MANUEL MUÑOZ, ‎Investigador, Programa de Mejoramiento Genético de Papa, Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA), Chile

1. Aplicaciones moleculares al
mejoramiento genético de papa
Manuel Muñoz David - INIA Remehue
M I N I S T E R I Ow wD Ew .AinGiRa.IcClU L T U R A
4 de Septiembre de 2014

2. Laboratorio de Biotecnología aplicada
al mejoramiento genético de papa
 Asistir el proceso de desarrollo de variedades de
papa mediante marcadores moleculares
 Equipo técnico:
 Manuel Muñoz
 Carolina Folch

3. Desarrollo de Variedades
Objetivos
¿Diversidad genética existente?
Elección de progenitores
Herramientas de selección
Programa de producción de semilla

4. Objetivos del mejoramiento genético de
papa
 Consumo fresco
 Color de piel
 Forma
 Rendimiento
 Tamaño promedio
 Firmeza a la cocción
 Sabor
French Fry
Calidad
para
fritura
Tipo
Hojuela
Tipo
bastón

5. Objetivos del mejoramiento genético de
papa
 Resistencia a enfermedades
VIRUS Tizón Tardío
Objetivos definidos por el mercado y
necesidades de los productores

6. YAGANA-INIA ONA-INIA
KARU-INIA Patagonia-INIA Puyehue-INIA
PUKARA-INIA PUREN-INIA

7. Esquema del proceso de mejoramiento
genético de papa
AÑO Genotipos
diferentes
Tubérculos
de cada
genotipos
1 30.000 1
2 3.000 3
3 2.000 15
4 800 30
5 150 50
6 o más 50 200
7 o más 3 cientos
8 o más variedad miles

8. Objetivos del área molecular
 Objetivo general:
 Desarrollar métodos moleculares eficientes de
caracterización e identificación de genotipos
(progenitores y progenies segregantes) resistentes a
enfermedades (P. infestans, nemátodo dorado y
virus) y con colores de piel y pulpa para acelerar la
generación de nuevas variedades.

9. Desarrollo de Variedades: Uso de MM
Objetivos
¿Diversidad genética existente?
Elección de progenitores
Herramientas de selección
Programa de producción de semilla

10. Colección nativa, análisis 798
accesiones nativas y comerciales
Colección
unica
Duplicados
Diversidad
genética
Colección
Remehue
Comerciales
y nativos
Colección
SAG
Colección
Puqueldón

11. Metodología
 Implementación de marcadores SSR en accesiones
 Registro de alelos presentes para cada marcador
en cada accesión
 Matriz presencia ausencia alelos dominantes (1, 0);
Total 36 alelos.
 Indice de similitud de Jackard (Darwin, software)
 PCA análisis, dendogramas (NJ; UPGMA)

12. Colección nativa: Proximidad genética de materiales
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6
-0.1
-0.2
-0.3
-0.4
-0.5
Papa nativa Chilena
Remehue nativos
SAG
Puqueldón

13. Variedades comerciales
Accesiones nativas
Papa nativa Chilena
Variedades
comerciales

14.  GBS,
secuenciación de
siguiente
generación
 150.000 SNPs

15. Datos preliminares, colección nativa
Colección Remehue
N° Total Accesiones 332
N° de genotipos diferentes 202
N° de genotipos con igual perfil de ADN con colección SAG 34
Grupos de 2 o mas accesiones con igual perfil ADN y morfologico 45
N° de accesiones involucradas en grupos 177
Colección SAG
N° Total Accesiones 308
N° de genotipos diferentes 258
N° de genotipos con igual perfil de ADN con colección Remehue 55
Grupos de 2 o mas accesiones con igual perfil ADN 36
N° de accesiones involucradas en grupos 86
Colección Puqueldón
N° Total Accesiones 158
N° de genotipos diferentes 155
N° de genotipos con igual perfil de ADN con colección Remehue 0
N° de genotipos con igual perfil de ADN con colección SAG 1
Grupos de 2 o mas accesiones con igual perfil ADN 3
N° de accesiones involucradas en grupos 6

16. Proyección para la línea de investigación:
conocimiento de la diversidad genética
 Conocimiento de diversidad y estructura genética
 Patrones moleculares de genotipos selectos con
fines de trazabilidad
 Identificación de SNPs asociados a genes
responsables del color de pulpa
 Identificación de SNPs asociados a tolerancia a
stress abiótico

17. Desarrollo de Variedades
Objetivos
¿Diversidad genética existente?
Elección de progenitores
Herramientas de selección
Programa de producción de semilla

18. Elección de progenitores
 Importancia de la dosis alélica
Aa x aa
50% A_ 50% aa
Aaaa x aaaa
50% A… 50%aaaa
AAAA x aaaa
100%
A…
Aumento de la frecuencia del alelo de interés en la
progenie

19. Ensayo molecular, N° alelos por locus
Gen drf biosíntesis de antocianinas
 qPCR, sondas Taqman gen dfr
 2 genotipos de n° alelos conocido, 3 réplicas
técnicas
Duplex Simplex ¿Triplex,
cuadrupl
ex?
Nuliplex

20. Relación entre los valores Ct producto de la amplificación con las
sondas taqman asociadas a los fluoróforos VIC y FAM en 6 genotipos
con distinto plex number.
Plex number Variedad (Ct VIC)/(Ct FAM)
simplex Yagana 0,948 ± 0,003 c
simplex Kathadin 0,957 ± 0,001 c
duplex NY118 1,055 ± 0,004 b
duplex Pike 1,069 ± 0,001 b
triplex Nardona 1,183 ± 0,009 a
triplex Superior 1,198 ± 0,007 a
Este ensayo puede ser usado para seleccionar
progenitores que transmitan en alta frecuencia el
color rojo de piel a la descendencia

21. Ensayos moleculares
para detección de
alelos relacionados con
la biosíntesis de
carotenoides
Marcador CHY2
(Dosis del alelo 3)
N
Indice YIE313
Color de pulpa
nulex 3 30,5 ± 2,2 b
duplex 6 51,2 ± 0,9 a
triplex 4 52,8 ± 1,7 a
duplex-triplex 1 53,6 ± 0,7 a
simplex 1 57,9 ± 1,1 a
Este ensayo puede ser usado para seleccionar
progenitores que transmitan en alta frecuencia el
color amarillo de pulpa a la descendencia

22. Desarrollo de Variedades
Objetivos
¿Diversidad genética existente?
Elección de progenitores
Herramientas de selección
Programa de producción de semilla

23. Selección para resistencia a tizón tardío
 Introgresión simultánea de genes R, piramidización
 Cruzamiento de variedades y genotipos
diferenciales
 Rastreo de genes mayores (Genes R) en progenie
segregante

24. Introgresión simultánea de varios genes R

25. Metodologia
 Estandarización de marcadores descritos en la literatura
 Extracción ADN, PCR, visualización
 Implementación de marcadores en familias segregantes
de cruzas controladas
 Rastreo de genes R, desde S. demissum
 Evaluaciones fenotípicas
 Porcentaje infección de la hoja por planta
 Rendimiento en tubérculos/planta
 Peso promedio tubérculo
 Registro de aspecto (fotográfico)

26. Resultados
Severidad infección en genotipos portadores de genes R
Genes R N AUDPC Error Estan Grupo LSD
R2 4 2,37 1,54 a
R1 R2 4 8,75 3,51 a
R3A R3B R1 R2 13 11,69 6,09 a
R3A R3B R2 8 16,84 5,40 a
R8? 8 92,00 31,66 a
R3A R3B R1 13 101,01 55,74 a
R3A R3B R8? 4 206,56 85,84 ab
R3A R3B 14 371,19 127,28 b
R3A 3 539,16 385,8 bc
No detectados 19 750,23 97,74 c

27. Adicionalmente se cuenta con las
siguientes herramientas moleculares
 Se cuenta con marcadores moleculares
implementados para la detección de resistencia a
nemátodo dorado (gen H1), virus X (Rx2) y Virus Y
(Ryadg)
 En líneas avanzadas del programa de
mejoramiento se encuentra en alta frecuencia el
gen H1 y el gen Rx2 (sobre 30%). El gen Ryadg está
en baja frecuencia (3,6%)

28. Desarrollo de Variedades
Objetivos
¿Diversidad genética existente?
Elección de progenitores
Herramientas de selección
Programa de producción de semilla

29. Patrones moleculares para la
trazabilidad de la identidad genética
de líneas y variedades
 Establecimiento de bases de datos de presencia
de alelos en materiales genéticos
Patrón molecular de línea R91193-1 con 6 marcadores microsatélites
Marcador Tamaño de alelos presentes en R91193, en pares de bases (pb)
STI0030 125 112* 109 104
STM0037 99/100* 93
STM1052 267 243 226
STM1104 186
STM1106 175 169 160*
STM5127 266 257*
Alelos
Marcador
STI0030

30. Cambio climatico
 Cambios en la distribución de las precipitaciones
 Tolerancia a stress hídrico dado por rasgos
cuantitativamente heredados
 Determinaciones de parámetros fisiológicos
relacionados con tolerancia a stress hídrico
 Oportunidad de utilización de herramientas de
secuenciación masiva para determinar
asociaciones fenotipo – genotipo en poblaciones
fenotipadas.

31. Muchas gracias