consumido la
fuente de carbono casi completamente, empieza la
fase de producción de la penicilina. Alimentando el
fermentador con diversos componentes del medio
de cultivo, se puede alargar por varios días la fase
de producción. El licor de maíz es uno de los
principales ingredientes de la mayoría de los
medios de producción de penicilina. Esta sustancia
contiene la fuente de nitrógeno y otros factores de
crecimiento. La fuente de carbono es
generalmente la lactosa. La penicilina se secreta al
medio y una vez que las células se separan por
filtración, se baja el pH del medio y se extrae el
antibiótico con un disolvente orgánico. Después de
concentrarse en el solvente, el antibiótico se
vuelve a extraer en medio acuoso a pH alcalino,
posteriormente se concentra y cristaliza. Por este
método se puede obtener rápidamente penicilina
con un alto nivel de pureza.

38. 38
Purificación de antibióticos

39. 39
Purificación de un antibiótico.
Instalación para extraer un antibiótico del caldo de fermentación

40. 40
Esquema de la producción de clorotetraciclina con Streptomyces
aureofaciens. En su biosíntesis están implicados más de 72
productos intermediarios y los estudios
genéticos han mostrado más de 300 genes
involucrados en su síntesis. Si bien la regulación
de este antibiótico es muy compleja, se sabe
que la glucosa y el fosfato reprimen su síntesis.
Se utiliza como materia prima el licor de maíz,
como en el caso de la penicilina, pero la fuente
de carbono es la sacarosa en lugar de la
lactosa. Se evita el uso de glucosa porque causa
una represión por catabolito en la producción
del antibiótico.

41. 41
Vitaminas producidas por microorganismos a escala industrial
a) Vitamina B12. Es una
cobalamina.
b) Vitamina B2 (Riboflavina)
La mayoría de las vitaminas se sintetizan por métodos
químicos, sin embargo algunas tienen una estructura
muy complicada y se obtienen por procesos biocatalíticos
como son la vitamina B12 y la Riboflavina.
En el hombre, una deficiencia importante en la vitamina
B12 produce la llamada anemia perniciosa, que se
caracteriza por la baja producción de eritrocitos y
alteraciones en el sistema nervioso. Los requerimientos
de esta vitamina por los animales se realizan a través de
la dieta o por la adsorción de la vitamina producida por
los microorganismos que colonizan el intestino de los
animales. Las plantas no producen ni utilizan vitamina
B12. El rendimiento de esta vitamina se incrementa
mucho utilizando cepas sobreproductoras del género
Propionibacterium o Pseudomonas y añadiendo cobalto
al medio de cultivo.
La vitamina B2 o riboflavina es una coenzima muy
importante y es sintetizada por muchos MOs. El hongo
Ashbya gossypii produce en forma natural cantidades
enormes de esta vitamina (hasta 7g/l).

42. 42
Aminoácidos utilizados en la industria alimentaria
Los aminoácidos tienen muchos usos en la industria alimentaria, en medicina y como
precursores de la industria química. El más importante comercialmente es el ácido
glutámico, que se utiliza para aumentar el sabor. Otros aminoácidos importantes son
el ácido aspártico y la fenilalanina, que son los ingredientes del edulcorante artificial
aspartame, un ingrediente en las bebidas bajas en calorías y en otros productos sin
azúcar.

43. 43
Si bien la mayor parte de los aminoácidos se puede producir por síntesis
química, esta última da como resultado las formas L y D. Si se necesita la
forma L, bioquímicamente importante, entonces es necesario aplicar un
método de fabricación enzimático o microbiológico. La producción
microbiológica de los aminoácidos puede hacerse por fermentación directa,
en la cual un microorganismo produce el aminoácido en un proceso estándar
de fermentación, o mediante síntesis enzimática, donde el microorganismo
es la fuente de una enzima y entonces se utiliza ésta en el proceso de
producción.
Regulación de la biosíntesis de aminoácidos
La síntesis de los aminoácidos se lleva a cabo a través de una serie de etapas
en las que intervienen distintas enzimas a partir de precursores de la vía
glucolítica o del ciclo del ácido tricarboxílico y su regulación se efectúa por
retroalimentación, es decir que la primera etapa enzimática, única para una
vía biosintética de un determinado aminoácido suele estar sometida a
inhibición por retroalimentación por el producto final de esa vía. Así al
aumentar la concentración de un determinado aminoácido, se inhibe la
actividad de la enzima que conduce a la biosíntesis de ese aminoácido, dando
como resultado una reducción en la síntesis. Una forma de lograr la
sobreproducción de un determinado aminoácido es obtener una mutante en la
primera y única enzima de esa vía de síntesis del aminoácido, de forma tal
que ya no esté sometida a la inhibición por retroalimentación.

44. 44
Inhibición de la actividad enzimática por retroalimentación
La inhibición por retroalimentación se observa principalmente en la
regulación de las rutas biosintéticas complejas, tales como las rutas
implicadas en la síntesis de un aminoácido o de una purina. Tales rutas
requieren muchas etapas enzimáticas y el producto final, aminoácido o
nucleótido, está separado del sustrato inicial por muchas etapas. Aún así el
producto final es capaz de retroalimentar la primera etapa de la ruta y
regular su propia biosíntesis. En la inhibición por retroalimentación, el
aminoácido u otro producto final de la ruta biosintética inhibe la actividad
de la primera enzima de esta ruta. Esto se debe a una propiedad de la
enzima inhibida conocida como alosterismo. Una enzima alostérica
tiene dos sitios de unión importantes, el sitio activo, donde se une el
sustrato , y el sitio alostérico, donde se une reversiblemente el inhibidor,
llamado a veces efector. Cuando un inhibidor se une, por lo general no
covalentemente, al sitio alostérico, la conformación de la molécula de
enzima cambia, de manera que el sustrato deja de unirse eficientemente al
sitio activo.

45. 45

46. 46
Mecanismo de inhibición
enzimática por un efector alostérico

47. 47
Producción de la lisina utilizando Brevibacterium flavum.
La lisina es un aminoácido esencial para el hombre y
es utilizada como aditivo alimentario. Se produce
comercialmente utilizando la bacteria Brevibacterium
flavum. La síntesis de lisina, como la de otros
aminoácidos se encuentra estrictamente regulada.
Para poder obtener los aminoácidos en forma
económica es necesario obtener cepas
sobreproductoras, es decir que no sufran el fenómeno
general de inhibición por retroalimentación. En la vía
bioquímica que conduce desde el aspartato a la lisina,
esta última puede inhibir por retroalimentación la
actividad de la enzima aspartatoquinasa. La
sobreproducción de lisina puede obtenerse aislando
mutantes en las cuales la aspartatoquinasa no esté
sujeta a retroinhibición. Esto se logra aislando
mutantes resistentes a un análogo de la lisina, la S-
aminoetilcisteína (AEC), que se une al sitio alostérico
de la enzima e inhibe su actividad. Las mutantes
resistentes a la AEC que se obtienen fácilmente por
selección positiva, producen una modificación de la
aspartatoquinasa con un sitio alostérico alterado que
ya no reconoce la AEC o a la lisina, por lo que la
retroinhibición por lisina está muy reducida. Dichas
mutantes pueden producir hasta 60 g de lisina por
litro en fermentadores industriales.

48. 48
Producción de ácido glutámico
Un factor muy importante para lograr un proceso de producción comercial
de un aminoácido es conseguir la excreción del mismo al medio de
cultivo. En general, los organismos no excretan los metabolitos
indispensables como los aminoácidos. Aumentando la excreción se
evitarían concentraciones relativamente altas dentro de la célula, que
podrían ocasionar inhibición por retroalimentación, aún en mutantes
resistentes. Una forma de obtener un nivel elevado de excreción de un
aminoácido es el que se utiliza en la obtención del ácido glutámico. La
producción y excreción del ácido glutámico depende de la permeabilidad
celular. El organismo productor del ácido glutámico, Corynebacterium
glutamicum, requiere la vitamina biotina, factor indispensable en la
biosíntesis de los ácidos grasos. La deficiencia en biotina daña la
membrana celular como resultado de una producción deficiente de
fosfolípidos y bajo estas condiciones se excreta el ácido glutámico
intracelular. El medio empleado para la producción del ácido glutámico
contiene en una primera etapa suficiente biotina para obtener un buen
desarrollo del microoganismo y en una segunda etapa la deficiencia de
biotina asegura la excreción de ácido glutámico al medio. El
descubrimiento del papel de la deficiencia en biotina en la producción del
ácido glutámico ha permitido el desarrollo de métodos racionales para la
formulación de un medio para producir este aminoácido.

49. 49
Producción de cortisona utilizando Rhizopus nigricans
Los microorganismos pueden usarse para biocatalizar reacciones
químicas específicas. Este proceso se denomina bioconversión o
biotransformación, e implica el cultivo del MO en fermentadores
grandes, seguido de la adición del compuesto químico que ha de ser
convertido, en el momento adecuado. Después de un período de
incubación, durante el cual el MO actúa sobre el compuesto químico, se
extrae el caldo de fermentación y se purifica el producto que se desee.
Si bien la bioconversión puede usarse para varios procesos, su principal
utilización industrial ha sido la producción de algunas hormonas
esteroideas.
Bioconversión microbiana
Solo la primera reacción es una bioconversión microbiana típica. Esta oxidación
altamente específica es realizada por el hongo Rhizopus nigricans y omite una
difícil reacción química. Todos los otros pasos se realizan químicamente.

50. 50
Enzimas
Las enzimas extracelulares (exoenzimas) se secretan al medio
de cultivo y son capaces de digerir polímeros insolubles como la
celulosa, las proteínas y el almidón; posteriormente, los
productos de digestión son transportados al interior de las
células donde se utilizan como nutrientes para el crecimiento.
Algunas de estas exoenzimas se utilizan en las industrias
alimentaria, láctica, farmacéutica y textil, y se producen en
grandes cantidades por síntesis microbiana. Las enzimas son
biocatalizadores especialmente útiles porque a menudo actúan
en grupos funcionales químicos que son únicos, distinguen
fácilmente entre grupos funcionales similares de una misma
molécula y, en muchos casos, catalizan reacciones de una forma
estereoespecífica, produciendo sólo uno de los dos posibles
enantiómeros (por ejemplo, el enantiómero-D de un azúcar , o
un L-aminoácido.

51. 51
Proteasas, amilasas y jarabes ricos en fructosa
• Las enzimas que más se producen comercialmente son las
proteasas, que se usan como aditivos en los detergentes para lavar
la ropa. La mayoría de los detergentes que se utilizan actualmente
contienen proteasas, amilasas, lipasas, reductasas y otras enzimas.
Muchas de estas enzimas se aíslan de bacterias alcalófilas del
género Bacillus. Otras enzimas importantes fabricadas
comercialmente son las amilasas y glucoamilasas, que se emplean
en la producción de glucosa a partir de almidón. La glucosa se
convierte luego en fructosa (que es más dulce que la glucosa y la
sacarosa) por acción de la enzima glucosa isomerasa. Este proceso
lleva a la obtención de un edulcorante rico en fructosa a partir de
almidón de maíz, trigo o papa.

52. 52
En la conversión del almidón de maíz en el producto llamado jarabe
de maíz rico en fructosa funcionan tres reacciones en secuencia,
cada una de ellas catalizada por una enzima microbiana diferente.
1- La enzima alfa-amilasa lleva a cabo el ataque inicial sobre el
polisacárido almidón, acortando la cadena y reduciendo la
viscosidad del polímero. Esta se llama reacción de adelgazamiento.
2-La enzima glucoamilasa produce monómeros de glucosa a partir de
los polisacáridos acortados, proceso llamado sacarificación.
3- La enzima glucosa isomerasa lleva a cabo la conversión final de la
glucosa en fructosa, proceso que recibe el nombre de isomerización.
Las tres enzimas se producen por fermentación microbiana. El producto
final de esta serie de reacciones es un jarabe que contiene
cantidades aproximadamente iguales de glucosa y fructosa, el cual
se puede adicionar directamente a bebidas refrescantes y a otros
productos alimenticios. Esto permitió a Estados Unidos usar el
almidón de maíz en lugar de importar la sacarosa y ahorrar millones
de dólares por años.

53. 53
Enzimas microbianas y sus aplicaciones

54. 54
Extremoenzimas: enzimas de procariotas que viven en
ambientes extremos.
Algunos procariotas llamados hipertermófilos, tienen un crecimiento
óptimo a temperaturas muy altas y producen proteínas termoestables
que funcionan a altas temperaturas. El término extremoenzimas se
refiere a enzimas que funcionan en condiciones muy altas o muy bajas
de temperatura, pH, salinidad, etc. Los organismos que las producen se
denominan extremófilos.

55. 55
Enzimas inmovilizadas
En algunos procesos biocatalíticos se desea convertir enzimas solubles en
enzimas inmovilizadas. La inmovilización no solo facilita la reacción
enzimática en condiciones de producción continua a gran escala, sino
que también contribuye a la estabilización de las enzimas evitando su
desnaturalización. Existen tres aproximaciones básicas para la
inmovilización de enzimas.
1- Polimerización (entrecruzamiento, cross-linkage) de las
moléculas de enzima. El enlace de unas moléculas de enzima con otras
se hace a través de una reacción química con un agente bifuncional de
entrecruzamiento como el glutaraldehido.
2- Unión de la enzima a un soporte. La unión puede hacerse por
adsorción, enlace iónico, o enlace covalente. Los soportes usados son
celulosas modificadas, carbón activado, arcillas minerales, óxido de
aluminio y bolitas de vidrio.
3- Inclusión enzimática, que comprende la inclusión de la enzima en
una membrana semipermeable. Las enzimas pueden encerrarse en
microcápsulas, geles, membranas semipermeables de polímeros, o
polímeros fibrosos como el acetato de celulosa.
Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas y el
procedimiento utilizado depende de la enzima y de la aplicación
industrial particular.

56. 56

57. 57
Células inmovilizadas
• En algunos casos no es necesario utilizar la enzima purificada.
• Se pueden utilizar células inmovilizadas para utilizarlas en procesos
industriales.
• En general se utilizan para procesos de flujo continuo.
• Se utilizan instalaciones mucho mas económicas.
• Un ejemplo es la utilización de células de Bacillus cuagulans
inmovilizadas para la conversión continua de jarabe de glucosa en
jarabe de fructosa. Este microorganismo es productor de glucosa
isomerasa, la enzima que convierte la glucosa en fructosa.

58. 58

59. 59
Producción de productos de mamíferos por microorganismos
modificados por ingeniería genética.
El mayor interés esta en la producción de proteínas y de péptidos de
mamíferos por medios microbianos, ya que muchos de estos compuestos
tienen un alto valor farmacéutico, son costosos y difíciles de obtener por
otros métodos. A pesar de la excitante promesa de la ingeniería genética
en la biotecnología, lograr la comercialización de un producto es una
empresa gigantesca. Además de la correcta clonación y expresión del gen
de interés en una bacteria o levadura, y de la purificación del producto
deseado, se deben tomar en consideración otros aspectos como las pruebas
clínicas y permisos gubernamentales. Cualquier producto sintetizado
microbiológicamente, que se intente utilizar en el hombre, debe pasar
pruebas clínicas exhaustivas. Por ej., la insulina producida
microbiológicamente mediante la tecnología del DNA recombinante ha
tenido que pasar pruebas clínicas estrictas con voluntarios humanos, a
pesar de que se ha demostrado que la insulina producida
microbiológicamente es idéntica a la proteína fabricada por humanos.
Si todo va bien en las pruebas clínicas, se puede pedir el permiso oficial,
pero esto puede ser un proceso que consume mucho tiempo.

60. 60
Ejemplos de productos biotecnológicos importantes,
fabricados por medio de DNA recombinante.

61. 61
Producción de insulina
La insulina es un hormona. Es una proteína pancreática que regula el
metabolismo de los carbohidratos en mamíferos. La diabetes es una
enfermedad caracterizada por una insuficiencia de insulina y afecta a
millones de personas. El tratamiento estándar consiste en la
administración de ésta hormona periódicamente en forma oral o
inyectable. La hormona proveniente de páncreas de terneros o de
cerdos no resulta tan eficaz como la insulina humana y , además, el
proceso de aislamiento es caro y complejo. Por esta razón se ha
llevado a cabo la clonación del “gen” de la insulina humana en
bacterias.
La insulina humana consta de dos polipéptidos (A y B) conectados por
puentes disulfuro. Estos dos péptidos están codificados por partes
separadas del mismo gen de la insulina. El gen de la insulina codifica
la preproinsulina, un péptido más largo que contiene una secuencia
señal (implicada en la secreción de la proteína), los polipéptidos A y B
de la molécula de insulina activa, y un polipéptido de unión que está
ausente en la insulina madura. La proinsulina se forma a partir de la
preproinsulina, y la conversión de proinsulina en insulina implica la
ruptura enzimática del polipéptido de unión entre las cadenas A y B.

62. 62
Procesamiento de la preproinsulina
La metionina inicial es eliminada de la cadena antes de que se
sintetice la molécula completa de preproinsulina. Tras la
eliminación del péptido líder, la molécula de insulina se pliega y
el péptido C se elimina originando las cadenas A y B de la
insulina. Estas cadenas quedan unidas por puentes disulfuro.

63. 63
Hasta el momento se han utilizado dos métodos para la producción de
insulina humana en bacterias: (1) producción de proinsulina y
conversión en insulina mediante métodos químicos, y (2) producción de
las cadenas A y B en dos cultivos bacterianos separados, así como unión
de las dos cadenas mediante procedimientos químicos para producir la
insulina. Para sintetizar insulina, la secuencia de DNA adecuada se
realizó en forma química. La cadena A consta de 63 bases y la cadena B
de 90 bases. En la proinsulina existen otras 105 bases adicionales que
codifican el péptido C que conecta las cadenas A y B. Se añadieron bases
en los extremos para el corte con enzimas de restricción adecuadas que
permitieran clonar los fragmentos dentro de un plásmido vector. Para
obtener una expresión eficaz, los genes se insertaron debajo de un
promotor adecuado de Escherichia coli, pero de manera que el
fragmento de insulina se sintetizara como parte de una proteína de
fusión para que fuera más estable. Se colocó también un triplete que
codifica para metionina en el punto que unía el gen de la insulina con la
parte superior del gen de fusión para poder cortar luego el producto
formado con bromuro de cianógeno aprovechando la propiedad de que
la insulina no tiene residuos metionina en su molécula y el bromuro de
cianógeno corta específicamente por los residuos metionina.

64. 64
Cuando se utiliza el método de la proinsulina, la proinsulina aislada de
las bacterias por el tratamiento con bromuro de cianógeno, se
convierte en insulina cuando se forma el enlace disulfuro y se produce
la eliminación enzimática del péptido de unión el cual se hace por
tratamiento con las proteasas tripsina y carboxipeptidasa B, que no
tienen efecto sobre la molécula de insulina.
Cuando la insulina se produce mediante los péptidos separados A y B,
cada uno de los péptidos se aíslan de un cultivo independiente y las
cadenas se separan mediante el corte con bromuro de cianógeno. Las
cadenas cortas se conectan luego mediante un tratamiento químico
que permite la formación de los puentes disulfuro.
En los dos casos el producto final es idéntico a la proteína purificada
del páncreas humano y los costos son menores que los requeridos
para la purificación de la insulina de cerdos o de terneros.

65. 65
Ingeniería genética para la producción de insulina humana en bacterias

66. 66
Ingeniería genética aplicada a la producción de xantano
Xantomonas campestris es una bacteria Gram negativa del suelo aeróbica
obligada que produce el biopolímero xantano de importante valor
comercial. Es un exopolisacárido que se produce como un subproducto del
metabolismo secundario. El xantano tiene un alto PM y esta compuesto
por un esqueleto de celulosa (glucosa-β1,4-glucosa) que tiene el
trisacárido manosa-ácido glucurónico-manosa como rama lateral en forma
alternada sobre dicho esqueleto. Posee además los sustituyentes acetato
y piruvato sobre la primera y tercera manosa lateral.

67. 67
El xantano tiene una viscosidad alta, es estable en ambientes físicos y
químicos extremos y tiene propiedades similares a las de un plástico. En
particular las propiedades físicas lo hacen útil como estabilizante,
emulsionante, adelgazante o agente para suspender otros compuestos.
Para la obtención exitosa del xantano en forma comercial se deben
bajar los costos para lo cual se debe disponer de una fuente de carbono
de costo bajo o nulo. Xanthomonas campestris puede utilizar en forma
eficiente glucosa, sacarosa y almidón, pero no puede usar lactosa como
fuente de carbono. El suero es un subproducto de la manufactura de los
quesos. Este consta de 94% a 95% de agua, 3,4 a 4% de lactosa,
pequeñas cantidades de proteínas, minerales y compuestos orgánicos
de pajo PM. Diariamente se producen enormes cantidades de suero por
la industria y son un problema importante. La liberación de este suero a
ríos o lagos puede disminuir la cantidad de O2 disponible y por ende
matar a muchos organismos acuáticos. El transporte de estos sueros a
distintos sitios para su degradación puede ser extremadamente costoso
y puede ser una fuente potencial de contaminación subterránea. Por
otra parte los costos para remover los componentes sólidos del suero
son prohibitivos. En consecuencia, se han desarrollado muchos
esquemas para deshacerse de los sueros en forma creativa.
Teóricamente el suero puede ser usado como fuente de carbono para el
crecimiento industrial de microorganismos importantes.

68. 68
Con esto en mente X. campestris fue modificado genéticamente
para crecer sobre suero. Los genes lacZY de Escherichia coli, los
cuales codifican para la β-galactosidasa y la lactosa permeasa
fueron clonados en un plásmido de amplio rango de huésped bajo
el control transcripcional de un promotor de un bacteriófago de X.
campestris. Esta construcción fue introducida en E. coli y luego
transferida de E. coli a X. campestris por conjugación triparental.
Los transformantes que mantuvieron el plásmido y que expresaron
niveles altos de β-galactosidasa y de lactosa permeasa, utilizan la
lactosa como fuente de carbono y produjeron altos niveles de
xantano usando como fuente de carbono glucosa, lactosa o suero.

69. 69

70. 70
Tipos de fermentadores
El objetivo de la biotecnología es obtener productos metabólicos útiles a partir de
materiales biológicos.
La biotecnología comprende dos fases distintas: la fermentación y la recuperación de
los productos.
Procedimientos de fermentación consisten en:
1- el desarrollo de cepas mediante manipulación genética y/o la regulación del
metabolismo
2- la optimización del medio de cultivo
3- el control adecuado de los factores físico-químicos que afectan al rendimiento de las
fermentaciones industriales (02, Tª, pH, etc.).
Recuperación del producto o "procesamiento posterior" (del inglés downstream
processing) consiste en:
1- la extracción de los productos
2- la purificación de los productos biológicos

71. 71
Cambio de escala
• Las condiciones para obtener los mejores rendimientos a gran
escala no son en general las mismas que las encontradas en
pequeña escala.
Ej. Un cultivo de 200 ml en un erlenmeyer requieren un motor de 300
w para agitarlo; entonces un cultivo de
10.000 litros requerirían un agitador con un motor de 15 megawatios.
Esto no es cierto ya que el motor sería tan grande como una casa y
el calor generado herviría a los microorganismos.

72. 72
Proceso típico de fermentación
• Formulación y esterilización del medio de cultivo.
• Esterilización del equipamiento.
• Crecimiento del cultivo de mantenimiento (5 a 10 ml).
• Crecimiento posterior en un matráz de laboratorio ( 200 a 1000 ml)
• Prefermentador (10 a 100 litros)
• Fermentador de producción (1.000 a 100.000 litros).
• Al terminar la fermentación las células se separan del cultivo líquido.
- Si el producto es intracelular, las células se rompen, se recupera el
producto del fluido celular libre de restos celulares.
- Si el producto es extracelular, se purifica del sobrenadante libre de células.

73. 73
Criterios mas importantes para el diseño de un fermentador
1.- El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos
días, así como para las operaciones de más larga duración.
2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir
las necesidades metabólicas de los microorganismos.
3.- El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.
4.- Debe tener un sistema para el control del pH.
5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.
6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura.
7.- Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas.
8.- El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el
funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas.
9.- El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de
procesos.

74. 74
10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea
posible, soldaduras.
11.- La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños o
mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a
diferentes escalas.
12.- deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados
satisfactorios.
13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.
De los 13 puntos mencionados anteriormente, los dos puntos de mayor relevancia
que hay que considerar son probablemente:
• 1- El mantenimiento de un ambiente aséptico.
• 2- Las condiciones aeróbicas adecuadas.
Los fermentadores más ampliamente utilizados a nivel industrial están provistos de
mecanismos de agitación, dispersión y aireación así como de sistemas para el
control de la temperatura, pH y formación de espuma.

75. 75
Tipos de fermentaciones
1.- Fermentación discontinua
2.- Fermentación alimentada (fed-batch)
3.- Fermentación continua
4.- Reactores de enzimas o células
inmovilizadas

76. 76
1.- Fermentación discontinua
• Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema
cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se
inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en
condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade
nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o
bases para controlar el pH.
• La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la
concentración de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo
de las células observándose las cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia,
fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte.
• En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final
de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de
muerte (metabolitos secundarios).

77. 77
2.- Fermentación alimentada (fed-batch)
• En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de
describir, todos los sustratos se añaden al principio de la
fermentación. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la
fermentación alimentada que se utiliza en la producción de
sustancias como la penicilina. En los procesos alimentados, los
sustratos se añaden escalonadamente a medida que progresa la
fermentación. La formación de muchos metabolitos secundarios
está sometida a represión catabólica (efecto glucosa). Por esta
razón en el método alimentado los elementos críticos de la solución
de nutrientes se añaden en pequeñas concentraciones al principio
de la fermentación y continúan añadiéndose a pequeñas dosis
durante la fase de producción.

78. 78
3.- Fermentación continua
• En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La
solución nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y
una cantidad equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con
los microorganismos, se saca simultáneamente del sistema.
4.- Reactores de enzimas o células inmovilizadas
Consiste en pasar el medio fresco a través de un biorreactor en el
que por diversas técnicas hemos inmovilizado células (o enzimas).
En el biorreactor se producen las transformaciones bioquímicas que
deseamos y recuperamos el producto transformado tras su paso por
la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de
desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo clásico y además el
producto resultante está libre de células. Presenta el inconveniente
de que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse.

79. 79
Reactores de enzimas o células inmovilizadas
• Existen tres métodos de inmovilizar las células:
a.- Asociación física mediante resinas de intercambio iónico. La
unión se puede romper fácilmente.
b.- Unión covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato,
iodo acetil celulosa. Unión fuerte aunque inactivación.
c.- Atrapamiento mediante colágeno, gelatina, agar, alginatos,
poliacrilamida, poliestireno. Es el método más utilizado en
inmovilización de células; para ello se mezclan las células con el
polisacárido líquido y posteriormente se deja enfriar para que
solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta en
una columna.

80. 80
Objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones:
1- minimizar costos
2- incrementar los rendimientos.
Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo de
fermentación más adecuado para cada paso en particular.
El coste de producción de biomasa mediante cultivo continuo es
potencialmente inferior al de cultivo discontinuo, sin embargo, no se
utilizan de forma general en la industria debido fundamentalmente
al mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento de
células en fermentación discontinua.

81. 81
Aunque muchas fermentaciones para la producción de metabolitos
funcionan bien como procesos continuos, sólo unos pocos procesos
han resultado útiles para la aplicación práctica por varias razones:
a.- Muchos métodos de laboratorio operan continuamente durante
solamente 20 a 200 horas; para que sea de utilidad industrial el
sistema debe ser estable durante al menos 500 a 1.000 horas.
b.- Mantener las condiciones estériles a escala industrial a lo largo
de un período de tiempo prolongado es difícil.
Limitaciones prácticas de los procesos continuos
para la fabricación de metabolitos

82. 82
c.- La composición de los sustratos debe ser constante a fin de
obtener una producción máxima. La composición de las soluciones
de nutrientes industriales son variables (líquido de maceración del
maíz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la fisiología
de la célula y disminuir la productividad.
d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen
mutantes degenerados, los cuales pueden crecer en cultivo
continuo más deprisa que las cepas de producción por lo que el
rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menos
células las que sintetizan el producto de interés.

83. 83
FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL RENDIMIENTO
DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES
• 1.- Oxígeno
• 2.- Temperatura
• 3.- pH
1. Oxígeno: El suministro de O2 es uno de los factores más críticos en
la operación de fermentación a gran escala.
- El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el
metabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es el producto
metabólico más importante.
- El oxígeno no es un gas muy soluble ya que, cuando se utiliza aire,
una solución saturada de oxígeno en agua contiene aproximadamente
9 mg /litro y 43 mg/litro cuando se utiliza oxigeno puro. A medida que
aumenta la temperatura disminuye la solubilidad del O2
-El suministro de O2 se logra pulverizando aire en el fermentador
durante el proceso.

84. 84
2.- Temperatura. Es otro parámetro importante.
- Si la temperatura es inferior a la óptima, hay un crecimiento
retardado y menor productividad.
- Si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir
una respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente
producción de proteasas celulares que ocasionan una disminución
en el rendimiento de los productos proteicos.
- A fin de obtener rendimientos óptimos, las fermentaciones deben
ser llevadas a cabo en un margen estrecho de temperatura y en lo
posible constante.
- La velocidad de producción de calor debida a la agitación y a la
actividad metabólica de los microorganismos no se ve compensada
por las pérdidas de calor que resultan de la evaporación, por lo que
se debe recurrir a sistemas de refrigeración. Los mas usados son
las camisas de agua.

85. 85
• 3.- pH
La mayor parte de los microorganismos crecen
óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el
crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares
son liberados al medio, lo que puede originar un cambio
del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe
controlar el pH del medio de cultivo y añadir un ácido o
una base cuando se necesite para mantener constante
el pH. Por supuesto que esta adición del ácido o base
debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el pH
del medio de cultivo sea el mismo en todo el
fermentador.

86. 86
AGITACION Y MEZCLADO
• La agitación es la operación que crea o que acelera el contacto
entre dos o varias fases. Una fermentación microbiana puede ser
considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones
líquido-sólido, gas-sólido y gas-líquido.
1.- La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos.
Puede existir, en algunos casos, una segunda fase líquida si existe
un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos.
2.- La fase sólida consiste en células individuales, bolitas de
micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que
precipitan.
3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de
oxígeno, para la eliminación del CO2 o para el ajuste del pH con
amonio gaseoso.

87. 87
Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es
esencial para la fermentación ya que produce los
siguientes efectos en las tres fases:
1.- Dispersión del aire en la solución de nutrientes.
2.- Homogeneización, para igualar la temperatura, pH y
concentración de nutrientes, en el fermentador.
3.- Suspensión de los microorganismos y de los
nutrientes sólidos.
4.- Dispersión de los líquidos inmiscibles.

88. 88
Bajo estas premisas se podría concluir que
cuanto mayor sea la agitación, mejor será el
crecimiento. Sin embargo, la agitación excesiva
puede romper las células grandes e incrementar
la temperatura lo que ocasiona un descenso en
la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe
conseguir un balance entre la necesidad del
mezclado y la necesidad de evitar el daño
celular.

89. 89
Los diferentes tipos de agitación que se utilizan en las fermentaciones se
incluyen dentro de las siguientes clases:
1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecánico de
agitación.
2.- Columnas de burbujas, la agitación se realiza mediante la introducción
de aire a sobrepresión.
3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno o
externo. La mezcla y circulación de los fluidos son el resultado de las
corrientes de aire introducido, las cuales causan diferencias en la densidad
dentro de las diferentes partes del fermentador.
De estos tres tipos el más utilizado es el primero ya que es más flexible en
las condiciones de operación, es más fácil de conseguir comercialmente,
provee una eficiente transferencia de gases a las células y es el tipo con el
que se tiene más experiencia.

90. 90
Esterilización industrial
Es imprescindible y obligatorio tener en todas las etapas cultivos libres
de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador
de producción.
Hay que esterilizar:
1- El fermentador
2- Todo el equipamiento (uniones, válvulas, electrodos)
3- Medio de cultivo
4- Aditivos (antiespumantes)
- No es necesario esterilizar los ácidos y bases concentrados
- No deben existir roturas mecánicas en el fermentador que podrían permitir la
entrada de microorganismos.

91. 91
Bioreactor
Se puede esterilizar con:
1- Calor
2- Radiación
3- Producto químico
4- Separando los organismos viables mediante un
procedimiento físico como la filtración.
Durante la fermentación se deben observar dos puntos
para asegurar la esterilidad:
- Esterilidad en el medio de cultivo
- Esterilidad del aire que entra y sale

92. 92
ESTERILIZACION DEL MEDIO DE CULTIVO
• Por calor.
• Por filtración.
Esterilización por calor
El exito de la esterilización por calor depende de:
1- el número y tipo de microorganismos presentes
2- la composición del medio de cultivo
3- el valor del pH
4- el tamaño de las partículas en suspensión.
Las células vegetativas son eliminadas rápidamente a temperaturas relativamente
bajas, pero para la destrucción de las esporas se necesitan temperaturas de 121°C.
Esterilización por filtración
Se utiliza frecuentemente para todos los componentes de la solución de nutrientes
que son sensibles al calor (vitaminas, antibióticos, componentes de la sangre, etc).

93. 93
A- Esterilización discontínua de los medios
- Esterilización Indirecta: consiste en inyectar vapor en la camisa del
fermentador o en los serpentines interiores.
- Procedimiento directo: consiste en inyectar vapor en la propia solución de
nutrientes. Pre-requisito, tener vapor puro (libre de aditivos químicos).
Inconvenientes del proceso de esterilización discontinua
- Se requieren tiempos largos para alcanzar y mantener la temperatura de
121oC.
- Es un procedimiento muy costoso, si el agua caliente que se produce
durante el enfriamiento posterior del reactor no se aplica a algún uso.
- Las fases de calentamiento, esterilización y enfriamiento no solamente
matan a los microorganismos, sino que también alteran severamente la
solución de nutrientes (caramelización, deterioro de la calidad del medio,
destrucción de vitaminas, cambio de pH).

94. 94
B.- Esterilización continua
- La esterilización continua es la etapa preliminar lógica en una fermentación
continua a escala industrial
- Para obtener posibles mayores rendimientos en el tiempo y el espacio
asignados se puede utilizar en la fermentación discontinua
- Mientras la esterilización discontinua se lleva a cabo en 30-60 minutos a
121° C, la esterilización continua se lleva a cabo normalmente en 30-120
segundos a 140° C.
- El calentamiento del medio de cultivo para la esterilización continua puede
ser llevado a cabo mediante inyección de vapor o mediante
intercambiadores de calor.
Inconveniente en el proceso de esterilización contínua
- Cuando se usa el método de intercambiadores de calor se pueden formar
sales insolubles (p. ej. fosfato cálcico u oxalato cálcico) con algunas
soluciones de nutrientes.
- Las soluciones que contienen almidón, que se hacen viscosas cuando se
calientan, son difíciles de utilizar en procesos de esterilización continua.
- El tiempo de esterilización puede ser insuficiente si hay partículas insolubles
en el medio.

95. 95
ESTERILIZACION DEL AIRE DE FERMENTACION
• El aire que se suministra al fermentador debe ser esterilizado.
• El número de partículas y microorganismos en el aire varía en gran medida
dependiendo de la localización de la planta, el movimiento del aire y el
tratamiento previo del aire.
Métodos existentes para la esterilización de los gases:
1-filtración
2- inyección de gas (ozono),
3- depuración de gas
4- radiación (UV)
5- calor
Solamente el calor y la filtración fueron utilizados industrialmente.
A partir de la crisis del petróleo de los años 70, el proceso de esterilización por
calentamiento eléctrico ha sido reemplazado por la filtración.

96. 96
Esterilización del aire por filtración
- En los sistemas industriales actuales el aire se esteriliza por
filtración a través de filtros de cartuchos que poseen una estructura
membranosa plegada (ésteres de celulosa, polisulfona o nylon).
- En la actualidad no existen filtros industriales absolutos para
bacteriófagos.
- Los bacteriófagos pueden ocasionar el fallo total de un sistema como por
ejemplo en la producción de ácido glutámico por Corynebacterium
glutamicum o al trabajar con Escherichia coli.
- El aire que sale del fermentador también debe ser esterilizado, sobre todo si
se trabaja con organismos recombinantes. No sólo como medida de
seguridad, sino también para prevenir que las cepas industriales se
liberen al medio ambiente y por lo tanto estén disponibles de una
forma gratuita para los competidores.

97. 97
I. PREPARACION Y PROPAGACION DE INOCULOS
- El tamaño del inóculo generalmente es del orden del 1-10% del
volumen total del medio. Si es inferior a esta proporción puede
existir un período de latencia excesivamente prolongado, lo que
prolongará el período de fermentación.
El proceso de fermentación se lleva a cabo en cuatro etapas:
I. Preservación del inóculo
II. Multiplicación del inóculo
III. Cultivo de prefermentación
IV. Fermentación de producción

98. 98
Etapa I: Preservación del inóculo
• Debe preservarse no solo la supervivencia de las cepas sinó la capacidad
de formar el producto de interés a lo largo de un período de tiempo largo.
• Durante el proceso de selección de cepas, las cepas superproductoras
están frecuentemente dañadas en su metabolismo primario y
frecuentemente degeneran durante las sucesivas transferencias,
probablemente como resultado de mutaciones espontáneas (revertantes).
• El objetivo de la preservación es mantener las cepas durante tanto tiempo
como sea posible sin división celular.
• Las cepas maestras no deberían ser cultivadas más que una vez cada dos
años controlando los niveles de actividad con cada uso
• Dependiendo de la cepa, deben ser llevados a cabo periódicamente
programas de selección.
• Las cepas de trabajo derivan de las cepas maestras.
• Las cepas de trabajo deben ser inspeccionadas en relación a su pureza y
su capacidad de formar producto para posteriormente ser almacenadas
hasta su uso.

99. 99
Etapa II: Crecimiento del inóculo
• El cultivo preservado se reaviva inicialmente
mediante crecimiento en un cultivo líquido en
agitación o en medio sólido si se requiere la
formación de esporas.
• Las condiciones utilizadas en el cultivo inicial
(composición del medio, temperatura de
incubación, etc.) dependerán del proceso
específico.

100. 100
Etapa III: Precultivo en fermentador
• A fin de obtener suficiente inóculo para el fermentador de producción,
deben realizarse precultivos en fermentadores más pequeños. Si un
fermentador de producción se inicia con demasiado poco inóculo, el
crecimiento se retrasa y la velocidad de formación del producto puede ser
insatisfactoria.
• La concentración óptima del inóculo para el fermentador de producción
determina el número de etapas del precultivo de fermentación que son
necesarias.
• En general se requieren las siguientes concentraciones de inóculo:
Actinomicetos...........5 - 10 %
Otras Bacterias..........0,1 - 3,0 %
Hongos..................5 - 10 %
A veces el medio de cultivo de producción se utiliza en la última etapa de
formación del inóculo a fin de inducir la formación del producto.
EtapaEtapa IV:IV: FermentaciFermentacióónn dede producciproduccióónn
DependiendoDependiendo de lade la fermentacifermentacióónn sese utilizanutilizan biorreactoresbiorreactores dede
distintodistinto tamatamaññoo y noy no puedepuede darsedarse unun esquemaesquema generalgeneral parapara lala
inoculaciinoculacióónn de unde un fermentadorfermentador dede producciproduccióónn..

101. 101
II. RECUPERACION DE PRODUCTOS
• En una etapa de recuperación se optimiza la pureza y/o la concentración
de un metabolito.
• En un proceso ideal de recuperación se optimizan ambos parámetros.
• Las técnicas utilizadas en la recuperación de productos químicos
industriales (extracción, destilación, diálisis, cristalización, precipitación,
desecación) fueron perfeccionadas para adaptarlas a materiales biológicos.
• No existe una operación única, ideal o universal, ni siquiera una secuencia
de operaciones que puedan ser recomendadas.
• las operaciones individuales unitarias deben ser combinadas de la forma
más adecuada para cada problema particular.
• En muchos casos la primera etapa de recuperación, al final de una
fermentación, es la separación de los sólidos del líquido que casi siempre
es acuoso.

102. 102
• El producto final deseado puede ser el propio microorganismo o un
metabolito que está presente intra o extracelularmente.
• Los metabolitos intracelulares se liberan de las células
• Las últimas etapas en la recuperación implican precipitación, cristalización
y/o desecación
Ejemplos de metabolitos intracelulares:
1- los ácidos nucleicos
2- las vitaminas
3- las enzimas
4- ciertos antibióticos como la griseofulvina.
Ejemplos de metabolitos extracelulares:
1-los aminoácidos
2- el ácido cítrico
3- el alcohol
4- algunos enzimas (amilasas y proteasas)
5- la mayor parte de los antibióticos (penicilina, estreptomicina).

103. 103

104. 104
Principios del crecimiento bacteriano
Los microorganismos pueden crecer en cultivos en lote (batch),
lote alimentado (fed-batch) o cultivo continuo.
1-En la fermentación en lote, el medio de crecimiento estéril es
inoculado con el microorganismo apropiado y la fermentación
procede sin la adición de medio de crecimiento fresco.
2- En la fermentación en lote alimentado, los nutrientes son
añadidos en forma incremental a varios tiempos durante el proceso
de fermentación; no se remueve el medio de crecimiento hasta que
termine el proceso.
3- En el proceso de fermentación continua, el medio fresco es
añadido en forma continua durante la fermentación, pero al mismo
tiempo un volumen igual de medio utilizado con el microorganismo
suspendido es removido.
Para cada tipo de fermentación se añade dentro del reactor, cuando
es necesario, el oxigeno (el cual es usualmente provisto en forma de
aire estéril), un agente antiespumante, y, si es requerido, ácido o
base.

105. 105
Fermentación en lote
Durante la fermentación en lote, la composición del medio de
cultivo, la concentración de microorganismos (concentración de la
biomasa), la composición química interna de los microorganismos, y
la cantidad de la proteína “target” o del metabolito, todas cambian
como una consecuencia del estado de crecimiento celular, el
metabolismo celular, y la disponibilidad de nutrientes. Bajo estas
condiciones, se observan usualmente seis fases de crecimiento: fase
lag, fase de aceleración, fase logarítmica o exponencial, fase de
desaceleración, fase estacionaria y fase de muerte.

106. 106
Durante la fase logarítmica de crecimiento, la masa celular
sufre varias duplicaciones y la velocidad de crecimiento
específica del cultivo (μ) permanece constante.
Cuando hay exceso de sustrato (suplemento de nutrientes) y no hay
inhibición del crecimiento por un compuesto que está presente en el medio
de crecimiento, la velocidad de crecimiento específica es independiente de
la concentración de sustrato. En este caso, la velocidad de incremento de
la biomasa celular con el tiempo, dX/dt, es el producto de la velocidad de
crecimiento específico, μ, y de la concentración de la biomasa, X:
dX/dt = μ X
La velocidad de crecimiento específico, μ, es una función de la
concentración del substrato limitante (por ej., la fuente de carbono o de
nitrógeno) S, de la velocidad de crecimiento específica máxima, μmax, y de
una constante específica de substrato Ks. Ambas S y Ks son expresadas
en términos de concentración, por ej. en gramos o moles por litro.
μ = μmax S / (Ks + S)
Algunas veces los científicos se refieren al tiempo de duplicación o
tiempo de generación (t) de un cultivo más bien que a una velocidad de
crecimiento específica μ, donde t = ln2/μ. El tiempo de generación de un
cultivo, es el tiempo que éste toma, bajo condiciones definidas, para que
el número de células de la biomasa celular se duplique. Cuando hay un
exceso de substrato (por ej., cuando S>> Ks), luego μ = μmax y se obtiene
la velocidad máxima de crecimiento en fase logarítmica del cultivo.

107. 107
Fermentación en lote alimentado (Fed-Batch)
En las fermentaciones en lote alimentado, el substrato es añadido en incrementos a
varios tiempos a través del curso de la reacción. Estas adiciones prolongan tanto la
fase log como la fase estacionaria, de esta forma se incrementa la biomasa y la
cantidad de síntesis de metabolitos de fase estacionaria, tales como los
antibióticos. Sin embargo, los microorganismos en fase estacionaria a menudo
producen enzimas proteolíticas o proteasas, y estas enzimas pueden atacar algún
producto sintetizado por un microorganismo modificado genéticamente. Luego,
para las proteínas producidas por microorganismos recombinantes, es importante
prevenir que la reacción de fermentación alcance esta parte del ciclo de
crecimiento. Generalmente, las fermentaciones en lote con alimentación requiere
más monitoreo y mayor control que las fermentaciones en lote y son luego
utilizadas en menor medida. La adición periódica de substrato al cultivo microbiano
en crecimiento prolonga la fase log de crecimiento y demora el “onset” de la fase
estacionaria, la cual inicia las respuestas de stress celular, la producción de
proteasas y otros cambios metabólicos que afectan el rendimiento de la proteína
recombinante. Una estrategia de fermentación en fed-batch puede incrementar el
rendimiento de 25% a mas de 1.000%, comparado con la fermentación en batch,
dependiendo del microorganismo en particular, su background genético y la
naturaleza de la proteína recombinante.
Los procesos de fed-batch no se limitan solamente a células microbianas sino que
pueden ser utilizados con cultivos de células de mamíferos y de insectos.

108. 108
Fermentación continua.
En una fermentación continua, una condición de estado de equilibrio o
“steady-state”, donde la variación de la concentración de la biomasa en
función del tiempo es igual a cero (dX/dt = 0) se alcanza cuando el
número total de células y el volumen total en el biorector permanecen
constantes. En otras palabras, bajo esas condiciones, la pérdida de
células debido al “outflow” o remoción del producto está balanceado
exactamente por la ganancia de nuevas células por el crecimiento
(división celular). Para obtener un cultivo estable termodinámicamente,
la velocidad de crecimiento específica, μ, del cultivo debe ser menor que
la velocidad de crecimiento máxima alcanzable, μmax. En la práctica, esta
condición se alcanza ajustando la bomba que controla la velocidad de
flujo volumétrico, mientras se mantiene el volumen del cultivo en el
birreactor constante.
El objetivo fundamental de la fermentación industrial es minimizar los
costos y maximizar los rendimientos. Este logro se puede lograr a través
de desarrollos tecnológicos que permitan una fermentación más eficiente
para cada proceso en particular.

109. 109
Si bien los procesos de fermentación continua no son usados frecuentemente en
procesos industriales, principalmente debido a la mayor experiencia que los
científicos tienen con células creciendo en el modelo de lote o batch, el costo de
producción de una biomasa celular por cultivo continuo es potencialmente mucho
menor que el de producir la misma biomasa por fermentación en batch. Los factores
que se indican a continuación dan cuenta para el ahorro de costos.
1- Fermentaciones continuas utilizan birreactores menores que los fermentadores en
batch para producir la misma cantidad de producto.
2- Luego que una fermentación en batch en gran escala es completada, se necesita
un equipo en gran escala para cosechar, romper las células, y el subsiguiente
proceso de purificación de la proteína o del metabolito. En los procesos continuos a
medida que se va produciendo el producto, éste se va procesando y de esta manera
se requieren equipos más pequeños.
3- En las fermentaciones continuas se elimina el tiempo muerto entre corrida y
corrida que hay en los cultivos en batch, durante el cual el birreactor es preparado
para ser usado nuevamente (reparación, lavado, esterilización, etc). Fermentaciones
continuas tienen menores tiempos perdidos porque una reacción simple puede ser
mantenida por tiempos mas prolongados.
4- El estado fisiológico de las células durante la fermentación continua es más
uniforme, debido a ello los rendimientos del producto tienden a ser más
consistentes. En fermentaciones en batch, pequeñas diferencias en el tiempo de la
cosecha de células (timing), la cual coincide con el crecimiento en fase media o
logarítmica de crecimiento, pueden llevar a diferencias fisiológicas significativas.
Las fermentaciones continuas pueden ser usadas para la producción comercial de
proteína celular simple, antibióticos, y solventes orgánicos.

110. 110

111. 111
FIN

112. 112
a) Batería de pequeños fermentadores de investigación. b) fermentadores
industriales

113. 113
Producción de vinagre
El vinagre es el producto resultante de la conversión del alcohol etílico en
ácido acético por la acción de las bacterias del ácido acético que son
miembros de los géneros Acetobacter y Gluconobacter. El vinagre puede
producirse a partir de cualquier sustancia que contenga etanol. La materia
prima habitual es el vino, la cerveza o el zumo alcohólico de manzana. Las
bacterias del ácido acético son aeróbicas pero no oxidan completamente sus
dadores de electrones orgánicos hasta CO2 y agua, sino que lo hacen hasta
ácido acético, son muy tolerantes a los ácidos. El problema principal en la
producción del vinagre consiste en garantizar una aireación suficiente del
medio. Existen tres métodos diferentes para la producción del vinagre:
método de Orleans o de tinaja abierta, método de goteo (vinagre rápido) y
método del burbujeo. La tinaja se denomina generador de vinagre
Diagrama de un generador de vinagre. El
líquido alcohólico se hace goteas a través de
virutas de madera y se deja que el aire pase
desde el fondo hacia arriba y a través de las
virutas. Las bacterias del ácido acético se
desarrollan sobre las virutas de madera y
convierten el alcohol en ácido acético. La
solución de ácido acético se acumula en una
cámara colectora y se recicla a través del
generador hasta que se alcanza un contenido
en ácido acético de al menos 4%, cantidad
mínima para ser considerado “vinagre”.

114. 114
Fermentación del ácido cítrico
Se produce microbiológicamente por fermentación utilizando el hongo Aspergillus
niger. Este hongo excreta grandes cantidades de ácido cítrico cuando el medio en
el fermentador es deficiente en hierro, ya que el hongo superproduce el ácido
cítrico como agente quelante para apoderarse del hierro. El medio de partida para
la obtención del ácido cítrico puede ser muy variado (almidón de papa, hidrolizados
de almidón, jarabe de glucosa procedente de almidón sacarizado, sacarosa, jarabe
de caña de azúcar, melazas de caña de azúcar y melazas de remolacha azucarera).
Si se utiliza almidón, las amilasas formadas por el hongo la hidrolizan a azúcares.
Los azúcares se catabolizan a través de la vía glicolítica y entran en el ciclo del
ácido cítrico, en el que tiene lugar la producción de citrato.
El proceso es aeróbico y se realiza en grandes
fermentadores bien aireados. El ácido cítrico se
produce de esta forma como un metabolito típico
secundario. Durante la fase de crecimiento, la
sacarosa se descompone en glucosa mas fructosa
y, en el momento que se alcanza la fase
estacionaria, quedan grandes cantidades de estas
hexosas, que se convierten en ácido cítrico para
contrarrestar la falta del hierro. El desarrollo de
este tipo de fermentación aeróbica industrial tubo
una gran importancia histórica y esta tecnología se
aplicó luego a otras fermentaciones de antibióticos
importantes como la penicilina.

115. 115
Usos industriales de las levaduras
Las levaduras son los microorganismos más importantes y más ampliamente utilizados
en la industria. Se cultivan por sus propias células, por sus componentes celulares y por
los productos finales que producen durante la fermentación alcohólica.
La producción de células de levadura y la producción de alcohol mediante levadura son
dos procesos diferentes desde el punto de vista industrial en el hecho en que el primero
requiere la presencia de oxígeno para la máxima producción de material celular,
mientras que la fermentación alcohólica es anaerobia. Sin embargo en casi todos los
procesos industriales se utiliza una misma especie de levadura, o especies similares de la
misma, a saber , Saccharomyces cerevisiae.

116. 116
Producción industrial de células de levadura.
Se utilizan como agente estimulante del leudado de la masa antes de la cocción. La
levadura que se utiliza en panadería o para fines alimentarios se cultiva en grandes
fermentadores aireados, en un medio que contiene melazas como agente principal. La
melazas contienen grandes cantidades de azúcar que sirve como fuente de carbono y
de energía y, además contienen minerales, vitaminas y aminoácidos que son utilizados
por la levadura, se añade además fosfatos y sulfato de amonio como fuentes de
fósforo, azufre y nitrógeno. No es conveniente añadir todas las melazas al mismo
tiempo, ya que se producirá un exceso de azúcar y la levadura fermentará parte de
éste azúcar en alcohol y CO2, en lugar de convertirlo en células de levadura. Las
melazas se añaden a medida que el cultivo de levadura crece y consume este azúcar.
Finalizado el período de crecimiento, las
células de levadura se recuperan del
caldo por centrifugación y se lavan
mediante suspensión en agua y nueva
centrifugación. La levadura de panadería
se comercializa en forma de pastillas
como levadura prensada (mezclada
con otros aditivos como agentes
emulsionantes, almidón, etc) o como
polvo seco (levadura seca activa) luego
de mezclarla con aditivos y secarla al
vacío.

117. 117
Alcohol y bebidas alcohólicas
El uso de levadura seca en la producción de bebidas alcohólicas es un proceso ancestral. La
mayor parte de los zumos de fruta sufren una fermentación natural ocasionada por las
levaduras “silvestres” que están presentes en la fruta. A partir de estas fermentaciones
naturales se han seleccionado algunas levaduras para conseguir una producción más
controlada. Las bebidas alcohólicas más importantes son el vino, producido por la
fermentación del zumo de fruta, la cerveza, producido por la fermentación de cereales
malteados, y las bebidas destiladas, producidas por concentración, mediante destilación,
del alcohol procedente de una fermentación.
Vinos: en general proceden de la uva. En los vinos
secos se ha fermentado casi todos los azúcares del
zumo o mosto; en los vinos dulces, se deja parte
del azúcar, o bien se añade azúcar después de la
fermentación. En un vino fortificado se le agrega
algún licor después de la fermentación. En un vino
espumoso se encuentra presente el CO2 que surge
de una fermentación final que realiza la levadura
directamente dentro de la botella.
Bebidas alcohólicas destiladas
Whisky, destilado de bebidas
con malta; brandy es el
destilado del vino; ron,
destilado de melazas
fermentadas; vodka destilado
de cereales de papa
fermentados.

118. 118
Fabricación comercial de vino
a) Equipo para transportar las uvas
hasta la bodega.
b) Tanques grandes donde tiene lugar la
fermentación principal del vino.
c) Barricas en las que tiene lugar el
proceso de envejecimiento.

119. 119
Fabricación de cerveza en una planta industrial.
a, b) Calderas de cobre donde el
mosto se mezcla con el lúpulo y
luego se lo lleva a ebullición.
Desde la caldera, el líquido se
pasa a grandes tanques de
fermentación, en los que la
levadura fermenta la glucosa y da
lugar a etanol más CO2.
c) En cervezas tipo lager, la
cerveza se almacena barias
semanas a baja temperatura en
tanques, donde se produce la
sedimentación de partículas,
incluidas las células de levadura.
d) La cerveza se filtra y se
deposita en tanques de
almacenamiento a partir de los
que se envasa en barriles
pequeños, en botellas o en latas.

120. 120
Bibliografía:
Brock Biología de los Microorganismos (10ª Edición)
Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant
DNA (Second Edition). Bernard R. Glick and Jack J. Pasternak.
http://nostoc.usal.es/sefin/MI/
TEMA 12: TIPOS DE FERMENTADORES Dr. Pedro F. Mateos González

121. 121

122. 122
Streptomyces
• Streptomyces es el género más extenso de Actinobacteria, un grupo de
bacterias Gram-positivas de contenido GC generalmente alto.
• Las especies del género Streptomyces se caracterizan por poseer un
metabolismo secundario complejo (rutas metabólicas no requeridas para la
supervivencia).
• Producen numerosos antibióticos de uso clínico como estreptomicina, ácido
clavulánico, neomicina, cloranfenicol, etc
• El genoma completo de S. coelicolor A3(2), fue publicado en 2002. La
secuencia genómica de S. avermitilis fue completada en 2003.
• Streptomyces spp. es objeto de investigaciones en biotecnología para la
producción de proteínas recombinantes humanas porque tiene la habilidad
de secretar proteínas recombinantes correctamente plegadas en el medio
de producción, lo que simplifica los pasos subsecuentes de purificación.
Esta característica, entre otras, hacen Streptomyces spp. una alternativa
atractiva a otras bacterias tales como E. coli y Bacillus subtilis

123. 123
Streptomyces en Medicina
Streptomyces es el género que produce el mayor número de antibióticos, tanto
bactericidas como fungicidas, y también un amplio rango de compuestos bioactivos
tales inmunosupresores.
• Antibióticos antifúngicos
– Nistatina (S. noursei)
– Anfotericina B (S. nodosus)
– Pimaricina (S. natalensis)
• Antibióticos antibacterianos
– Eritromicina (S. erythreus)
– Neomicina (S. fradiae)
– Estreptomicina (S. griseus)
– Tetraciclina (S. rimosus)
– Vancomicina (S. orientalis)
– Rifamicina (S. mediterranei)
– Cloranfenicol (S. venezuelae)
– Daptomicina (S. roseosporus)
• Inmunosupresores
– Tacrolimus

124. 124
Desarrollo de agentes quimioterapéuticos
• 1900 Paul Ehrlich (concepto de toxicidad selectiva). Estudió
sustancias químicas que teñian los microorganismos y no los
tejidos. Descubrió el Salvarsán (compuesto que contiene arsénico)
que se usaba para el tratamiento de la sífilis.
• 1930 Gerard Domang estudió en animales de experimentación
numerosos productos químicos sintéticos, principalmente
colorantes, que fuesen activos frente a enfermedades infecciosas.
Descubrió las sulfamidas. El Pronotosil de la Compañía Química
Bayer fue el primer compuesto activo con capacidad de curar
infecciones estreptocócicas en ratones. El Pronotosil se degradaba
a sulfanilamida en el cuerpo del animal y éste era el verdadero
compuesto activo.

125. 125
• Posteriormente D.D.Woods demostró que el ácido p-amino-
benzoico contrarrestaba específicamente la acción inhibitoria de la
sulfanilamida y que los estreptococos requerían el ácido p- amino-
benzoico para su crecimiento. Esto condujo al concepto de análogo
de factor de crecimiento, que permitió a los químicos proseguir con
la síntesis de una gran variedad de agentes quimioterapéuticos.
• 1929 Alexander Fleming. Trabajaba con variantes de estafilococos.
Descubrió una sustancia producida por un hongo del género
Penicillum a la que llamó penicilina.
• 1939 Howard Florey y colaboradores produjeron penicilina a gran
escala y demostraron que la misma era efectiva en el tratamiento de
enfermedades infecciosas.

126. 126
Descubrimiento de la penicilina
La penicilina G o bencilpenicilina fue el primer antibiótico empleado
ampliamente en medicina; su descubrimiento ha sido atribuido a Alexander
Fleming en 1928, quien junto con los científicos Ernst Boris Chain y
Haward Walter Florey - quienes crearon un método para producir en masa
el fármaco y probaron su eficacia para el control de enfermedades
infecciosas- recibieron el Premio Nobel de Medicina o Fisiolofía en 1945
por sus descubrimientos. El premio en partes iguales, lo obtuvieron “for the
discovery of penicillum and its effect in various infectious diseases”.

127. 127
Penicillum notatum
Penicilina
Descubrimiento de la PENICILINA
Definida inicialmente como “antiséptico natural de efectos lentos”

128. 128
Historia de la penicilina
• El descubrimiento de la penicilina según Alexander Fleming ocurrió el 28 de
septiembre de 1928, cuando estaba estudiando cultivos bacterianos de
Staphylococcus aureus en el sótano del laboratorio del Hospital St. Mary en
Londres.
• La identificación del espécimen como Penicillium notatum la realizó Charles
Tom.
• Desde 1929 y hasta 1940 sólo se utilizó el caldo del cultivo del Penicillum
notatum como antiséptico local.
• La primera demostración de que la penicilina era útil para la medicina la
llevó a cabo en 1930 el patólogo inglés Cecil George Paine discípulo de
Fleming.
• En 1939 en la Sir Willam Dunn School of Pathology de Oxford los trabajos
sobre la penicilina son retomados por E. B. Chain, H. W. Florey y N. G.
Heatley. Chain se ocupó de las propiedades químicas y bioquímicas,
Heatley de su producción (como obtener el principio activo y purificarlo de
los caldos de cultivo) y Florey se encargó de los aspectos biológicos y
farmacológicos y de la obtención de fondos.

129. 129
• La purificación de la penicilina se produjo en 1939, a cargo del bioquímico
Norman George Heatley. A Heatley no le alcanzó la fama ni la publicidad ni
la fortuna. Los honores llegaron más tarde cuando se retiró, en 1978 recibió
la Orden del Imperio Británico (OIB) y en 1990, la Universidad de Oxford le
confirió el grado honorario de Doctor en Medicina, el primero conferido en
800 años de historia de la Universidad.
• La interpretación mas breve y acertada de esta historia es la de Henry
Harris, sucesor de Florey en la Sir William Dunn School of Pathology: To
sum it all up: without Fleming, no Chain or Florey; without Chain, no Florey;
whithout Florey, no Heatley; without Heatley, no penicillin. (Harris H. Howard
Florey and the development of penicillum. Notes Rec R Soc Lond. 1999; 53:243-52)
Sacado del editorial sobre la historia de la penicilina. La segunda línea de Juan Antonio Barcat.
http://www.medicinabuenosaires.com/revistas/vol66-06/4/Editorial-
Sobre%20la%20historia%20de%20la%20penicilina.pdf

130. 130
EL PREMIO NOBEL
FLEMING FLOREY CHAIN
PREMIO NOBEL DE MEDICINA Y FISIOLOGÍA EN 1945

131. 131
“Todos sabemos que la casualidad, la fortuna o el destino, como cada
cual desee llamarlo, ha jugado un papel destacado en muchos de los
grandes descubrimientos científicos. Esto es especialmente acertado en
el caso de la Biología, puesto que trata de los mecanismos de la vida,
sobre la que existen multitud de lagunas en nuestro conocimiento.”
A. Fleming

132. 132
Evaluación de antimicrobianos

133. 133

134. 134
Cultivos biotecnológicos en la Argentina
Reporte Anual 2008
- Argentina es el segundo productor mas grande de cultivos
biotecnológicos (después de Estados Unidos), con un área estimada de
19,8 millones de hectáreas para la cosecha 2007/08 (soja, algodón,
maíz).
Soja: 100%, variedad obtenida por biotecnología (17millones de hect.)
Maíz: 74%, variedad obtenida por biotecnología
Algodón: 90%, variedad obtenida por biotecnología
- Introducción de la soja biotecnológica en la Argentina en 1990.
- En Mayo del 2008 la Secretaría Argentina de Agricultura , Ganadería,
Pesca y Alimentos (SAGPyA) aprobó la utilización de una variedad de
maíz con la suma de tres desarrollos biotecnológicos en un mismo
producto, variedad HX+LL+RR (tolerancia a los herbicidas Glyphosate y
Glufosinate y resitencia a Lepidoptera).
HX (Herculex I technology) protección contra insectos
LL (Liberty Link technology) resistencia al glufosinato de amonio y RR
(Rounup Ready technology) resistencia al glifosato; ambos herbicidas.

135. 135
En la Argentina hay doce variedades biotecnológicas aprobadas para
su producción y comercialización:
- 1 para soja (empresa Monsanto)
- 2 para algodón (Monsanto)
- 9 para maíz ( Ciba-Geigi. AgrEvo, Monsanto, Novartis, Syngenta,
Dow/Pioneer y Pioneer.
Soja
-En 1996 fue liberado el cultivo de soja tolerante a glifosato
(Roundup Ready soybean). Este cultivo fue el primero introducido en
la agricultura Argentina y permitió la incorporación del cultivo doble
de soja (siguiendo al de trigo) en muchas áreas donde solo se
plantaba un cultivar.
- En Argentina la economía de la soja esta orientada casi totalmente
a la exportación: 2%, uso domestico, 30% exportado como grano y
el 68% es procesado por la industria de los aceites de semilla.
-93% del aceite de semilla y 99% de los productos laterales
(alimentos) son exportados.

136. 136
En 2007 el gobierno simplificó el proceso de aprobación para eventos
apilados, permitiendo aplicaciones para un cultivo transgénico
combinando dos eventos ya aprobados sin un análisis total del nuevo
cultivo.
Maíz
-En Agosto de 2007 se aprobó en la Argentina el primer producto en
el cual se había apilado la suma de dos desarrollos biotecnológicos
permitiendo a la empresa Monsanto la introducción de un maíz de una
variedad modificada para producir una sustancia tóxica para los
parásitos taladradores de maíz y para la resistencia a glifosato, un
herbicida para el control de malezas (variedad NK603x810).
- En Mayo de 2008 Pioneer recibió aprobación para una variedad de
maíz conteniendo un desarrollo para la protección contra insecto y
resistencia a los herbicidas glufosinato y glifosato.
74% del área plantada representa variedades biotecnológicas.
63% variedad de maíz Bt
9% tolerante a glifosato
2% variedades con eventos apilados (aproximadamente 82.000
hectáreas).

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Algodón
90% del área plantada corresponde a algodón modificado por
biotecnología. 44% resistente a glifosato y 57% resistente a lepidóptero
(variedad Bt). Debido al menor uso de insecticidas se mostró una
ventaja económica al usar las variedades modificadas.
Se están llevan a cabo en el INTA investigaciones para obtener
variedades de algodón coloreadas.
Aceite de semillas de colza
El Instituto Nacional de Semillas (INASE) tiene prohibido la importación
de semillas de colza biotecnológica y estableció el requerimiento de un
certificado de ausencia de semillas de colza biotecnológica en los
embarques de semillas.
Vacas clonadas: tecnología de vanguardia
Argentina fue el primer país de América latina en desarrollar dos
generaciones de vacas clonadas capaces de producir la hormona de
crecimiento humana.

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En Marzo de 2006, CONABIA (Comité Asesor Nacional de Biotecnología
en Agricultura) y SENASA (Servicio Nacional de Agricultura y Calidad y
Sanidad Animal) aprobó el primer paso para autorizar la producción de
hormona de crecimiento humana en leche. El próximo paso que
necesita para ser completada es la aprobación por la Secretaría de
Salud Pública.
Los terneros clonados, Pampa Mansa II, Pampa Mansa III y Pampero,
desarrollados por la compañía Biosidus, llevan un gen que produce la
hormona de crecimiento humana en la leche. La leche producida por
una sola vaca puede alcanzar para la demanda entera de nuestro país.
En el 2007, la compañía Biosidus desarrolló otra línea de vacas
clonadas, esta vez para producir insulina. Después de 4 años de
investigación y mas de 4 millones de dólares invertidos, “Patagonia”
fue la primera vaca clonada. En este caso, la insulina producida por 25
vacas como Patagonia podrían satisfacer la demanda anual de nuestro
país a un costo bajo (30% menos que el costo actual de la insulina).
La intención es producir suficiente insulina como para ser capaces de
exportar en un futura cercano.

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Política Biotecnológica
Sistema regulatorio de Bioseguridad
El sistema regulatorio de bioseguridad en la Argentina esta basado
sobre la evaluación del producto y no del proceso a través del cual
este es obtenido. La evaluación tiene lugar sobre la base de caso
por caso, tomando en consideración el proceso solo en el caso
donde el medio ambiente, la producción de la agricultura o la salud
de animales o humanos puedan estar en riesgo.
La oficina clave dentro de la SAGPyA que centraliza todas las
actividades biotecnológicas y la información es la Oficina de
Biotecnología creada en 2004. Esta oficina coordina tres áreas
técnicas:
- Asuntos de bioseguridad (la autoridad es un miembro de la
CONABIA)
- Policía de análisis y formulación
- Diseño Regulatorio