tecnica explicada de citometria de flujo

1. UNIVERSIDAD VERACRUZANA
INMUNOLOGÍA BÁSICA
CITOMETRÍA DE FLUJO
Carlos Manuel Malpica Márquez
Greysi Gutiérrez porras
Sara Hernández Xico

2. CITOMETRÍA DE FLUJO
 Su fundamento se basa en hacer pasar una
suspensión de partículas (generalmente
células) alineadas y de una en una por
delante de un haz de láser focalizado.
 La citometría de flujo es un proceso que
permite la medida simultánea de múltiples
características físicas de una sola célula.
Estas medidas son realizadas mientras las
células (partículas) pasan en fila, a una
velocidad de 500 a 4000 células por
segundo, a través del aparato de medida
en una corriente de fluido.

3. SISTEMA NECESARIO DEL CITÓMETRO
 Fluidos. La muestra que será
analizada
 Óptica. Es una fuente de excitación y
un sistema de colección para generar
y recoger las señales luminosas.
 Electrónica. Para convertir las señales
ópticas en señales electrónicas
proporcionales y digitalizarlas para
análisis computacional.

4. SISTEMA HIDRÁULICO
 Controles neumático y fluidos
para establecer un flujo laminar
que permita a la suspensión
celular atravesar la cámara de
flujo.

5. SISTEMA ÓPTICO
 Láser. Argón con luz monocromática de 488nm , filtros
, lentes y detectores.
 SISTEMA ELECTROINFORMATICO. Convierte la luz
dispersa en señales eléctricas y las procesa para su
análisis.

6. PARÁMETROS
 Características
morfológicas de la célula
: tamaño y complejidad del
citoplasma
 Características antigénicas de
la célula : Inmunofenotipo.

8. OBJETIVOS PRINCIPALES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
 Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas.
 Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas (por
deflexión electrostática ; esta tecnología de separación se llama "electronic
cell sorting")
 Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas
 NOTA. DE. Refiere a una técnica para modificar la trayectoria de un flujo de partículas cargadas por el uso
de un campo eléctrico aplicado transversal a la trayectoria de la técnica de partículas. Se llama
electrostática debido a que la fuerza y la dirección del campo aplicado cambia lentamente con relación a
el tiempo que toma para que las partículas a transitar por el campo, y por lo tanto se puede considerar no
cambiar para cualquier partícula en particular.

9. COMO SE DETECTAN ESTAS
CARACTERÍSTICAS

10. EL CITÓMETRO DE FLUJO DETECTA COMO LAS CÉLULAS INTERACTÚAN CON UN
RAYO LÁSER EN TÉRMINOS DE CÓMO LA CÉLULA :
a) Desvía la luz incidente (parámetros FSC y SSC)
b) Emite fluorescencia (parámetros FL1. FL2. FL3.)
las propiedades de dispersión de la
luz en una célula nos da información
acerca del tamaño celular y
granularidad.

11. SEÑALES DE DISPERSION
Forward Scatter (FS)
Es la luz dispersada frontalmente en
ángulo cónico pequeño (0-10 grados )
coincidente con luz incidente y es
proporcional a tamaño de la partícula
que produce la dispersión.
 La luz es desviada a bajos ángulos
entre 1 y 10 grados.
 Generalmente proporcional al
tamaño celular.
 Detectada a lo largo del eje del rayo
de luz incidente en dirección
delantera.
Side Scatter (SSC)
Es la luz dispersada lateralmente es
proporcional al la complejidad de la
estructura celular.
 Luz es desviada a altos ángulos.
 Proporcional a la granularidad de la
célula y su complejidad.
 Detectado a 90 grados del eje de
luz incidente.

12. FLUORESCENCIA
 Un fluorocromo es una molécula química que absorbe la luz a una determinada
longitud de onda (energia ) energía de excitación y emite a una longitud
superior (menor energia).
 Interacciona con la luz de excitación procedente de el láser.
 Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales ) para antígenos de la
célula.
 La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la
cantidad de sitios de unión.

13. CÓMO SE OBTIENE LA LUZ FLUORESCENTE.
 Unión de sitios específicos con anticuerpos marcados con
fluorocromos.
 El fluorocromo absorbe energía del láser.
 El fluorocromo libera energía absorbida por :
a) Vibración y disipación del calor.
b) Emisión de fotones a una mayor longitud de onda
Llamada fluorescencia.

14. REACTIVOS FLUORESCENTES
 Marcadores fluorescentes de unión covalente: Isoticianato de Fluoresceina,
Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.
 Marcadores fluorescentes de unión no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de
acrimina, yoduro de propidio, rh12.
Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente .
 Pequeñas moléculas orgánicas (FITC, biotina): unión covalente directa con
grupos amino libres en anticuerpos.
 Proteínas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a
través de algunos reactivos.

15. REALIZACIÓN DE
CITOMETRIA DE
FLUJO

16. SE HACE EN 3 ETAPAS INDEPENDIENTES :
 Fase pre-citometría: preparación de los reactivos,
preparación de las células, diseño del protocolo y
coloración de las células con los reactivos
fluorescentes.
 Fase de citometría de flujo : involucra el
procesamiento de las células marcadas y la
recolección de los datos para cada una de las
medidas (parámetros) realizados en cada célula
individual.
 Fase de análisis: análisis de los datos recolectados

17. PROCESAMIENTO:
 La mezcla de células teñidas con diferentes fluorocromos es
forzada a pasar a través de una aguja creando una delgada fila
de líquido que contiene las células.
 A medida que cada célula pasa en frente del láser, desvía el
rayo incidente y las moléculas teñidas unidas a la célula van a ser
excitadas y emiten luz fluorescente.
 Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las
emisiones fluorescentes, la información es digitalizada y
procesada por el computador.
 Los resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots".

18. RESULTADOS
Dot-plots Histogramas

19. APLICACIONES
 Hematología: tipificacion y conteo de células, reticulocitos y análisis de
medula ósea .
 Farmacología: estudios de cinética celular.
 Inmunología: subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular.
 Oncología: Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos.
 Microbiología: diagnostico bacteriano y vírico ,estudios de sensibilidad a los
antibióticos.
 Genética: Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico prenatal.

20. INMUNOTIPIFICACIÓN
ES EL PROCESO PARA DETERMINAR MARCADORES EXPRESADOS EN LA SUPERFICIE CELULAR.

21.  Esta detección se hace empleando anticuerpos
monoclonales antígeno-específicos marcados con un
fluorocromo dirigidos al marcardor que queremos
evaluar.
 Para esto, es necesario aislar previamente las células
a analizar ( por ejemplo linfocitos, a partir de sangre
total, por gradiente de ficoll ). Las células son luego
estimuladas a producir los marcadores poniéndolas
en contacto con un antígeno capaz de estimular su
síntesis.

22.  Posteriormente estas son incubadas con una sustancia denominada brefeldina A (BFA) cuya función
es impedir que las células expulsen las citoquinas que están sintetizando, haciendo entonces que se
acumulen en su interior. Después las células son fijadas, permeabilizadas y finalmente marcadas con
los anticuerpos específicos. Una vez realizado este último procedimiento, las células están listas para
ser leídas en el clitómetro

23. ENSAYO DE CAPTURA DE SECRECION
 Se ha utilizado para cuantificar la secreción de citoquinas a partir de linfocitos T
El procedimiento utilizado es :
 Encapsulación de la célula en una microgota de agarosa con biotina
 Incorporación de un anticuerpo dirigido contra la citoquina que queremos detectar
 Unión no específica y retención del anticuerpo en la matriz de agarosa
 Incorporación de un segundo anticuerpo que reconoce la unión antígeno- anticuerpo ya
formada. Este segundo anticuerpo está marcado con un fluorocromo
 Las microgotas se analizan en el citómetro, midiendo la fluorescencia emitida por el
fluorocromo, que es proporcional a la unión antígeno-anticuerpo

24. DETERMINACION DEL CONTENIDO CELULAR DE DNA
 Una suspensión de células es coloreada con un colorante fluorescente que se une
estequiométricamente con el DNA. La cantidad de colorante unido es entonces proporcional
a la cantidad de DNA. Las células coloreadas se introducen entonces en el citómetro y la luz
fluorescente emitida es proporcionarle al contenido de DNA de cada célula.
 Este análisis nos da información además sobre la distribución de las célula en las diferentes
fases del ciclo celular (G1, S, G2 o M). Sin embargo no es posible diferenciar G2 y M ya que en
las dos se encuentra el mismo contenido de DNA. Se han desarrollado modelos matemáticos
para establecer el porcentaje de células que se encuentran en cada fase. Esta información
puede complementarse utilizando antígenos cuya expresión está restringida a un momento
del ciclo celular en particular. Por ejemplo en las fases G1 y S tempranas hay un incremento
en la excreción del antígeno celular nuclear proliferante (PCNA) : por otra parte el antígeno
Ki-67 es una proteína nuclear que se incrementa linealmente a través de todo el ciclo celular
alcanzando la concentración máxima en G2 y M. Al marcar estás proteínas con anticuerpos
específicos unidos a un fluorocromo, podemos entonces establecer con mayor precisión la
fase del ciclo celular en que se encuentra la célula.

25.  La medida del contenido de DNA también ha sido utilizada para determinar el
grado de aploidía de células malignas y el porcentaje de estas que se
encuentran en fase S. Algunos autores sugieren que esta información es útil para
conocer el tamaño del tumor, el estado nodal y el estado de expresión de
marcadores para ayudar a establecer el pronóstico del tumor

26. APOPTOSIS
 La apoptosis es la muerte celular programada. Hay varias enzimas implicadas en este proceso celular.
Dichas enzimas pueden ser determinadas por citometría de flujo al ser unidas a anticuerpos marcados con
fluorocromos (por ejemplo la dipeptidilpeptidasa, calpaina, aminopeptidasa y catepsina D , las dos últimas
implicadas en el proceso de apoptosis inducido por citoquinas y expresadas en la superficie celular.

27. FAGOCITOSIS
 Marcando bacterias con un colorante fluorescente, se puede analizar el proceso de fagocitosis de estas
por parte de macrófagos y neutrófilos

28. VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
 Análisis de un número estadísticamente significativo de células ( 1000 a más de
100.000 células).
 Múltiples marcajes de una sola célula.
 Análisis de alto numero de partículas en corto tiempo (5.000 eventos /seg).
 Alta sensibilidad y objetividad.
 Medidas separadas de cada célula (no sólo el promedio).
 Medidas cuantitativas : discriminación de las células según la cantidad de
marcador.
 Múltiples parámetros : define subpoblaciones complejas.
 Miles de células por segundo

29. DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
 Poca información morfológica de la célula
 No proporciona información de la localización celular en un tejido
 Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de células / hora)
 Necesita suspensión de células individuales .
 Costos de la tecnología
 Método destructivo.
 Incapacidad de visualizar las células que se analizan.