Master's Thesis: Metabolomics approach for Greek cheeses authenticity characterization using High Resolution Mass Spectrometry (LC-QTOFMS)

1. Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Σχολή Θετικών Επιστημών
Τμήμα Χημείας
Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας
Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών
«Αναλυτική Χημεία-Διασφάλιση Ποιότητας»
Μεταβολομική μελέτη για τον χαρακτηρισμό
αυθεντικότητας ελληνικών τυριών με χρήση Υγροχρωματογραφίας
συζευγμένης με
Φασματομετρία Μαζών Υψηλής Διακριτικής Ικανότητας (LC-QTOFMS)
Κατσαρού Δανάη
Ερευνητική Εργασία Διπλώματος Ειδίκευσης
Ιούνιος 2022

2. ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΤΥΡΟΚΟΜΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ
 Τα ελληνικά τυριά παρουσιάζουν υψηλή θρεπτική αξία, καθώς περιέχουν
πρωτεΐνες υψηλής βιολογικής αξίας, λίπος, ανόργανα άλατα και βιταμίνες.
 Στην Ελλάδα χρησιμοποιείται για τυροκόμηση το πρόβειο γάλα σε ποσοστό
85% και το κατσικίσιο γάλα σε ποσοστό 70%.
 Έχουν κατοχυρωθεί > 100 γαλακτοκομικά προϊόντα ως ΠΟΠ και ΠΓΕ, εκ
των οποίων το 40% αφορά σε τυροκομικά προϊόντα όπως η φέτα, η
γραβιέρα κ.α.
(EEC)No 2081/92
Η επισήμανση Προστατευόμενης Ονομασίας Προέλευσης (Π.Ο.Π) συνδέει το προϊόν με την γεωγραφική περιοχή
στην οποία παράγεται.
Η επισήμανση Προστατευόμενης Γεωγραφικής Ένδειξης (Π.Γ.Ε) συνδέει το προϊόν με την γεωγραφική περιοχή
στην οποία παράγεται τουλάχιστον ένα από τα συστατικά του.
Φέτα Γραβιέρα Νάξου
Μανούρι Μετσοβόνε

3. ΑΥΘΕΝΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΡΟΦΜΩΝ
«H διαδικασία με την οποία πιστοποιείται ότι το τρόφιμο χαρακτηρίζεται επακριβώς από την ετικέτα του»
Η έννοια της αυθεντικότητας περιλαμβάνει:
 Την προέλευση του τροφίμου γεωγραφική, γενετική, βοτανολογική
 Τη μέθοδο παραγωγής του συμβατική, βιολογική καλλιέργεια
 Την τεχνολογία επεξεργασίας του ακτινοβόληση, κατάψυξη, μικροκύματα
Η διασφάλιση της αυθεντικότητας είναι σημαντική για:
 Την ασφάλεια και την ποιότητα των τροφίμων
 Την προστασία των καταναλωτών
 Τη συμμόρφωση με την εθνική νομοθεσία, τα διεθνή πρότυπα και τις κατευθυντήριες οδηγίες.

4. ΜΕΤΑΒΟΛΟΜΙΚΗ (METABOLOMICS)
Η εφαρμογή των τεχνολογιών omics στον τομέα των τροφίμων είναι μια νέα, καινοτόμα
προσέγγιση που μελετά των τομέα των τροφίμων σαν σύνολο μαζί με τον τομέα της
διατροφής.
Η μεταβολομική:
• Αφορά την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των μικρών μορίων
μεταβολιτών, δηλαδή των ενδιάμεσων και τελικών προϊόντων του μεταβολισμού.
• Στην επιστήμη των τροφίμων βρίσκει εφαρμογή στο μοριακό χαρακτηρισμό των
τροφίμων, στην τεκμηρίωση της αυθεντικότητάς τους και στην παρακολούθηση
αλλαγών στη σύσταση των τροφίμων κατά την επεξεργασία τους.
Οι βασικές κατηγορίες μεταβολιτών που ανιχνεύονται σε διάφορες μελέτες δειγμάτων
τυριών είναι: τα αμινοξέα και τα παράγωγά τους, λιπαρά οξέα, βιταμίνες και
νουκλεοτίδια.

5. QUADRUPOLE TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETER
(QTOFMS)
Το QTOF αποτελείται από τρία τμήματα σε σειρά:
 ένα τετράπολο (quadrupole, Q)
 μία κυψελίδα συγκρούσεων (collision cell)
 έναν αναλυτή μαζών χρόνου πτήσης (time of flight, TOF)
Τα πλεονεκτήματα του QTOF είναι:
 εξαιρετικές δυνατότητες ανίχνευσης και ταυτοποίησης για
ενώσεις μεγάλου εύρους μαζών σε διάφορες μήτρες
 υψηλή διακριτική ικανότητα
 υψηλή ευαισθησία
 υψηλή ακρίβεια μάζας

6. ΣΚΟΠΟΣ
Μεταβολομική μελέτη δειγμάτων τυριών κεφαλογραβιέρας από πρόβειο
γάλα, με βάση το διαφορετικό διατροφικό σχήμα των ζώων
Εκχύλιση Καθαρισμός
Upper
layer
Φάσμα μαζών
m/z
Ανάλυση
Δειγμάτων
ΥΠΟΠΤΗ
ΣΑΡΩΣΗ
ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ
Προκατεργασία
Δειγμάτων
Μελέτη Ταυτοποίησης

7. ΠΟΡΕΙΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ
 Παραλαβή και διαχωρισμός δειγμάτων τυριών
 Προκατεργασία δειγμάτων
 Ανάλυση δειγμάτων
 Επεξεργασία Δεδομένων
 Εξαγωγή αποτελεσμάτων-συμπερασμάτων

8. Δείγματα τυριών
 Παραλαβή και διαχωρισμός δειγμάτων, με βάση το διατροφικό σχήμα των ζώων.
 Στα συμβατικά δείγματα, τα ζώα τρέφονταν με συμπυκνωμένη τροφή που περιείχε άλευρο
σόγιας.
 Στα δείγματα πειραματισμού, τα ζώα τρέφονταν με 50% λιγότερο άλευρο σόγιας, το οποίο
αντικαταστάθηκε με λιναρόσπορο και λούπινα.
 Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη στους -20oC μέχρι την ανάλυση.
Κατηγορία δειγμάτων Κωδικοί δειγμάτων
Πειραματισμού G8M6, G9M6, G10M6, G11M6,
G12M6, G13M9, G8M12, G9M12,
G10M12, G11M12, G12M12,
G13M12
Συμβατικά G15M9, G45aM8, G44bM9,
G44aM9, G43aM9, G45bM8,
G15M12, G47M11, G41M12,
G42M12, G46M11

9. Προκατεργασία δειγμάτων
1g δείγματος,
+40 μl IS
+ 2 ml H2O, 2ml
MeOH, 2 ml ACN
IS: Lysine- d4,
Syringealdehy
de, Hesperitin
10 ppm
Λυοφιλίωση (24 ώρες) Κονιοποίηση
+ 500 μl
MeOH:H2O
80:20 (v/v)
+3 ml
Petroleum
ether, 3ml
Hexane
Φυγοκέντριση
(4000rpm, 6 λεπτά)
Απομάκρυνση
οργανικής
στοιβάδας
Εξάτμιση (40 oC)
Διήθηση από φιλτράκια
(διαμέτρου 15 mm, μέγεθος
σωματιδίων 0,2 μm)
Ανάλυση στο
LC-QTOFMS
Εκχύλιση με υπερήχους
(20 λεπτά, 45-50 oC)

10. Οργανολογία- LC-QTOFMS
Χρωματογραφία
RPLC:
Στήλη: Acclaim RSLC 120 C18, 2.2 μm, 2.1×100 mm
Κινητή φάση σε θετικό ιοντισμό:
• Υδατική: 90% H2O, 10% MeOH ,0.01% formic acid/ Οργανική: MeOH, 0.01% formic acid
Κινητή φάση σε αρνητικό ιοντισμό:
• Υδατική: 90% H2O, 10% MeOH/ Οργανική: 100% MeOH
HILIC:
Στήλη: ACQUITY BEH Amide column, 1.7 μm, 2.1 x 100 mm
Κινητή φάση σε θετικό ιοντισμό:
• Υδατική: H2O, 0.01% formic acid/ Οργανική: 95% ACN, 5% H2O, 0.01% formic acid
Κινητή φάση σε αρνητικό ιονισμό:
• Υδατική: 100% H2O/ Οργανική: 95% ACN, 5% H2O
Φασματομετρία μαζών
• Πηγή: ESI (+/-)
• Αναλυτής μαζών: QTOF
• Σάρωση με bbCID (broadband Collision Induced Dissociation) και AutoMS (Data Dependent Acquisition Mode)

11. Επεξεργασία Δεδομένων
• Η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε με τη χρήση της Στοχευμένης Σάρωσης Ενώσεων, με διαφορετικές Databases
Ενώσεων για κάθε χρωματογραφική τεχνική (RPLC, HILIC) και ιοντισμό (θετικό, αρνητικό), αλλά και με τα
Προγράμματα της Bruker, TASQ Client 2.1 και Data Analysis 4.3.
TASQ Client 2.1 Data Analysis 4.3

12. Κριτήρια Ταυτοποίησης
Τα Κριτήρια Ταυτοποίησης των ενώσεων που ανιχνεύθηκαν ήταν:
 Η αποδεκτή διαφορά μεταξύ του θεωρητικού και πειραματικού χρόνου έκλουσης των
κορυφών 0.2-0.4 min
 Το σφάλμα της ακρίβειας μάζας ≤ 5 mDa
 Η αποδεκτή διαφορά μεταξύ του θεωρητικού και πειραματικού ισοτοπικού προφίλ
< 100 mSigma
 Ύπαρξη ≥ 2 θραυσμάτων της ένωσης (qualifier ions)

13. Μελέτη Ταυτοποίησης
 Με την Τεχνική της Στοχευμένης Σάρωσης στα δείγματα τυριών συνολικά ανιχνεύθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 123
μεταβολίτες.
 Παρακάτω φαίνεται ως παράδειγμα η ταυτοποίηση της ένωσης Tyramine σε RPLC και θετικό ιοντισμό.
Χρωματογράφημα
Φάσμα μαζών
Φάσμα MS/MS

14. Μελέτη Ταυτοποίησης
Χρωματογραφική Τεχνική - Ιοντισμός Ενώσεις
RPLC - θετικός ιοντισμός
(40 ενώσεις)
10-Hydroxydecanoic acid, 1-Aminocyclopropanecarboxylic acid, 3-(2-Hydroxyethyl)indole, 3-Hydroxy-3-
methylglutaric acid, 3-Methyl-2-oxindole, 4-Guanidinobutyric acid, 4-Imidazoleacetic acid
hydrochloride, 4-Imidazoleacrylic acid, 5-Hydroxyindole-3-acetic acid, 5-Hydroxy-L-tryptophan, Adipic
acid, Allantoin, Arabinose, Azelaic acid, Bis(2-ethylhexyl)phthalate, Cytosine, DL-2-Aminoadipic acid,
Glycerol-myristate, Heptadecanoate, L-Arginine monohydrochloride, L-Ascorbic acid, L-Glutamine,
Lumichrome, Myristate, N-Acetyl-D-glucosamine, N-Acetyl-DL-methionine, N-Acetyl-L-alanine, N-
Acetyl-L-proline, N-Formyl-L-methionine, N-Methyl-L-glutamic acid, Nα-Acetyl-L-lysine, O-
Phosphorylethanolamine, O-Succinyl-L-homoserine, Pimelic acid, Pyridoxal 5'-phosphate hydrate,
Sphinganine, Theobromine, Tryptamine, Tyramine, Uracil
RPLC - αρνητικός ιοντισμός
(21 ενώσεις)
2-Oxoadipic acid, 3-Dehydroshikimic acid, 4-Coumarate, Citric acid, Decanoate, Dulcitol, Elaidate,
Ethylmalonic acid, Itaconic acid, Maleic acid, Malonic acid, Methylmalonic acid, N-Acetyl-L-leucine, N-
Acetyl-L-phenylalanine, Oleate, Omega-hydroxydodecanoate, Palmitate, Petroselinate, Stearate, Succinic
acid, Uric acid
HILIC - θετικός ιοντισμός
(53 ενώσεις)
(-)-Nicotine, (R)-(+)-2-Pyrrolidone-5-carboxylic acid, 1-Methyladenosine, 1-Methyl-L-histidine, 2-
Aminoisobutyric acid, 2-Aminophenol, 3-Amino-4-hydroxybenzoic acid, 3-amino-5-hydroxybenzoic
acid, 3-Methoxytyramine hydrochloride, 3-Methyladenine, 3-Ureidopropionic acid, 4-Acetamidobutyric
acid, 4-Pyridoxic acid, 5-Aminovaleric acid, 6-(γ,γ-Dimethylallylamino)purine, Adenine, Betaine, Biotin,
cis-4-Hydroxy-D-proline, Creatine, d-Desthiobiotin, Dihydrouracil, DL-Normetanephrine hydrochloride,
Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt, L-Alanine, L-Asparagine, L-Carnitine hydrochloride,
L-Citrulline, L-Homoserine, L-Isoleucine, L-Methionine, L-Norleucine, L-Norvaline, L-Ornithine
monohydrochloride, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Pyroglutamic acid, L-Serine, L-Threonine, L-Valine,
Methyl 4-aminobutyrate hydrochloride, Methyl indole-3-acetate, N-Acetyl-5-hydroxytryptamine,
Nicotinamide, Nicotinic acid, N-Methyl-D-aspartic acid, Purine, Pyridoxamine dihydrochloride,
Salicylamide, Sarcosine, Thymine, Trigonelline hydrochloride, γ-Aminobutyric acid
HILIC - αρνητικός ιοντισμός
(9 ενώσεις)
(RS)-Mevalonic acid lithium salt, 3-Hydroxybenzyl alcohol, 4-Hydroxybenzaldehyde, 4-Hydroxybenzoic
acid, DL-p-Hydroxyphenyllactic acid, Hypoxanthine, L-Glutamic acid, N-Acetyl-DL-serine, Xanthine

15. Μελέτη Ταυτοποίησης
 Από τους 123 μεταβολίτες που ανιχνεύθηκαν, οι 85 ταυτοποιήθηκαν πλήρως σύμφωνα με τα
κριτήρια ταυτοποίησης.
 Το επίπεδο ταυτοποίησής τους ήταν το Επίπεδο 1, καθώς οι δομές τους επιβεβαιώθηκαν με πρότυπα
αναφοράς.
 Οι υπόλοιποι 38 μεταβολίτες δεν εμφάνισαν θραύσματα στο φάσμα MS/MS.
 Το επίπεδο ταυτοποίησής τους ήταν το Επίπεδο 3, καθώς υπήρχαν στοιχεία για πιθανές δομές, αλλά
ανεπαρκείς πληροφορίες για μια ακριβή δομή.

16. Μελέτη Ταυτοποίησης
 Τα παρακάτω σχήματα συγκρίνουν τα ποσοστά των μεταβολιτών που ανιχνεύθηκαν και
ταυτοποιήθηκαν σε κάθε χρωματογραφική τεχνική (RPLC, HILIC) και ιοντισμό (θετικό, αρνητικό).
32.5%
17.1%
43.1%
7.3%
RPLC positive RPLC negative HILIC positive HILIC negative
49.6%
50.4%
RPLC HILIC
75.6%
24.4%
Positive Negative

17. Κατηγοριοποίηση των μεταβολιτών
 Το παρακάτω σχήμα περιγράφει σε ποιες κατηγορίες ανήκουν οι μεταβολίτες που ταυτοποιήθηκαν.
 Παρατηρείται ότι η πλειοψηφία των μεταβολιτών ανήκαν στις κατηγορίες των αμινοξέων και των
παραγώγων τους, των οργανικών και λιπαρών οξέων, των λιπιδίων και των παραγώγων τους, των
βιταμινών, των νουκλεοτιδίων, αλλά και μεταβολίτες σχετικοί με προϊόντα πρωτεόλυσης.
32.5%
19.5%
13.0%
9.0%
8.0%
6.5%
6.5%
5.0%
Amino acids & derivatives Organic acids Other Lipids & derivatives Fatty acids Vitamins Nucleotides Metabolites related to proteolysis products

18. Ποσοτικοποίηση των μεταβολιτών
 Έγινε ένα πείραμα ποσοτικοποίησης με χρήση πρότυπων δειγμάτων προσαρμοσμένων στη μήτρα
συγκέντρωσης 1 ppm, ώστε να υπολογιστεί η συγκέντρωση (μg/g) των μεταβολιτών στα δείγματα τυριών.
 Οι μεταβολίτες που φαίνεται να διαφοροποιούνται, με βάση τις συγκεντρώσεις τους (μg/g) μεταξύ των 2
ομάδων δειγμάτων τυριών φαίνονται στον παρακάτω πίνακα.
Ενώσεις Συγκέντρωση (μg/g)
Ομάδα 1- Συμβατικά
Δείγματα
Συγκέντρωση (μg/g)
Ομάδα 2- Δείγματα
Πειραματισμού
Succinic acid 85 314
Itaconic acid 36 70
Arabinose 47 77
L-Arginine monohydrochloride 33 12
Hypoxanthine 1.9 22
L-Glutamine 13 29
Dulcitol 9.4 20

19. Principal Component Analysis (PCA)
o Με βάση τα δεδομένα ποσοτικοποίησης έγινε μια πρώτη μελέτη για τη διαφοροποίηση των δειγμάτων,
χρησιμοποιώντας την PCA.
o Επαρκής διαχωρισμός των μεταβολιτών ανάμεσα στις 2 ομάδες τυριών.

20. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
 Ανιχνεύθηκαν 123 μεταβολίτες, εκ των οποίων οι 85 ταυτοποιήθηκαν επιτυχώς σε Επίπεδο 1.
 Η πλειοψηφία των μεταβολιτών ανήκε στις κατηγορίες των αμινοξέων και των παραγώγων τους, των
οργανικών και λιπαρών οξέων, των λιπιδίων και των παραγώγων τους, των βιταμινών και των νουκλεοτιδίων.
 Κατέστη δυνατός ο διαχωρισμός των μεταβολιτών ανάμεσα στις 2 ομάδες τυριών (Ομάδα 1-Συμβατικά
Δείγματα, Ομάδα 2-Δείγματα Πειραματισμού), με βάση τη διαφορετική διατροφή των ζώων.
Μελλοντικοί Στόχοι
 Χρήση του μοντέλου PLS-DA για την εύρεση δεικτών
αυθεντικότητας σε δείγματα ελληνικών τυριών.
 Εφαρμογή της παρούσας πορείας εργασίας σε σχετικές μελέτες
γαλακτοκομικών προϊόντων.
 Εκτενής μελέτη λιπαρών οξέων, τα οποία αποτελούν βασικό
συστατικό της σόγιας.