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Pretseille Emmanuelle
Master MABS 2011-2012
Diagnostic moléculaire des MO



Determination of Escherichia coli O types by
 allele-specific polymerase chain reaction :
          application to the O types
        involved in human septicemia
  Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E.




                                       N°57 (2007)
Plan de la présentation

Introduction

  - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
  - Sérotypage de l'antigène O

Objectif et démarche R&D

Mise au point de la méthode de sérotypage

  - Sélection des sérotypes et des souches
  - Détermination des groupes phylogénétiques   des souches
  - Design d'amorces et mise en place de l'essai
  - Validation de l'essai
  - Résolution des discordances

Conclusions
Introduction

Escherichia coli et ses propriétés antigéniques

                         Escherichia coli

    - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie
    - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)
Introduction

       Escherichia coli et ses propriétés antigéniques

                                         Escherichia coli

              - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie
              - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)
              - Aussi un agent pathogène !

                               Pathologies dues à E. coli
           Intestinales                 Diarrhées
                                        Turista
                                        TIA
                                        Dysenterie
                                        SHU
           Extraintestinales            Infections urinaires (80%)
           (ExPEC)                      Septicémies (20%)

E. coli est responsable de pathologies intestinales mais aussi extra-intestinales.
Introduction

           Escherichia coli et ses propriétés antigéniques

                                         Escherichia coli

                   - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie
                   - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)
                   - Aussi un agent pathogène !


        Capsule
                                            Antigène K


                                            Antigène O
Paroi

                                            Antigène H

        Flagelle                               Antigènes K, O et H d'E. coli
Introduction

           Escherichia coli et ses propriétés antigéniques

                                         Escherichia coli

                   - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie
                   - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)
                   - Aussi un agent pathogène !


        Capsule
                                            Antigène K


                                            Antigène O               Pouvoir
Paroi                                                               pathogène
                                            Antigène H

        Flagelle                               Antigènes K, O et H d'E. coli
Introduction

       Sérotypage de l'antigène O
                                                         Limites
                             Techniques de
    Sérogroupe
                              sérotypage       Coût   Résultats    Applications
→ Diagnostic
→ Épidémiologie               Agglutination
→ Vaccinologie ?                avec des
                                               +++       +            +++
                               antisérums
                                (Biorad)
                              Agglutination
                             avec des billes                           ++
                                               +++       +
                              de latex + Ac
                             anti-O (Oxoid)
                                 Milieux
                             chromogènes        +        ++         0157:H7
                                  (BD)
         La détermination    Vidas ICE/ECO
            phénotypique                       ++       +++         O157:H7
                              (Biomérieux)
 de l'antigène O d'E. coli
Introduction

       Sérotypage de l'antigène O
                                                         Limites
                             Techniques de
                              sérotypage       Coût   Résultats    Applications
Méthode classique
                              Agglutination
                                avec des
                                               +++       +            +++
                               antisérums
                                (Biorad)
                              Agglutination
Test d'agglutination +       avec des billes                           ++
                                               +++       +
                              de latex + Ac
                             anti-O (Oxoid)
                                 Milieux
                             chromogènes        +        ++         0157:H7
                                  (BD)
         La détermination    Vidas ICE/ECO
            phénotypique                       ++       +++         O157:H7
                              (Biomérieux)
 de l'antigène O d'E. coli
Introduction

         Sérotypage de l'antigène O
                                                           Limites
                               Techniques de
                                sérotypage       Coût   Résultats    Applications

→ Nécessité d'une               Agglutination
nouvelle technologie :            avec des
- coûteuse, + fiable et                          +++       +            +++
                                 antisérums
+ universelle                     (Biorad)
                                Agglutination
                               avec des billes                           ++
                                                 +++       +
                                de latex + Ac
                               anti-O (Oxoid)
                                   Milieux
                               chromogènes        +        ++         0157:H7
                                    (BD)
           La détermination    Vidas ICE/ECO
                                                 ++       +++         O157:H7
              phénotypique      (Biomérieux)
   de l'antigène O d'E. coli
Introduction

         Sérotypage de l'antigène O
                                                           Limites
                               Techniques de
                                sérotypage       Coût   Résultats    Applications

→ Nécessité d'une               Agglutination
nouvelle technologie :            avec des
- coûteuse, + fiable et                          +++       +            +++
                                 antisérums
+ universelle                     (Biorad)
                                Agglutination
                               avec des billes                           ++
                                                 +++       +
                                de latex + Ac
                               anti-O (Oxoid)
Approche moléculaire
                                   Milieux
                               chromogènes        +        ++         0157:H7
                                    (BD)
           La détermination    Vidas ICE/ECO
                                                 ++       +++         O157:H7
              phénotypique      (Biomérieux)
   de l'antigène O d'E. coli
Introduction

       Sérotypage de l'antigène O (suite)

                     Opéron rfb (6 à 19 gènes)             JUMPstart



 gnd                                                                    galF

                     Synthèse de l'antigène O
       Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de l'antigène O.
Introduction

       Sérotypage de l'antigène O (suite)

                      Opéron rfb (6 à 19 gènes)            JUMPstart



 gnd                                                                    galF
       Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de l'antigène O.




  Techniques de sérotypage                              Limites
                                       - Uniquement pour certains sérotypes
 PCR basées sur les SNP de rfb
                                       - Difficulté d'application en diagnostic
                                       - Long
          « rfb-RFLP »
                                       - Difficulté d'interprétation des résultats

          La détermination génotypique de l'antigène O d'E. Coli
Introduction

       Sérotypage de l'antigène O (suite)

                      Opéron rfb (6 à 19 gènes)            JUMPstart



 gnd                                                                    galF
       Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de l'antigène O.




  Techniques de sérotypage                              Limites
                                       - Uniquement pour certains sérotypes
 PCR basées sur les SNP de rfb
                                       - Difficulté d'application en diagnostic
                                       - Long
          « rfb-RFLP »
                                       - Difficulté d'interprétation des résultats

          La détermination génotypique de l'antigène O d'E. Coli
Objectif et démarche R&D

           Objectif

→ Mise au point d'un méthode de sérotypage de l'antigène O
basée sur une PCR multiplexe allèle spécifique de la portion 5' du
locus rfb : application aux Escherichia coli impliquées dans les
septicémies humaines


Hémocultures
(Biomérieux)

                      E.coli
                                                Réplicons



                                                              LPS et
Une approche                                                antigène O
moléculaire pour le            ADN
sérotypage                           Thermocycleur
                                      (Eppendorf)
Objectif et R&D                      Sélection des sérotypes et des souches

      Démarche R&D
                                           Détermination des groupes
    Légende                                     phylogénétiques
                                                  des souches
     Pré-requis


     Mise au point                          Design des amorces
                               Non         Mise en place de l'essai
     Devenir          Résolution des
                       discordances

                         Oui                       Validation
                                         Non       de l'essai

                                                    Oui

                                                 Applications


      Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
Plan de la présentation

Introduction

  - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
  - Sérotypage de l'antigène O

Objectif et démarche R&D

Mise au point de la méthode de sérotypage

  - Sélection des sérotypes et des souches
  - Détermination des groupes phylogénétiques   des souches
  - Design d'amorces et mise en place de l'essai
  - Validation de l'essai
  - Résolution des discordances

Conclusions
Sélection des sérotypes et des souches


                    Détermination des groupes
                         phylogénétiques
                           des souches



                      Design des amorces
        Non          Mise en place de l'essai

Résolution des
 discordances

  Oui                       Validation
                  Non       de l'essai

                             Oui

                          Applications


Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
Mise au point de la méthode de sérotypage

        Sélection des sérotypes et des souches

→ Choix des 12 sérotypes les plus fréquents en septicémie humaine


                             Sérotypes étudiés
                     O1              O7               O18
                     O2              O12              O25
                     O4              O15              O75
                     O6              O16             O157


    Une sélection ciblée sur les sérotypes majeurs en bactériologie sanguine
Mise au point de la méthode de sérotypage

        Sélection des sérotypes et des souches

→ Choix des 12 sérotypes les plus fréquents en septicémie humaine



→ Un panel de 370 Escherichia coli aux caractères variés


                                                          Souches
                                                       pathogènes :
      Souches non              Collections de           - urosepsis,
       pathogènes,               souches                 - infections
      commensales               Ex : ECOR              urinaires chez
     Ex : Nissle 1917                                     vétérans,
                                                           - ExPEC
Sélection des sérotypes et des souches


                   Détermination des groupes
                        phylogénétiques
                          des souches



                      Design des amorces
        Non          Mise en place de l'essai

Résolution des
 discordances

  Oui                       Validation
                  Non       de l'essai

                             Oui

                          Applications


Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
Méthode de sérotypage

       Détermination des groupes phylogénétiques des souches

     Analyses phylogénétiques                        4 groupes d'E.coli

                           Groupe
                                             Type d'E. coli
                       phylogénétique
                                A            Commensales
                              B1                  NR
                              B2                ExPEC
                                D               ExPEC

        La pathogénicité d'E.coli semble liée à son groupe phylogénique.
Méthode de sérotypage

       Détermination des groupes phylogénétiques des souches

     Analyses phylogénétiques                        4 groupes d'E.coli

                           Groupe
                                             Type d'E. coli
                       phylogénétique
                                A            Commensales
                              B1                  NR
                              B2                ExPEC
                                D               ExPEC

        La pathogénicité d'E.coli semble liée à son groupe phylogénique.



                           Comment le déterminer ?
Méthode de sérotypage

       Détermination des groupes phylogénétiques des souches
       (suite)
                            2 méthodes utilisées

           PCR triplex                             MLST

→ Existence de séquences ADN
spécifiques aux groupes
phylogénétiques

      chuA, yjaA et TspE4C2




      Mise en évidence par :
    PCR triplex et Southern blot
Méthode de sérotypage

                                       Détermination des groupes phylogénétiques des souches
                                       (suite)
                                                              2 méthodes utilisées

                                            PCR triplex                              MLST
Extrait de Clermont et al. (2000)




                                      Détermination du groupe
                                    phylogénétique par PCR triplex
Méthode de sérotypage

       Détermination des groupes phylogénétiques des souches
       (suite)
                              2 méthodes utilisées

           PCR triplex                                   MLST

→ Existence de séquences ADN                  Multilocus sequence typing
spécifiques aux groupes
phylogénétiques

      chuA, yjaA et TspE4C2

                                           Détermination de profils alléliques

      Mise en évidence par :
    PCR triplex et Southern blot
MLST                       Détermination du groupe phylogénétique par MLST




       polB                trpA


                                               Amplification
              Chromosome
 icd             E. coli      trpB                par PCR                  Séquençage des
                                             (fragment ~450nt)           fragments obtenus
                           pabB
          putP

Sélection de 6 gènes de ménage
                                                                           Identification des
                                                                           allèles de chaque
                                                                                  locus
                                    Obtention des
     Arbre                         profils alléliques
phylogénétique                    (ou sequence type)       Compilation
                                                           des données
Sélection des sérotypes et des souches


                   Détermination des groupes
                        phylogénétiques
                          des souches



                     Design des amorces
        Non         Mise en place de l'essai

Résolution des
 discordances

  Oui                       Validation
                  Non       de l'essai

                             Oui

                          Applications


Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
Méthode de sérotypage

       Design des amorces




 → 2 souches phylogénétiquement
 éloignées par sérotype




                                           Extrait de Clermont et al. (2007)
          Une sélection de souches pour
             des résultats discriminants
Méthode de sérotypage

      Design des amorces (suite)

  Amplification du      Séquençage de         Choix de l'amorce
    cluster rfb      l'extrémité 5' de rfb   reverse O spécifique
Méthode de sérotypage

      Design des amorces (suite)

  Amplification du          Séquençage de           Choix de l'amorce
    cluster rfb           l'extrémité 5' de rfb    reverse O spécifique


            Amplification du cluster rfb par Long-range PCR


    gnd                         Opéron rfb                 JUMPstart




    gnd.f                                                  JUMPstart.r




                 Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
Méthode de sérotypage

      Design des amorces (suite)

  Amplification du          Séquençage de           Choix de l'amorce
    cluster rfb           l'extrémité 5' de rfb    reverse O spécifique


            Amplification du cluster rfb par Long-range PCR


    gnd                         Opéron rfb                 JUMPstart




    gnd.f                                                  JUMPstart.r



            Fragment correspondant à rfb ( ~5000-17000 pb)

                 Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
Long Range PCR                    Le kit Expand Long Template PCR System (Roche)


 Extrait de Roche (2005)




                       Mix de 2 ADN polymérases


    Enzyme             Origine          Activité         Caractéristiques
                                                          Thermostable
                      Thermus
       Taq                          Polymérase 5'3'         Spécifique
                      aquaticus
                                                             Sensible

                   Thermococcus     Polymérase 5'3'        Thermostable
       Tgo
                    gorgonarius    Exonucléase 3'5'           Fidèle


                Un mix de polymérase « idéal » pour la Long-range PCR
Méthode de sérotypage

       Design des amorces (suite)

   Amplification du        Séquençage de         Choix de l'amorce
     cluster rfb        l'extrémité 5' de rfb   reverse O spécifique


                  Séquençage de l'extrémité 5' de rfb

                  Séquençage par électrophorèse capillaire des
                  fragments PCR obtenus
Principe du séquençage par électrophorèse capillaire :
Séquençage                       étapes majeures (Applied Biosystems)


 - Cycle de séquençage par technologie BigDye terminator




                                                 Extrait de Applied Biosystems (2009)
 - Electrophorèse capillaire

                                                        → Séparation des fragments
                                                        selon leur taille (charge) via un
                                                        polymère dénaturant POP &
                                                        détection de la fluroscence du
               Extrait de Applied Biosystems (2009)     ddNTP terminal

   Résultats de l'électrophorèse capillaire
Méthode de sérotypage

       Design des amorces (suite)

   Amplification du        Séquençage de         Choix de l'amorce
     cluster rfb        l'extrémité 5' de rfb   reverse O spécifique


                  Séquençage de l'extrémité 5' de rfb

                  Séquençage par électrophorèse capillaire des
                  fragments PCR obtenus



              Séquences nucléotidiques interprétables d'~300-800 pb
              pour le design d'amorces O spécifiques
Méthode de sérotypage

       Design des amorces (suite)

   Amplification du       Séquençage de          Choix de l'amorce
     cluster rfb        l'extrémité 5' de rfb   reverse O spécifique


                Choix de l'amorce reverse O spécifique

   → Comparaison des séquences de référence (GenBank) et de
   celles obtenues par de novo sequençage
Méthode de sérotypage

       Design des amorces (suite)

   Amplification du         Séquençage de          Choix de l'amorce
     cluster rfb          l'extrémité 5' de rfb   reverse O spécifique


                Choix de l'amorce reverse O spécifique

   → Comparaison des séquences de référence (GenBank) et de
   celles obtenues par de novo sequençage

                      Design des amorces reverse O spécifiques
                        (fragments de 200 à 700 pb après PCR)

    Exemples : rfbO16.r 5'-GGATCATTTATGCTGGTACG-3' (450pb)
               rfbO7.r 5'-CGAAGATCATCCACGATCCG-3' (722pb)
Critères d'optimisation du design d'amorces
Design d'amorces

                                   Une bonne amorce PCR doit être ...



                            - Absence d'hybridation secondaire
      Spécifique !          - Minimum de 18 bases de long
                            - Tm > 45°C
                            - GC% ~50%


                                 - Aucun dimère de nuclétotides
              Stable !           - Aucun palindrome (structures secondaires)
                                 - Attention GC% en 3'



       Et attention                                               1
                          - Tm proches
   à la compatibilité !
Méthode de sérotypage

       Mise en place de l'essai
                           PCR multiplex
 - Milieu réactionnel


                        Lysat bactérien
                        dATP dGTP, dTTP et dCTP
                        1 amorce forward (gndbis.f) + amorces reverse
                        Tampon 10x + Taq polymerase (ATGC Biotechnologie)
Méthode de sérotypage

       Mise en place de l'essai
                               PCR multiplex
 - Milieu réactionnel


                           Lysat bactérien
                           dATP dGTP, dTTP et dCTP
                           1 amorce forward (gndbis.f) + amorces reverse
                           Tampon 10x + Taq polymerase (ATGC Biotechnologie)



    rfbO1.r , rfbO2.r , rfbO18.r ,             rfbO4.r , rfbO12.r , rfbO75.r ,
    rfbO16.r , rfbO6a.r & rfbO7.r            rfbO25a.r , rfbO15.r & rfbO157.r

            Primer set 1                              Primer set 2
Méthode de sérotypage

                             Mise en place de l'essai (suite)
                                                  PCR multiplex
            - Programme PCR

                       100
                        95
                        90                                                  Eppendorf Mastercycler
Température (en °C°)




                                                                                 (Eppendorf)
                        85        Dénaturation
                        80        (4 min, 94°C)
                        75
                        70
                                                                      Extension finale
                        65
                                                                       (5 min, 72°C)
                        60
                        55
                                                   30 cycles
                        50                         5s, 94°C
                                                   10s, 59°C                     Temps (en seconde)

                                   Évolution de la température dans le thermocycleur
Méthode de sérotypage

       Mise en place de l'essai (suite)
 - Résultats                                           Extrait de Clermont et al. (2007)




                      Primer set 1                        Primer set 2
               Electrophorèse des fragments obtenus en PCR multiplex
                         (gel d'agarose et BET révélé aux UV)
Méthode de sérotypage

       Mise en place de l'essai (suite)
 - Résultats                                        Extrait de Clermont et al. (2007)




                      Primer set 1                 Primer set 2
               Electrophorèse des fragments obtenus en PCR multiplex
                         (gel d'agarose et BET révélé aux UV)

          Profils électrophorétiques identiques pour un même sérotype
          (fragment PCR de même taille)
Sélection des sérotypes et des souches


                   Détermination des groupes
                        phylogénétiques
                          des souches



                     Design des amorces
        Non         Mise en place de l'essai

Résolution des
 discordances

  Oui                       Validation
                  Non       de l'essai

                             Oui

                          Applications


Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
Méthode de sérotypage

      Validation de l'essai

    Reproductibilité          Sensibilité   Spécificité
Méthode de sérotypage

       Validation de l'essai

     Reproductibilité             Sensibilité             Spécificité

                        Reproductibilité (répétabilité)


 Testée inter-laboratoires.




 Tests réalisés : - PCR multiplex avec amorces spécifiques x12
                  - Typage de 24 souches dites communes

                        Méthode reproductible et précise
                        (Résultats identiques mais quelques optimisations)
Méthode de sérotypage

        Validation de l'essai

       Reproductibilité              Sensibilité    Spécificité

                                      Sensibilité
Test sur 153 souches

     → Sensibilité ~ 93%


Problèmes rencontrés :
- Absence de produit PCR,
- Fragment de PCR correspondant
à un autre sérotype que celui
attendu


          Sensibilité et spécificité de
                    la PCR multiplex
Méthode de sérotypage

        Validation de l'essai

       Reproductibilité              Sensibilité    Spécificité

                                      Spécificité
Test sur 167 souches représentant
61 sérotype O non ciblés

→ Aucune fausse amplification


Problème rencontré :
 Faux positifs pour 6 souches aux
sérotypes O ciblés mais
apparaissant faussement d'un autre
sérotype
          Sensibilité et spécificité de
                    la PCR multiplex
Sélection des sérotypes et des souches


                    Détermination des groupes
                         phylogénétiques
                           des souches



                      Design des amorces
         Non         Mise en place de l'essai

Résolution des
 discordances

   Oui                       Validation
                   Non       de l'essai

                              Oui

                           Applications


 Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
Méthode de sérotypage

      Résolution des discordances

          → 12 souches montrant des discordances de sérotypes




                      rfb RFLP et séquençage
Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000)
  rfb RFLP

- Long-range PCR

   gnd                      Opéron rfb                     JUMPstart




   gnd.f                                                   JUMPstart.r

                   Fragment correspondant à rfb
              Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000)
    rfb RFLP

 - Long-range PCR

      gnd                        Opéron rfb                     JUMPstart




     gnd.f                                                      JUMPstart.r

                      Fragment correspondant à rfb
                  Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR

   - RFLP (Restriction Length Fragment Polymorphism)




 5' GAAGANNNNNNNN / 3'
 3' CTTCTNNNNNNN / N 5'
Site de coupure de l'endonucléase MboII
Méthode de sérotypage

       Résolution des discordances

            → 12 souches montrant des discordances de sérotypes




                          rfb RFLP et séquençage



                      Rappel des problèmes rencontrés :

   - Échec de l'amplification malgré les amorces spécifiques
   - Produit PCR présentant un type 0 qui n'est pas le sien
Méthode de sérotypage

        Résolution des discordances (suite)




 Produit PCR présentant un type 0 qui




                                                                             Adapté de Clermont et al. (2007)
 n'est pas le sien → O1 et O6 / O18




  Réarrangement du locus rfb
              et
   présence d'une séquence
        typique de O18




                                        Profil électrophorétique après rfb RFLP
Méthode de sérotypage

        Résolution des discordances (suite)




 Produit PCR présentant un type 0 qui




                                                                             Adapté de Clermont et al. (2007)
 n'est pas le sien → O12/O16




  Les souches appartiennent
     bien au sérotype O16.
    (portion 5' de rfb typique
         de ce sérotype)




                                        Profil électrophorétique après rfb RFLP
Plan de la présentation

Introduction

  - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
  - Sérotypage de l'antigène O

Objectif et démarche R&D

Mise au point de la méthode de sérotypage

  - Sélection des sérotypes et des souches
  - Détermination des groupes phylogénétiques  des souches
  - Design d'amorces et mise en place de l'essai
  - Validation de l'essai
  - Résolution des discordances

Conclusions
Conclusions

       Une méthode robuste


→ Méthode moléculaire de sérotypage de l'antigène O d'Escherichia coli



     Méthode               Qualités                       Limites

                  Rapide
                  Simple                       Sérotypage incorrect si :
   PCR multiple   Peu coûteuse                 - voies de synthèse de l'Ag
      allèle      Appareillage simple          O variables
    spécifique    Typage de souches            - dégénérescence du locus
                  « rough » et « non           rfb
                  agglutinantes »

                  Bilan de l'essai de Clermont et al. (2007)
Sélection des sérotypes et des souches


                   Détermination des groupes
                        phylogénétiques
                          des souches



                     Design des amorces
        Non         Mise en place de l'essai

Résolution des
 discordances

  Oui                       Validation
                  Non       de l'essai

                             Oui

                          Applications


Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
Conclusion

      Des applications personnalisables

 – DIAGNOSTIC :
       Sérotypage de routine en LABM en cas de septicémies à E. coli

 – EPIDEMIOLOGIE:
       Création de kits épidémies spécifiques selon une région
 géographique et/ou une pathologie

        Exemple : Sérotype O45 et méningite du nouveau-né en France
Références bibliographiques

- Applied Biosystems (2009) DNA sequencing by capillary electrophoresis

- Biomérieux (2012)
http://www.biomerieux.fr/servlet/srt/bio/france/dynPage?open=FRN_IND_FDA_PRD&do

- Clermont O., Bonacorsi S. & Bingen E. (2000) Rapid and simple determination of
the Escherichia coli phylogenetic group. Appl Environ Microbiol 66:639-654

- Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E. (2007) Determination of
Escherichia coli O types by allele-specific polymerase chain reaction: application to
the O types involved in human septicemia. Diagnostic Microbiology and Infectious
Disease 57:129-136

- Escobar-Paramo P., Clermont O., Blanc-Potard AB, Bui H, Le Bouguenec C &
Denamur E. (2004) A specific genetic background is required for acquisition and
expression of virulencde factors in Escherichia coli. Mol Biol Evol 21:1085-1094

- Genscript (2012)
http://www.genscript.com/cgi-bin/products/enzyme.cgi?op=all_ez&name=MboII
Références bibliographiques

- Institut Pasteur (2006) Rapport d'activité du Centre national de référence
Escherichia coli et Shigella

- Oxoid (2012)
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=DR0120&org=72&c=UK&

- Roche (2005) Expand Long Template PCR system

- Szalo I.M., Taminiau B. & Mainil J. (2006) La lipopolysacharide d'Escherichia coli :
structure, biosynthèse et rôles. Ann Méd Vét 150:108-124
Pretseille Emmanuelle
Rahabi Mouna Chirine
Master MABS 2011-2012
Diagnostic moléculaire des MO
Publication n°6


Determination of Escherichia coli O types by
 allele-specific polymerase chain reaction :
          application to the O types
        involved in human septicemia
 Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E.




                                      N°57 (2007)

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Oral Diagnostic moléculaire PCR Multiplex Sérotypage

  • 1. Pretseille Emmanuelle Master MABS 2011-2012 Diagnostic moléculaire des MO Determination of Escherichia coli O types by allele-specific polymerase chain reaction : application to the O types involved in human septicemia Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E. N°57 (2007)
  • 2. Plan de la présentation Introduction - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques - Sérotypage de l'antigène O Objectif et démarche R&D Mise au point de la méthode de sérotypage - Sélection des sérotypes et des souches - Détermination des groupes phylogénétiques des souches - Design d'amorces et mise en place de l'essai - Validation de l'essai - Résolution des discordances Conclusions
  • 3. Introduction Escherichia coli et ses propriétés antigéniques Escherichia coli - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)
  • 4. Introduction Escherichia coli et ses propriétés antigéniques Escherichia coli - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%) - Aussi un agent pathogène ! Pathologies dues à E. coli Intestinales Diarrhées Turista TIA Dysenterie SHU Extraintestinales Infections urinaires (80%) (ExPEC) Septicémies (20%) E. coli est responsable de pathologies intestinales mais aussi extra-intestinales.
  • 5. Introduction Escherichia coli et ses propriétés antigéniques Escherichia coli - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%) - Aussi un agent pathogène ! Capsule Antigène K Antigène O Paroi Antigène H Flagelle Antigènes K, O et H d'E. coli
  • 6. Introduction Escherichia coli et ses propriétés antigéniques Escherichia coli - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%) - Aussi un agent pathogène ! Capsule Antigène K Antigène O Pouvoir Paroi pathogène Antigène H Flagelle Antigènes K, O et H d'E. coli
  • 7. Introduction Sérotypage de l'antigène O Limites Techniques de Sérogroupe sérotypage Coût Résultats Applications → Diagnostic → Épidémiologie Agglutination → Vaccinologie ? avec des +++ + +++ antisérums (Biorad) Agglutination avec des billes ++ +++ + de latex + Ac anti-O (Oxoid) Milieux chromogènes + ++ 0157:H7 (BD) La détermination Vidas ICE/ECO phénotypique ++ +++ O157:H7 (Biomérieux) de l'antigène O d'E. coli
  • 8. Introduction Sérotypage de l'antigène O Limites Techniques de sérotypage Coût Résultats Applications Méthode classique Agglutination avec des +++ + +++ antisérums (Biorad) Agglutination Test d'agglutination + avec des billes ++ +++ + de latex + Ac anti-O (Oxoid) Milieux chromogènes + ++ 0157:H7 (BD) La détermination Vidas ICE/ECO phénotypique ++ +++ O157:H7 (Biomérieux) de l'antigène O d'E. coli
  • 9. Introduction Sérotypage de l'antigène O Limites Techniques de sérotypage Coût Résultats Applications → Nécessité d'une Agglutination nouvelle technologie : avec des - coûteuse, + fiable et +++ + +++ antisérums + universelle (Biorad) Agglutination avec des billes ++ +++ + de latex + Ac anti-O (Oxoid) Milieux chromogènes + ++ 0157:H7 (BD) La détermination Vidas ICE/ECO ++ +++ O157:H7 phénotypique (Biomérieux) de l'antigène O d'E. coli
  • 10. Introduction Sérotypage de l'antigène O Limites Techniques de sérotypage Coût Résultats Applications → Nécessité d'une Agglutination nouvelle technologie : avec des - coûteuse, + fiable et +++ + +++ antisérums + universelle (Biorad) Agglutination avec des billes ++ +++ + de latex + Ac anti-O (Oxoid) Approche moléculaire Milieux chromogènes + ++ 0157:H7 (BD) La détermination Vidas ICE/ECO ++ +++ O157:H7 phénotypique (Biomérieux) de l'antigène O d'E. coli
  • 11. Introduction Sérotypage de l'antigène O (suite) Opéron rfb (6 à 19 gènes) JUMPstart gnd galF Synthèse de l'antigène O Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de l'antigène O.
  • 12. Introduction Sérotypage de l'antigène O (suite) Opéron rfb (6 à 19 gènes) JUMPstart gnd galF Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de l'antigène O. Techniques de sérotypage Limites - Uniquement pour certains sérotypes PCR basées sur les SNP de rfb - Difficulté d'application en diagnostic - Long « rfb-RFLP » - Difficulté d'interprétation des résultats La détermination génotypique de l'antigène O d'E. Coli
  • 13. Introduction Sérotypage de l'antigène O (suite) Opéron rfb (6 à 19 gènes) JUMPstart gnd galF Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de l'antigène O. Techniques de sérotypage Limites - Uniquement pour certains sérotypes PCR basées sur les SNP de rfb - Difficulté d'application en diagnostic - Long « rfb-RFLP » - Difficulté d'interprétation des résultats La détermination génotypique de l'antigène O d'E. Coli
  • 14. Objectif et démarche R&D Objectif → Mise au point d'un méthode de sérotypage de l'antigène O basée sur une PCR multiplexe allèle spécifique de la portion 5' du locus rfb : application aux Escherichia coli impliquées dans les septicémies humaines Hémocultures (Biomérieux) E.coli Réplicons LPS et Une approche antigène O moléculaire pour le ADN sérotypage Thermocycleur (Eppendorf)
  • 15. Objectif et R&D Sélection des sérotypes et des souches Démarche R&D Détermination des groupes Légende phylogénétiques des souches Pré-requis Mise au point Design des amorces Non Mise en place de l'essai Devenir Résolution des discordances Oui Validation Non de l'essai Oui Applications Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  • 16. Plan de la présentation Introduction - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques - Sérotypage de l'antigène O Objectif et démarche R&D Mise au point de la méthode de sérotypage - Sélection des sérotypes et des souches - Détermination des groupes phylogénétiques des souches - Design d'amorces et mise en place de l'essai - Validation de l'essai - Résolution des discordances Conclusions
  • 17. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de l'essai Résolution des discordances Oui Validation Non de l'essai Oui Applications Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  • 18. Mise au point de la méthode de sérotypage Sélection des sérotypes et des souches → Choix des 12 sérotypes les plus fréquents en septicémie humaine Sérotypes étudiés O1 O7 O18 O2 O12 O25 O4 O15 O75 O6 O16 O157 Une sélection ciblée sur les sérotypes majeurs en bactériologie sanguine
  • 19. Mise au point de la méthode de sérotypage Sélection des sérotypes et des souches → Choix des 12 sérotypes les plus fréquents en septicémie humaine → Un panel de 370 Escherichia coli aux caractères variés Souches pathogènes : Souches non Collections de - urosepsis, pathogènes, souches - infections commensales Ex : ECOR urinaires chez Ex : Nissle 1917 vétérans, - ExPEC
  • 20. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de l'essai Résolution des discordances Oui Validation Non de l'essai Oui Applications Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  • 21. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches Analyses phylogénétiques 4 groupes d'E.coli Groupe Type d'E. coli phylogénétique A Commensales B1 NR B2 ExPEC D ExPEC La pathogénicité d'E.coli semble liée à son groupe phylogénique.
  • 22. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches Analyses phylogénétiques 4 groupes d'E.coli Groupe Type d'E. coli phylogénétique A Commensales B1 NR B2 ExPEC D ExPEC La pathogénicité d'E.coli semble liée à son groupe phylogénique. Comment le déterminer ?
  • 23. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches (suite) 2 méthodes utilisées PCR triplex MLST → Existence de séquences ADN spécifiques aux groupes phylogénétiques chuA, yjaA et TspE4C2 Mise en évidence par : PCR triplex et Southern blot
  • 24. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches (suite) 2 méthodes utilisées PCR triplex MLST Extrait de Clermont et al. (2000) Détermination du groupe phylogénétique par PCR triplex
  • 25. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches (suite) 2 méthodes utilisées PCR triplex MLST → Existence de séquences ADN Multilocus sequence typing spécifiques aux groupes phylogénétiques chuA, yjaA et TspE4C2 Détermination de profils alléliques Mise en évidence par : PCR triplex et Southern blot
  • 26. MLST Détermination du groupe phylogénétique par MLST polB trpA Amplification Chromosome icd E. coli trpB par PCR Séquençage des (fragment ~450nt) fragments obtenus pabB putP Sélection de 6 gènes de ménage Identification des allèles de chaque locus Obtention des Arbre profils alléliques phylogénétique (ou sequence type) Compilation des données
  • 27. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de l'essai Résolution des discordances Oui Validation Non de l'essai Oui Applications Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  • 28. Méthode de sérotypage Design des amorces → 2 souches phylogénétiquement éloignées par sérotype Extrait de Clermont et al. (2007) Une sélection de souches pour des résultats discriminants
  • 29. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique
  • 30. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique Amplification du cluster rfb par Long-range PCR gnd Opéron rfb JUMPstart gnd.f JUMPstart.r Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
  • 31. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique Amplification du cluster rfb par Long-range PCR gnd Opéron rfb JUMPstart gnd.f JUMPstart.r Fragment correspondant à rfb ( ~5000-17000 pb) Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
  • 32. Long Range PCR Le kit Expand Long Template PCR System (Roche) Extrait de Roche (2005) Mix de 2 ADN polymérases Enzyme Origine Activité Caractéristiques Thermostable Thermus Taq Polymérase 5'3' Spécifique aquaticus Sensible Thermococcus Polymérase 5'3' Thermostable Tgo gorgonarius Exonucléase 3'5' Fidèle Un mix de polymérase « idéal » pour la Long-range PCR
  • 33. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique Séquençage de l'extrémité 5' de rfb Séquençage par électrophorèse capillaire des fragments PCR obtenus
  • 34. Principe du séquençage par électrophorèse capillaire : Séquençage étapes majeures (Applied Biosystems) - Cycle de séquençage par technologie BigDye terminator Extrait de Applied Biosystems (2009) - Electrophorèse capillaire → Séparation des fragments selon leur taille (charge) via un polymère dénaturant POP & détection de la fluroscence du Extrait de Applied Biosystems (2009) ddNTP terminal Résultats de l'électrophorèse capillaire
  • 35. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique Séquençage de l'extrémité 5' de rfb Séquençage par électrophorèse capillaire des fragments PCR obtenus Séquences nucléotidiques interprétables d'~300-800 pb pour le design d'amorces O spécifiques
  • 36. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique Choix de l'amorce reverse O spécifique → Comparaison des séquences de référence (GenBank) et de celles obtenues par de novo sequençage
  • 37. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique Choix de l'amorce reverse O spécifique → Comparaison des séquences de référence (GenBank) et de celles obtenues par de novo sequençage Design des amorces reverse O spécifiques (fragments de 200 à 700 pb après PCR) Exemples : rfbO16.r 5'-GGATCATTTATGCTGGTACG-3' (450pb) rfbO7.r 5'-CGAAGATCATCCACGATCCG-3' (722pb)
  • 38. Critères d'optimisation du design d'amorces Design d'amorces Une bonne amorce PCR doit être ... - Absence d'hybridation secondaire Spécifique ! - Minimum de 18 bases de long - Tm > 45°C - GC% ~50% - Aucun dimère de nuclétotides Stable ! - Aucun palindrome (structures secondaires) - Attention GC% en 3' Et attention 1 - Tm proches à la compatibilité !
  • 39. Méthode de sérotypage Mise en place de l'essai PCR multiplex - Milieu réactionnel Lysat bactérien dATP dGTP, dTTP et dCTP 1 amorce forward (gndbis.f) + amorces reverse Tampon 10x + Taq polymerase (ATGC Biotechnologie)
  • 40. Méthode de sérotypage Mise en place de l'essai PCR multiplex - Milieu réactionnel Lysat bactérien dATP dGTP, dTTP et dCTP 1 amorce forward (gndbis.f) + amorces reverse Tampon 10x + Taq polymerase (ATGC Biotechnologie) rfbO1.r , rfbO2.r , rfbO18.r , rfbO4.r , rfbO12.r , rfbO75.r , rfbO16.r , rfbO6a.r & rfbO7.r rfbO25a.r , rfbO15.r & rfbO157.r Primer set 1 Primer set 2
  • 41. Méthode de sérotypage Mise en place de l'essai (suite) PCR multiplex - Programme PCR 100 95 90 Eppendorf Mastercycler Température (en °C°) (Eppendorf) 85 Dénaturation 80 (4 min, 94°C) 75 70 Extension finale 65 (5 min, 72°C) 60 55 30 cycles 50 5s, 94°C 10s, 59°C Temps (en seconde) Évolution de la température dans le thermocycleur
  • 42. Méthode de sérotypage Mise en place de l'essai (suite) - Résultats Extrait de Clermont et al. (2007) Primer set 1 Primer set 2 Electrophorèse des fragments obtenus en PCR multiplex (gel d'agarose et BET révélé aux UV)
  • 43. Méthode de sérotypage Mise en place de l'essai (suite) - Résultats Extrait de Clermont et al. (2007) Primer set 1 Primer set 2 Electrophorèse des fragments obtenus en PCR multiplex (gel d'agarose et BET révélé aux UV) Profils électrophorétiques identiques pour un même sérotype (fragment PCR de même taille)
  • 44. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de l'essai Résolution des discordances Oui Validation Non de l'essai Oui Applications Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  • 45. Méthode de sérotypage Validation de l'essai Reproductibilité Sensibilité Spécificité
  • 46. Méthode de sérotypage Validation de l'essai Reproductibilité Sensibilité Spécificité Reproductibilité (répétabilité) Testée inter-laboratoires. Tests réalisés : - PCR multiplex avec amorces spécifiques x12 - Typage de 24 souches dites communes Méthode reproductible et précise (Résultats identiques mais quelques optimisations)
  • 47. Méthode de sérotypage Validation de l'essai Reproductibilité Sensibilité Spécificité Sensibilité Test sur 153 souches → Sensibilité ~ 93% Problèmes rencontrés : - Absence de produit PCR, - Fragment de PCR correspondant à un autre sérotype que celui attendu Sensibilité et spécificité de la PCR multiplex
  • 48. Méthode de sérotypage Validation de l'essai Reproductibilité Sensibilité Spécificité Spécificité Test sur 167 souches représentant 61 sérotype O non ciblés → Aucune fausse amplification Problème rencontré : Faux positifs pour 6 souches aux sérotypes O ciblés mais apparaissant faussement d'un autre sérotype Sensibilité et spécificité de la PCR multiplex
  • 49. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de l'essai Résolution des discordances Oui Validation Non de l'essai Oui Applications Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  • 50. Méthode de sérotypage Résolution des discordances → 12 souches montrant des discordances de sérotypes rfb RFLP et séquençage
  • 51. Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000) rfb RFLP - Long-range PCR gnd Opéron rfb JUMPstart gnd.f JUMPstart.r Fragment correspondant à rfb Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
  • 52. Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000) rfb RFLP - Long-range PCR gnd Opéron rfb JUMPstart gnd.f JUMPstart.r Fragment correspondant à rfb Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR - RFLP (Restriction Length Fragment Polymorphism) 5' GAAGANNNNNNNN / 3' 3' CTTCTNNNNNNN / N 5' Site de coupure de l'endonucléase MboII
  • 53. Méthode de sérotypage Résolution des discordances → 12 souches montrant des discordances de sérotypes rfb RFLP et séquençage Rappel des problèmes rencontrés : - Échec de l'amplification malgré les amorces spécifiques - Produit PCR présentant un type 0 qui n'est pas le sien
  • 54. Méthode de sérotypage Résolution des discordances (suite) Produit PCR présentant un type 0 qui Adapté de Clermont et al. (2007) n'est pas le sien → O1 et O6 / O18 Réarrangement du locus rfb et présence d'une séquence typique de O18 Profil électrophorétique après rfb RFLP
  • 55. Méthode de sérotypage Résolution des discordances (suite) Produit PCR présentant un type 0 qui Adapté de Clermont et al. (2007) n'est pas le sien → O12/O16 Les souches appartiennent bien au sérotype O16. (portion 5' de rfb typique de ce sérotype) Profil électrophorétique après rfb RFLP
  • 56. Plan de la présentation Introduction - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques - Sérotypage de l'antigène O Objectif et démarche R&D Mise au point de la méthode de sérotypage - Sélection des sérotypes et des souches - Détermination des groupes phylogénétiques des souches - Design d'amorces et mise en place de l'essai - Validation de l'essai - Résolution des discordances Conclusions
  • 57. Conclusions Une méthode robuste → Méthode moléculaire de sérotypage de l'antigène O d'Escherichia coli Méthode Qualités Limites Rapide Simple Sérotypage incorrect si : PCR multiple Peu coûteuse - voies de synthèse de l'Ag allèle Appareillage simple O variables spécifique Typage de souches - dégénérescence du locus « rough » et « non rfb agglutinantes » Bilan de l'essai de Clermont et al. (2007)
  • 58. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de l'essai Résolution des discordances Oui Validation Non de l'essai Oui Applications Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  • 59. Conclusion Des applications personnalisables – DIAGNOSTIC : Sérotypage de routine en LABM en cas de septicémies à E. coli – EPIDEMIOLOGIE: Création de kits épidémies spécifiques selon une région géographique et/ou une pathologie Exemple : Sérotype O45 et méningite du nouveau-né en France
  • 60. Références bibliographiques - Applied Biosystems (2009) DNA sequencing by capillary electrophoresis - Biomérieux (2012) http://www.biomerieux.fr/servlet/srt/bio/france/dynPage?open=FRN_IND_FDA_PRD&do - Clermont O., Bonacorsi S. & Bingen E. (2000) Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl Environ Microbiol 66:639-654 - Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E. (2007) Determination of Escherichia coli O types by allele-specific polymerase chain reaction: application to the O types involved in human septicemia. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 57:129-136 - Escobar-Paramo P., Clermont O., Blanc-Potard AB, Bui H, Le Bouguenec C & Denamur E. (2004) A specific genetic background is required for acquisition and expression of virulencde factors in Escherichia coli. Mol Biol Evol 21:1085-1094 - Genscript (2012) http://www.genscript.com/cgi-bin/products/enzyme.cgi?op=all_ez&name=MboII
  • 61. Références bibliographiques - Institut Pasteur (2006) Rapport d'activité du Centre national de référence Escherichia coli et Shigella - Oxoid (2012) http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=DR0120&org=72&c=UK& - Roche (2005) Expand Long Template PCR system - Szalo I.M., Taminiau B. & Mainil J. (2006) La lipopolysacharide d'Escherichia coli : structure, biosynthèse et rôles. Ann Méd Vét 150:108-124
  • 62. Pretseille Emmanuelle Rahabi Mouna Chirine Master MABS 2011-2012 Diagnostic moléculaire des MO Publication n°6 Determination of Escherichia coli O types by allele-specific polymerase chain reaction : application to the O types involved in human septicemia Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E. N°57 (2007)