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Estudio de Biofilms Bucales

¿Conoces cómo se estudian los Biofilms bucales?
Conoce las técnicas y métodos llevados a cabo desde DENTAID Research Center.

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Estudio de Biofilms Bucales

  1. 1. ESTUDIO DE BIOFILMS BUCALES DEPARTAMENTO MÉDICO DENTAID
  2. 2. Las bacterias de la cavidad oral pueden estar en la saliva o adheridas a las superficies bucales (mucosas, lengua, dientes) Biofilms bucales: agrupaciones bacterianas embebidas en matrices que se adhieren a superficie. Composición: 15-20% población microbiana 80-85% matriz de polisacáridos extracelulares, proteínas, sales minerales y material celular Localización en diente: supragingival subgingival interproximal DEFINICIÓN
  3. 3. PATOGENICIDAD BIOFILMS Supragingival e Inteproximal Bacterias cariogénicas Destrucción del esmalte dental Subgingival Inflamación y destrucción del periodonto Bacterias periodontopatógenas CARIES GINGIVITIS PERIODONTITIS
  4. 4. Aggregatibacter actinomycetemcomitans Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Fusobacterium nucleatum Tannerella forsythia Campylobacter rectus Eikenella corrodens Parvimonas micra Selenomonas spp Eubacterium spp Treponema spp 700 especies bacterianas están presentes en el biofilm bucal DIVERSIDAD BACTERIANA DE LA CAVIDAD BUCAL
  5. 5. FORMACIÓN DE BIOFILMS Formación de película adquirida con proteínas salivares sobre el esmalte 1 Adhesión de colonizadores primarios: bacilos y cocos gram positivos (S. sanguis, S. oralis,…) y crecimiento 2 Unión de Fusobacterium nucleatum: facilita la adhesión de otras bacterias (gram negativas, anaerobios…) 3 4 Colonizadores terciarios. Incremento de la complejidad: gram negativos, anaerobios estrictos 4 μm4 μm
  6. 6. Las bacterias, al crecer en forma de biofilms, actúan como una comunidad bacteriana, lo que les otorga las siguientes propiedades:  Heterogeneidad fisiológica  Mayor resistencia fenotípica  Quorum sensing (comunicación interbacteriana)  Capacidad adaptativa  Resistencia a los agentes antimicrobianos PROPIEDADES DE LOS BIOFILMS
  7. 7. IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE BIOFILMS Las bacterias aisladas (planctónicas) tienen diferente comportamiento y propiedades que cuando están organizadas en biofilms. Estas propiedades diferentes les confieren un incremento en la resistencia frente a antisépticos y un aumento en su patogenicidad. Por tanto, es necesario estudiar el comportamiento de las bacterias en biofilms y poder prevenir así las patologías bucales que puedan causar.
  8. 8. Desarrollo Biofilm in vitro Crecimiento estático Crecimiento en flujo Biofilm maduro Cultivo en placa Técnicas moleculares Técnicas microscópicas  PCR  PCR-RT  PCR-RT-PMA  Microscopía electrónica de barrido (SEM)  Microscopía de láser confocal (CLSM) Ensayos
  9. 9. DESARROLLO BIOFILM IN VITRO  Crecimiento estático Se realiza en placas microtiter. Se usan inóculos orales (de saliva o placa subingival) o una selección de bacterias supra y/o subgingivales. Se intentan reflejar condiciones fisiológicas de la boca (pH, Tª, anaerobiosis). No se puede recrear el dinamismo característico de la boca: flujo salival y flujo crevicular al que están sometidas las bacterias. Este dinamismo condiciona las propiedades estructurales del biofilm. Estudios demuestran que la estructura y propiedades del biofilm varían dependiendo de si el crecimiento es estático o en flujo Placa microtiter
  10. 10. DESARROLLO BIOFILM IN VITRO  Crecimiento en flujo - Modelo de estudio que permite la formación de biofilm oral multiespecie in vitro en condiciones similares a la realidad, gracias al sistema en flujo - Crecimiento similar al que obtendríamos en la cavidad bucal
  11. 11. ENSAYOS  Sobre los discos de hidroxiapatita donde está el biofilm maduro, se realizan distintos ensayos, con el fin de evaluar su comportamiento.  Estos ensayos fundamentalmente incluyen el uso de antisépticos, y están orientados a evaluar su eficacia y/o la resistencia del biofilm  También se realizan ensayos sobre la matriz extracelular (80% del biofilm), que tiene gran influencia en propiedades del biofilm como la resistencia a los antisépticos.
  12. 12. CULTIVOS  Cultivo en placa - El biofilm maduro y tratado se siembra en medios de cultivo apropiados para su crecimiento. - En función de las características metabólicas de las especies, se utilizan diferentes medios de cultivo. - Posteriormente, se evalúa la población microbiana que ha crecido (de forma cualitativa y cuantitativa). Cámara de anaerobiosis
  13. 13.  PCR (reacción en cadena de la polimerasa) Son técnicas de extracción de DNA. Con estas técnicas, es posible amplificar el DNA bacteriano de una muestra: - PCR: Cualitativa. Detecta DNA mediante señal en gel de electroforesis - PCR-RT (PCR en tiempo real): permite cuantificar el producto de esta amplificación a medida que se va sintetizando mediante fluorocromos - PCR-RT-PMA (PCR-RT con propidio de monoazida). Gracias a la adición del PMA, es posible diferenciar entre DNA de bacterias vivas y muertas, valorándose así la eficacia de antisépticos TÉCNICAS MOLECULARES
  14. 14.  Microscopio óptico de láser confocal (CLSM) • Aumento de la resolución • Capacidad de penetración en el biofilm • Obtención de imágenes de secciones ópticas extremadamente finas. • Se consigue enfoque sobre un único plano. • Nos permite identificar y cuantificar la población bacteriana viva y muerta: VALORACIÓN DE EFICACIA DE ANTISÉPTICOS TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA
  15. 15. Imágenes en un microscopio Óptico de Láser Confocal de un biofilm oral desarrollado in Vitro. En verde se observan los microorganismos marcados con Syto9 (vivos) y en rojo se observan los microorganismos marcados con Ioduro de Propidio (muertos). La imagen de la izquierda corresponde a un control negativo y la de la derecha es la misma población bacteriana tras el tratamiento con Clorhexidina 0,12% + CPC 0,05% (Perio·Aid Tratamiento) Imágenes de microscopía de láser confocal CHX 0,12% + CPC 0,05% PERIO·AIDControl negativo
  16. 16.  Microscopio electrónico de barrido (SEM) EVALUACIÓN DE RESULTADOS – TÉCNICAS MICROSCOPÍA • Aumento de la resolución hasta más de 100.000 veces. • Haz de electrones (en lugar de haz de luz) que “barre la muestra”, punto por punto de la muestra. • Imágenes tridimensionales realistas sobre la superficie de un objeto • Gran profundidad de campo • Obtención de imágenes de la estructura del biofilm (morfología bacteriana, interconexiones, matriz, etc.)
  17. 17. Imágenes de microscopía electrónica de barrido Diferentes micrografias tomadas con SEM pertenecientes a biofilms orales mono y multiespecie desarrollados en el laboratorio de microbiologia de Dentaid Research Center.
  18. 18. @Dentaid

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