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Pretseille Emmanuelle
Master 1 MABS
UE EM7BMGEM - Méthodes
expérimentales et publication scientifique


              Interactions plantes-microorganismes,
          pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle

   Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoir
pathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire,
         Xanthomonas campestris pv campestris
Plan de la présentation


- Introduction
- Objectifs des expérimentations
- Étude de la cassette « Saccharose »
          - Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359
          - Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux
          - Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356
- Discussions
- Bilan
                                        Les symboles suivants indiquent les TPs
- Remerciements                         correspondant aux différentes parties
                                        présentées :
- Références
                                              1        2       3       4
Introduction

 Sujet des Tps : Étude du pouvoir pathogène chez la bactérie phytopathogène,
                  Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc)


          Xcc & facteurs de pathogénicité


                  1
- Bacilles Gram -
- Membres des γprotéobactéries
- Responsable de la pourriture noire chez les Brassicacées
- Bactérie à croissance lente 1


                                                                Colonies de Xcc
                                                              sur milieu solide riche
                                                             [Adapté de Blanvillain (2007)]
Introduction
                        Pore de la feuille              Phase de
                                                       pénétration
                                                      dans la feuille
     Vie à la surface
       des feuilles



                                                    Dégradation de la
                                                     paroi végétale

                                                    Libération des
                                                    composants de la
                                                    paroi (pectine,
                                                    cellulose …) et du
                                                    saccharose (sucre
                                                    majeur chez les
                                                    végétaux).



                                     Cycle de vie de la bactérie Xcc
                                      [Adapté de Boulanger (2007)]
Introduction

 Sujet des Tps : Étude du pouvoir pathogène chez la bactérie phytopathogène,
                   Xanthomonas campestris pv. Campestris (Xcc)


          Xcc & facteurs de pathogénicité



- Bacilles Gram -
- Membres des γprotéobactéries
- Responsable de la pourriture noire chez les Brassicacées
- Bactérie à croissance lente


- Étude des récepteurs TonB-dépendants (TBDR) →
                                                                Colonies de Xcc
 clusters de gènes impliqués dans le transport et la          sur milieu solide riche
dégradation de molécules végétales                           [Adapté de Blanvillain (2007)]

                     Loci CUT (carbohydrate utilization containing TBDR)
Objectifs des expérimentations

                        Différentes molécules végétales



     Saccharose




  Test de croissance    1
Construction de mutants 2
  Étude d'expression
 Étude d'un régulateur 4




 Caractérisation du
locus Xcc3356-3359

 Fonctionnement ?
Objectifs des expérimentations

                        Différentes molécules végétales



     Saccharose                    Pectine



                                                     2
  Test de croissance    1    Conjugaison triparentale
Construction de mutants 2     Étude d'un promoteur 3
  Étude d'expression                                  4
 Étude d'un régulateur 4




 Caractérisation du           Caractérisation du
locus Xcc3356-3359           locus Xcc0117-0122

 Fonctionnement ?           Induction de Xcc0119?
Objectifs des expérimentations

                        Différentes molécules végétales



     Saccharose                    Pectine                        Cellulose



                                                     2
  Test de croissance    1    Conjugaison triparentale        Construction de mutants 3
Construction de mutants 2     Étude d'un promoteur 3         Conjugaison triparentale 4
  Étude d'expression                                  4
 Étude d'un régulateur 4




 Caractérisation du           Caractérisation du             Caractérisation
locus Xcc3356-3359           locus Xcc0117-0122              du gène Xcc3534

 Fonctionnement ?           Induction de Xcc0119?         Lien avec un locus CUT ?
Objectifs des expérimentations

                        Différentes molécules végétales



     Saccharose                    Pectine                       Cellulose




  Test de croissance    1    Conjugaison triparentale      Construction de mutants
Construction de mutants 2     Étude d'un promoteur         Conjugaison triparentale
  Étude d'expression
 Étude d'un régulateur 4




 Caractérisation du           Caractérisation du           Caractérisation
locus Xcc3356-3359           locus Xcc0117-0122            du gène Xcc3534

 Fonctionnement ?           Induction de Xcc0119?       Lien avec un locus CUT?
Plan de la présentation


- Introduction
- Objectifs des expérimentations
- Étude de la cassette « Saccharose »
          - Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359
          - Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux
          - Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356
- Discussions
- Bilan
                                        Les symboles suivants indiquent les TPs
- Remerciements                         correspondants aux différentes parties
                                        présentées :
- Références
                                              1        2       3       4
Étude de la cassette « Saccharose »

  État de l'art




     3356           3357                 3358                 3359

             Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose »
                        [Adapté de Bottin & all (2011)]

- Xcc3356, régulateur de la famille LacI
- Xcc3357, transporteur de la membrane interne
- Xcc3358, TBDR (transporteur de la membrane externe)
- Xcc3359, amylosucrase (saccharose hydrolase)                     Opéron
Étude de la cassette « Saccharose »

  État de l'art




     3356           3357                 3358                 3359

             Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose »
                        [Adapté de Bottin & all (2011)]

- Xcc3356, régulateur de la famille LacI
- Xcc3357, transporteur de la membrane interne
- Xcc3358, TBDR (transporteur de la membrane externe)
- Xcc3359, amylosucrase (saccharose hydrolase)                     Opéron



                             Fonctionnement ?
Cassette « Saccharose »
                                                                               1
      Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359

  Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose
             et MME+saccharose

  Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant d'insertion sur 3359) et Xcc
                     i3359 complémenté
Cassette « Saccharose »




                     Xcc WT
                                                             Double recombinaison

      Gène Xcc3359                                    uidA       Gène rapporteur GUS
                                 AmpR

      Zone de recombinaison
      homologue
                                    oriT             KanR
                                                                 Plasmide pVO155
                     Xcc i3359              BleoR




          Construction des souches mutantes de Xcc: exemple avec Xcc3359
                             [Extrait de Bottin & all (2011)]
Cassette « Saccharose »
                                                                               1
      Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359

  Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et
             MME+saccharose

  Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant d'insertion sur 3359) et Xcc
                     i3359 complémenté

  Résultats :
         - Pousse identique des 3 souches sur MME+glucose
         - Sur MME+saccharose,
                - Xcc WT et Xcc i3359 complémenté : pousse normale;
                - Xcc i3359 : aucune pousse.
Cassette « Saccharose »
                                                                               1
      Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359

  Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et
             MME+saccharose

  Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant d'insertion sur 3359) et Xcc
                     i3359 complémenté

  Résultats :
         - Pousse identique des 3 souches sur MME+glucose
         - Sur MME+saccharose,
                - Xcc WT et Xcc i3359 complémenté : pousse normale;
                - Xcc i3359 : aucune pousse.


        Xcc3359 permet la pousse sur milieu saccharose.

                 Xcc3359 → utilisation du saccharose [ locus sux ]
                 Effet du saccharose sur les autres gènes du locus ?
Cassette « Saccharose »
                                                                                 2
      Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux

  Principe : Tester l'activité des promoteurs de différents gènes du locus sux
             chez des mutants d'insertion par dosage de l'activité GUS
Cassette « Saccharose »                                                         2

    - Mutant d'insertion et GUS



        Région promotrice            Gène GUS             Partie terminale de
                                                                Xcc335*
           de Xcc335*




                Dosage GUS et évaluation de l'activité d'un promoteur
Cassette « Saccharose »                                                         2

    - Mutant d'insertion et GUS



        Région promotrice            Gène GUS             Partie terminale de
                                                                Xcc335*
           de Xcc335*



    - Réaction en jeu :

                                   H 2O
       PNPG + GUS                                 Galactose + p-nitrophenol
                                   37°C


    - Calcul de l'activité

                            Activité GUS =
  (DO415nm – 1,75*DO550nm) / (DO600nm*0,001*Volume(mL)*tps de réaction)

                Dosage GUS et évaluation de l'activité d'un promoteur
Cassette « Saccharose »
                                                                                    2
      Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux

  Principe : Tester l'activité du promoteur de différents gènes du locus Sux chez
  des mutants d'insertion par dosage de l'activité GUS

  Souches utilisées : Xcc i3356, Xcc i3357, Xcc i3358 et Xcc i3359.

  Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharose

  Résultats :
Cassette « Saccharose »                                                                                 2

                                          16




           Act. GUS (Sac)/Act. GUS(Glu)   14                                     * 14

                                          12




                                          10




                                           8




                                           6




                                           4




                                           2
                                                                                                * 2,2
                                                       ~1
                                                                    ~1
                                           0

                                               i3356        i3357        i3358          i3359


   Histogramme des rapports « activité GUS (Saccharose) / activité GUS (Glucose) »
                  selon la souche mutante Xcc i335* considérée
Cassette « Saccharose »
                                                                                    2
      Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus Sux

  Principe : Tester l'activité du promoteur de différents gènes du locus Sux chez
  des mutants d'insertion par dosage de l'activité GUS

  Souches utilisées : Xcc i3356, Xcc i3357, Xcc i3358 et Xcc i3359.

  Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharose

  Résultats :

        - Xcc i3356 et Xcc i3357 avec activité similaire dans les 2 conditions.
        - Activité GUS +++ pour Xcc i3358 et Xcc i3359 en milieu saccharose.


        L'expression de Xcc3358 et Xcc3359 est induite par le
        saccharose. Réponse à un signal végétal ?

                  Opéron Xcc3358-59 → rôle majeur dans la pathogénicité
                  Mécanisme de régulation ?
Cassette « Saccharose »
                                                           4
      Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356

Principe : Détermination de l'activité d'un régulateur via dosage de l'activité
           bêta-galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de
           substrats différents.

Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharose

Souches utilisées: Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358
Cassette « Saccharose »

    - « Description » d'une souche utilisée

                          Xcc WT pl 750 prom 3358

       Xcc sauvage                                          Promoteur contrôlant
                              Plasmide pCZ750                   LacZ dans la
                          avec le gène LacZ codant           construction obtenue
                                 pour la βGal




         Dosage de la bêta galactosidase dans l'étude d'expression de gènes
Cassette « Saccharose »

    - « Description » d'une souche utilisée

                             Xcc WT pl 750 prom 3358

       Xcc sauvage                                          Promoteur contrôlant
                                 Plasmide pCZ750                LacZ dans la
                             avec le gène LacZ codant        construction obtenue
                                    pour la βGal

    - Réaction en jeu                                                         4


                                     H2O
       ONPG + βGal                                 Galactose +       ONP
                                     28°C


    - Calcul de l'activité

Activité(Unité Miller) = [(DO420nm-1,75*DO550)*1000]/[DO600*temps (min)*vol(mL)]

         Dosage de la bêta galactosidase dans l'étude d'expression de gènes
Cassette « Saccharose »
                                                             4
      Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356

Principe : Détermination de l'activité d'un régulateur via dosage de l'activité bêta-
           galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats
           différents..

Milieux de culture : MME+glucose et MME+saccharose

Souches utilisées : Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358

Résultats:
Cassette « Saccharose »                                                                   4

                                   14000




                                                    ~ 11000
                                   12000                              Milieu Saccharose
 Activité βGal (en unité Miller)




                                   10000
                                                                      Milieu Glucose


                                    8000




                                    6000




                                    4000




                                                                Histogramme des activités
                                    2000

                                           < 1000               βgalactosidase selon le
                                                                milieu de culture et
                                       0
                                                                la souche testée

                                           Xcc WT   Xcc i3356
Cassette « Saccharose »
                                                              4
      Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356

Principe : Détermination de l'activité d'un régulateur via dosage de l'activité bêta-
           galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats
           différents.

Milieux de culture : MME+glucose et MME+saccharose

Souches utilisées : Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358

Résultats:
        - Activité βGal Xcc WT + en milieu Saccharose.
        - Activité βGal +++ pour Xcc i3356 quelque soit le milieu.

             Xcc3356 est un répresseur des gènes du locus sux.

                  Rôle de Xcc3357 ? Régulation ?
                  Tests de pathogénicité sur les mutants d'insertion ?
Plan de la présentation


- Introduction
- Objectifs des expérimentations
- Étude de la cassette « Saccharose »
          - Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359
          - Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux
          - Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356
- Discussions
- Bilan
- Remerciements
- Références
Discussions

    Cassette « Saccharose »
                                                         Utilisation du
                Répresseur                            saccharose par Xcc




        3356            3357                3358            3359

                                                              Induction

Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose »
           [Adapté de Bottin & all (2011)]                    Saccharose
Discussions

    Cassette « Saccharose »
                                                          Utilisation du
                Répresseur                             saccharose par Xcc




        3356            3357                3358               3359

                                                                 Induction

Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose »
           [Adapté de Bottin & all (2011)]                       Saccharose




- Perspectives :
   - Tests de pathogénicité sur plantes
   - Etude du transport du saccharose par Xcc3357 et Xcc3358
   - Phylogénie : origine ? avantage évolutif ? adaptation à l'environnement ?
Discussions



Transporteur
  saccharose
     (TBDR)




  Interaction
                                                                  Saccharose =
saccharose-
                                                                  substrat de
 répresseur
                                                                  l'enzyme
→ induction
  des gènes




          Modèle du locus CUT fonctionnel basé sur le locus sux de Xcc
                        [Adapté de Blanvillain & all (2007)]
Discussions


    Locus Xcc0117-0122
Bilan des expérimentations :
    - Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de Xcc0119
    - Étude de ce promoteur par dosage de l'activité βGal du mutant et du WT
      en milieu Glucose et PGA

                    Activité +++ en présence de PGA

         Induction de l'expression de Xcc0119 en milieu PGA.
Discussions


    Locus Xcc0117-0122
Bilan des expérimentations :
    - Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de Xcc0119
    - Étude de ce promoteur par dosage de l'activité βGal du mutant et du WT
      en milieu Glucose et PGA

                    Activité +++ en présence de PGA

         Induction de l'expression de Xcc0119 en milieu PGA.


         0118         0119                0120           0121         0122

   Deoxygluconate     TBDR                TBDR        Pectin Methyl   Pectate
       kinase                                           Esterase       Lyase


                    Induction
                                    Locus CUT putativement impliqué dans le
                                       métabolisme de la pectine chez Xcc
   PGA                                    [Adapté de Bottin & all (2011)]
Discussions


    Gène Xcc3534
Bilan des expérimentations :
    - Construction d'un mutant d'insertion dans Xcc3534 par conjugaison
       triparentale et vérification par PCR/ gel d'électrophorèse

                    Obtention de mutants.
Discussions


    Gène Xcc3534
Bilan des expérimentations :
    - Construction d'un mutant d'insertion dans Xcc3534 par conjugaison
       triparentale et vérification par PCR/ gel d'électrophorèse

                    Obtention de mutants.

Suite des investigations:
    - Tests de croissance sur milieu Glucose et Cellulose du mutant d'insertion
    dans Xcc3534
    - Analyse fonctionnelle des gènes voisins de Xcc3534

      CorA        cycA        3354           3355         (hyp)        pheC


       Transporteurs                                              Transporteur de
                              Enzymes du catabolisme
       membranaires                                                la membrane
                                  de la cellulose
                                                                      externe


      Gènes voisins de Xcc3354 : un locus hypothétique dédié à la cellulose
Bilan

   Caractérisation en cours de trois loci CUT probables


Locus sux           Locus pectine          Locus cellulose
Bilan

    Caractérisation en cours de trois loci CUT probables


Locus sux            Locus pectine          Locus cellulose



 Lien entre TBDRs et l'utilisation des molécules végétales par Xcc
Bilan

    Caractérisation en cours de trois loci CUT probables


Locus sux                 Locus pectine             Locus cellulose



 Lien entre TBDRs et l'utilisation des molécules végétales par Xcc




  - Meilleure compréhension de l'adaptation plantes/MO
  - Moyen de lutte contre les bactéries phytopathogènes
  - Applications industrielles (clarification des jus de fruits, biocarburant ...)
Remerciements




   Mes remerciements s'adressent à :

- l'ensemble des professeurs de cette unité d'enseignement, Martine
Lautier, Arnaud Bottin, Christophe Jacquet et Elisabeth Crosnier ;

- à mes camarades du parcours alternatif en particulier à ma binôme,
Anne-Laure Brasset;

- aux préparateurs/préparatrices des salles où nos travaux pratiques
ont eu lieu.
Références bibliographiques
Blanvillain S (2007) Etude des récepteurs TonB-dépendants et d'un nouvel effecteur de type III
de la bactérie phytopathogène Xanthomonas campestris pv. campestris. Doctorat de
microbiologie. Université Paul Sabatier. Toulouse.

Blanvillain S, Meyer D, Boulanger A, Lautier M, Guynet C, Denancé N, Vasse J, Lauber E &
Arlat M (2007) Plant Carbohydrate Scavenging through TonB-Dependent Receptors: A
Feature Shared by Phytopathogenic and Aquatic Bacteria. PLoS One. 2(2):e244.

Bottin A, Lautier M & Jacquet C (2011) Méthodes expérimentales et publication scientifique :
interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène, régulation transcriptionnelle. Master
MABS - UE EM7BMGEM. Université Paul Sabatier. Toulouse.

Boulanger A (2007) Analyse d'un nouveau système CUT impliqué dans l'acquisition et
l'utilisation du N-acétylglucosamine par Xanthomonas campestris pathovar campestris.
Doctorat de microbiologie. Université Paul Sabatier. Toulouse.

Brasset AL (2011) Analysis of the pathogenicity and transcriptional regulation of the pathogen
Xanthomonas campestris pv. campestris. Master MABS. Université Paul Sabatier. Toulouse.

NCBI (2011) Fiche Gene XCC3534 1,4-beta-cellobiosidase (ID: 1000107)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1000107
Références des illustrations
                             (Classées selon leur ordre d'apparition)

- http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Crucifers/BlackRot_Cruc/BR_CrucFS4.jpg
- http://www.omafra.gov.on.ca/IPM/images/brassica/diseases/black-rot-cabbage_zoom.jpg
Pretseille Emmanuelle
Master 1 MABS
UE EM7BMGEM - Méthodes
expérimentales et publication scientifique


              Interactions plantes-microorganismes,
          pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle

   Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoir
pathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire,
         Xanthomonas campestris pv campestris
Annexe 1 : Conjugaison triparentale
  2 Transfert par conjugaison du promoteur du gène Xcc0119

  3 Construction d'un mutant d'insertion dans le gène Xcc3534


    Présentation des souches

       Bactérie donneuse                           Bactérie cible
         E. coli avec
  pVO 155 + 300b de Xcc 3534
                                                      Xcc WT
           (Kan R)
                                                      (Rif R)



                            Souche « helper »
Plasmide vecteur               E. coli avec                       Bactérie
                                PRK 600                      non transformable
                            (Spectinomycine R)

Plasmide « helper »
Conjugaison triparentale

       Culture des souches



                                   Culture sur milieu Moka (milieu riche)




 Transfert du vecteur « helper »
 dans la souche donneuse puis        Culture sur milieu Moka et ATB :
     conjugaison vers Xcc              Rifampicine et Kanamycine




              Xcc avec
     pVO 155 + 300b de Xcc3534
          (Rif R et Kan R)         Sélection des clones Rif R et Kan R

                                                   Xcc i3534
3
      Annexe 2 : PCR sur colonies chez Xanthomonas                                4


Référence : Chez E. coli, suspension d'une colonie dans de l'eau stérile puis ajout
            du mix PCR.
                           Non applicable chez Xanthomonas !

    Adaptation du protocole

 - Mise en suspension d'une colonie dans le l'eau stérile
 - Lyse des bactéries !

                                    Tampon de lyse au PEG


                            Obtention d'un « jus Xcc » (ADN)


 - Mix PCR (eau, tampon vert, dNTPs, Taq pol, oligo 1 et oligo 2)
 - Cycle/Programme PCR
 - Révélation taille du fragment obtenu → électrophorèse sur gel
http://www.sesep.uvsq.fr/formation/PCR4.jpg
   PCR sur Xcc




Vitesse GoTaq :
    1 min/ kb

                  Schéma bilan de la PCR
Annexe 3 : Analyse de gel d'électrophorèse
3 Electrophorèse sur gel d'agarose des PCRs réalisées sur Xcc WT
  pl750 et Xcc pl 750 + prom 119
4 Electrophorèse sur gel d'agarose des PCRs réalisées sur Xcc WT pVO155
  et Xcc pVO155 + Xcc3534 (= mutant d'insertion)

    DNA                      Clones testés
  ladder
 (en pb)

  10000
   8000
   6000                                Fragment d'intérêt à 1kb
   5000
   4000
   3000
   2500                                PCR ayant amplifiée le promoteur du
   2000                                      gène Xcc0119 de 1kb
   1500                                     → taille correspondante
   1000
    750
    500


                                             Validation des clones obtenus
Pretseille Emmanuelle
Master 1 MABS
UE EM7BMGEM - Méthodes
expérimentales et publication scientifique


              Interactions plantes-microorganismes,
          pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle

   Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoir
pathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire,
         Xanthomonas campestris pv campestris

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Oral Méthode Expérimentale Loci CUT

  • 1. Pretseille Emmanuelle Master 1 MABS UE EM7BMGEM - Méthodes expérimentales et publication scientifique Interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoir pathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire, Xanthomonas campestris pv campestris
  • 2. Plan de la présentation - Introduction - Objectifs des expérimentations - Étude de la cassette « Saccharose » - Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359 - Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux - Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356 - Discussions - Bilan Les symboles suivants indiquent les TPs - Remerciements correspondant aux différentes parties présentées : - Références 1 2 3 4
  • 3. Introduction Sujet des Tps : Étude du pouvoir pathogène chez la bactérie phytopathogène, Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) Xcc & facteurs de pathogénicité 1 - Bacilles Gram - - Membres des γprotéobactéries - Responsable de la pourriture noire chez les Brassicacées - Bactérie à croissance lente 1 Colonies de Xcc sur milieu solide riche [Adapté de Blanvillain (2007)]
  • 4. Introduction Pore de la feuille Phase de pénétration dans la feuille Vie à la surface des feuilles Dégradation de la paroi végétale Libération des composants de la paroi (pectine, cellulose …) et du saccharose (sucre majeur chez les végétaux). Cycle de vie de la bactérie Xcc [Adapté de Boulanger (2007)]
  • 5. Introduction Sujet des Tps : Étude du pouvoir pathogène chez la bactérie phytopathogène, Xanthomonas campestris pv. Campestris (Xcc) Xcc & facteurs de pathogénicité - Bacilles Gram - - Membres des γprotéobactéries - Responsable de la pourriture noire chez les Brassicacées - Bactérie à croissance lente - Étude des récepteurs TonB-dépendants (TBDR) → Colonies de Xcc clusters de gènes impliqués dans le transport et la sur milieu solide riche dégradation de molécules végétales [Adapté de Blanvillain (2007)] Loci CUT (carbohydrate utilization containing TBDR)
  • 6. Objectifs des expérimentations Différentes molécules végétales Saccharose Test de croissance 1 Construction de mutants 2 Étude d'expression Étude d'un régulateur 4 Caractérisation du locus Xcc3356-3359 Fonctionnement ?
  • 7. Objectifs des expérimentations Différentes molécules végétales Saccharose Pectine 2 Test de croissance 1 Conjugaison triparentale Construction de mutants 2 Étude d'un promoteur 3 Étude d'expression 4 Étude d'un régulateur 4 Caractérisation du Caractérisation du locus Xcc3356-3359 locus Xcc0117-0122 Fonctionnement ? Induction de Xcc0119?
  • 8. Objectifs des expérimentations Différentes molécules végétales Saccharose Pectine Cellulose 2 Test de croissance 1 Conjugaison triparentale Construction de mutants 3 Construction de mutants 2 Étude d'un promoteur 3 Conjugaison triparentale 4 Étude d'expression 4 Étude d'un régulateur 4 Caractérisation du Caractérisation du Caractérisation locus Xcc3356-3359 locus Xcc0117-0122 du gène Xcc3534 Fonctionnement ? Induction de Xcc0119? Lien avec un locus CUT ?
  • 9. Objectifs des expérimentations Différentes molécules végétales Saccharose Pectine Cellulose Test de croissance 1 Conjugaison triparentale Construction de mutants Construction de mutants 2 Étude d'un promoteur Conjugaison triparentale Étude d'expression Étude d'un régulateur 4 Caractérisation du Caractérisation du Caractérisation locus Xcc3356-3359 locus Xcc0117-0122 du gène Xcc3534 Fonctionnement ? Induction de Xcc0119? Lien avec un locus CUT?
  • 10. Plan de la présentation - Introduction - Objectifs des expérimentations - Étude de la cassette « Saccharose » - Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359 - Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux - Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356 - Discussions - Bilan Les symboles suivants indiquent les TPs - Remerciements correspondants aux différentes parties présentées : - Références 1 2 3 4
  • 11. Étude de la cassette « Saccharose » État de l'art 3356 3357 3358 3359 Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose » [Adapté de Bottin & all (2011)] - Xcc3356, régulateur de la famille LacI - Xcc3357, transporteur de la membrane interne - Xcc3358, TBDR (transporteur de la membrane externe) - Xcc3359, amylosucrase (saccharose hydrolase) Opéron
  • 12. Étude de la cassette « Saccharose » État de l'art 3356 3357 3358 3359 Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose » [Adapté de Bottin & all (2011)] - Xcc3356, régulateur de la famille LacI - Xcc3357, transporteur de la membrane interne - Xcc3358, TBDR (transporteur de la membrane externe) - Xcc3359, amylosucrase (saccharose hydrolase) Opéron Fonctionnement ?
  • 13. Cassette « Saccharose » 1 Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359 Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et MME+saccharose Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant d'insertion sur 3359) et Xcc i3359 complémenté
  • 14. Cassette « Saccharose » Xcc WT Double recombinaison Gène Xcc3359 uidA Gène rapporteur GUS AmpR Zone de recombinaison homologue oriT KanR Plasmide pVO155 Xcc i3359 BleoR Construction des souches mutantes de Xcc: exemple avec Xcc3359 [Extrait de Bottin & all (2011)]
  • 15. Cassette « Saccharose » 1 Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359 Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et MME+saccharose Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant d'insertion sur 3359) et Xcc i3359 complémenté Résultats : - Pousse identique des 3 souches sur MME+glucose - Sur MME+saccharose, - Xcc WT et Xcc i3359 complémenté : pousse normale; - Xcc i3359 : aucune pousse.
  • 16. Cassette « Saccharose » 1 Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359 Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et MME+saccharose Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant d'insertion sur 3359) et Xcc i3359 complémenté Résultats : - Pousse identique des 3 souches sur MME+glucose - Sur MME+saccharose, - Xcc WT et Xcc i3359 complémenté : pousse normale; - Xcc i3359 : aucune pousse. Xcc3359 permet la pousse sur milieu saccharose. Xcc3359 → utilisation du saccharose [ locus sux ] Effet du saccharose sur les autres gènes du locus ?
  • 17. Cassette « Saccharose » 2 Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux Principe : Tester l'activité des promoteurs de différents gènes du locus sux chez des mutants d'insertion par dosage de l'activité GUS
  • 18. Cassette « Saccharose » 2 - Mutant d'insertion et GUS Région promotrice Gène GUS Partie terminale de Xcc335* de Xcc335* Dosage GUS et évaluation de l'activité d'un promoteur
  • 19. Cassette « Saccharose » 2 - Mutant d'insertion et GUS Région promotrice Gène GUS Partie terminale de Xcc335* de Xcc335* - Réaction en jeu : H 2O PNPG + GUS Galactose + p-nitrophenol 37°C - Calcul de l'activité Activité GUS = (DO415nm – 1,75*DO550nm) / (DO600nm*0,001*Volume(mL)*tps de réaction) Dosage GUS et évaluation de l'activité d'un promoteur
  • 20. Cassette « Saccharose » 2 Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux Principe : Tester l'activité du promoteur de différents gènes du locus Sux chez des mutants d'insertion par dosage de l'activité GUS Souches utilisées : Xcc i3356, Xcc i3357, Xcc i3358 et Xcc i3359. Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharose Résultats :
  • 21. Cassette « Saccharose » 2 16 Act. GUS (Sac)/Act. GUS(Glu) 14 * 14 12 10 8 6 4 2 * 2,2 ~1 ~1 0 i3356 i3357 i3358 i3359 Histogramme des rapports « activité GUS (Saccharose) / activité GUS (Glucose) » selon la souche mutante Xcc i335* considérée
  • 22. Cassette « Saccharose » 2 Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus Sux Principe : Tester l'activité du promoteur de différents gènes du locus Sux chez des mutants d'insertion par dosage de l'activité GUS Souches utilisées : Xcc i3356, Xcc i3357, Xcc i3358 et Xcc i3359. Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharose Résultats : - Xcc i3356 et Xcc i3357 avec activité similaire dans les 2 conditions. - Activité GUS +++ pour Xcc i3358 et Xcc i3359 en milieu saccharose. L'expression de Xcc3358 et Xcc3359 est induite par le saccharose. Réponse à un signal végétal ? Opéron Xcc3358-59 → rôle majeur dans la pathogénicité Mécanisme de régulation ?
  • 23. Cassette « Saccharose » 4 Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356 Principe : Détermination de l'activité d'un régulateur via dosage de l'activité bêta-galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats différents. Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharose Souches utilisées: Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358
  • 24. Cassette « Saccharose » - « Description » d'une souche utilisée Xcc WT pl 750 prom 3358 Xcc sauvage Promoteur contrôlant Plasmide pCZ750 LacZ dans la avec le gène LacZ codant construction obtenue pour la βGal Dosage de la bêta galactosidase dans l'étude d'expression de gènes
  • 25. Cassette « Saccharose » - « Description » d'une souche utilisée Xcc WT pl 750 prom 3358 Xcc sauvage Promoteur contrôlant Plasmide pCZ750 LacZ dans la avec le gène LacZ codant construction obtenue pour la βGal - Réaction en jeu 4 H2O ONPG + βGal Galactose + ONP 28°C - Calcul de l'activité Activité(Unité Miller) = [(DO420nm-1,75*DO550)*1000]/[DO600*temps (min)*vol(mL)] Dosage de la bêta galactosidase dans l'étude d'expression de gènes
  • 26. Cassette « Saccharose » 4 Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356 Principe : Détermination de l'activité d'un régulateur via dosage de l'activité bêta- galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats différents.. Milieux de culture : MME+glucose et MME+saccharose Souches utilisées : Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358 Résultats:
  • 27. Cassette « Saccharose » 4 14000 ~ 11000 12000 Milieu Saccharose Activité βGal (en unité Miller) 10000 Milieu Glucose 8000 6000 4000 Histogramme des activités 2000 < 1000 βgalactosidase selon le milieu de culture et 0 la souche testée Xcc WT Xcc i3356
  • 28. Cassette « Saccharose » 4 Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356 Principe : Détermination de l'activité d'un régulateur via dosage de l'activité bêta- galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats différents. Milieux de culture : MME+glucose et MME+saccharose Souches utilisées : Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358 Résultats: - Activité βGal Xcc WT + en milieu Saccharose. - Activité βGal +++ pour Xcc i3356 quelque soit le milieu. Xcc3356 est un répresseur des gènes du locus sux. Rôle de Xcc3357 ? Régulation ? Tests de pathogénicité sur les mutants d'insertion ?
  • 29. Plan de la présentation - Introduction - Objectifs des expérimentations - Étude de la cassette « Saccharose » - Complémentation de fonction d'un mutant sur Xcc3359 - Test d'activité GUS de mutants sur les gènes du locus sux - Caractérisation d'un régulateur, Xcc3356 - Discussions - Bilan - Remerciements - Références
  • 30. Discussions Cassette « Saccharose » Utilisation du Répresseur saccharose par Xcc 3356 3357 3358 3359 Induction Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose » [Adapté de Bottin & all (2011)] Saccharose
  • 31. Discussions Cassette « Saccharose » Utilisation du Répresseur saccharose par Xcc 3356 3357 3358 3359 Induction Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose » [Adapté de Bottin & all (2011)] Saccharose - Perspectives : - Tests de pathogénicité sur plantes - Etude du transport du saccharose par Xcc3357 et Xcc3358 - Phylogénie : origine ? avantage évolutif ? adaptation à l'environnement ?
  • 32. Discussions Transporteur saccharose (TBDR) Interaction Saccharose = saccharose- substrat de répresseur l'enzyme → induction des gènes Modèle du locus CUT fonctionnel basé sur le locus sux de Xcc [Adapté de Blanvillain & all (2007)]
  • 33. Discussions Locus Xcc0117-0122 Bilan des expérimentations : - Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de Xcc0119 - Étude de ce promoteur par dosage de l'activité βGal du mutant et du WT en milieu Glucose et PGA Activité +++ en présence de PGA Induction de l'expression de Xcc0119 en milieu PGA.
  • 34. Discussions Locus Xcc0117-0122 Bilan des expérimentations : - Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de Xcc0119 - Étude de ce promoteur par dosage de l'activité βGal du mutant et du WT en milieu Glucose et PGA Activité +++ en présence de PGA Induction de l'expression de Xcc0119 en milieu PGA. 0118 0119 0120 0121 0122 Deoxygluconate TBDR TBDR Pectin Methyl Pectate kinase Esterase Lyase Induction Locus CUT putativement impliqué dans le métabolisme de la pectine chez Xcc PGA [Adapté de Bottin & all (2011)]
  • 35. Discussions Gène Xcc3534 Bilan des expérimentations : - Construction d'un mutant d'insertion dans Xcc3534 par conjugaison triparentale et vérification par PCR/ gel d'électrophorèse Obtention de mutants.
  • 36. Discussions Gène Xcc3534 Bilan des expérimentations : - Construction d'un mutant d'insertion dans Xcc3534 par conjugaison triparentale et vérification par PCR/ gel d'électrophorèse Obtention de mutants. Suite des investigations: - Tests de croissance sur milieu Glucose et Cellulose du mutant d'insertion dans Xcc3534 - Analyse fonctionnelle des gènes voisins de Xcc3534 CorA cycA 3354 3355 (hyp) pheC Transporteurs Transporteur de Enzymes du catabolisme membranaires la membrane de la cellulose externe Gènes voisins de Xcc3354 : un locus hypothétique dédié à la cellulose
  • 37. Bilan Caractérisation en cours de trois loci CUT probables Locus sux Locus pectine Locus cellulose
  • 38. Bilan Caractérisation en cours de trois loci CUT probables Locus sux Locus pectine Locus cellulose Lien entre TBDRs et l'utilisation des molécules végétales par Xcc
  • 39. Bilan Caractérisation en cours de trois loci CUT probables Locus sux Locus pectine Locus cellulose Lien entre TBDRs et l'utilisation des molécules végétales par Xcc - Meilleure compréhension de l'adaptation plantes/MO - Moyen de lutte contre les bactéries phytopathogènes - Applications industrielles (clarification des jus de fruits, biocarburant ...)
  • 40. Remerciements Mes remerciements s'adressent à : - l'ensemble des professeurs de cette unité d'enseignement, Martine Lautier, Arnaud Bottin, Christophe Jacquet et Elisabeth Crosnier ; - à mes camarades du parcours alternatif en particulier à ma binôme, Anne-Laure Brasset; - aux préparateurs/préparatrices des salles où nos travaux pratiques ont eu lieu.
  • 41. Références bibliographiques Blanvillain S (2007) Etude des récepteurs TonB-dépendants et d'un nouvel effecteur de type III de la bactérie phytopathogène Xanthomonas campestris pv. campestris. Doctorat de microbiologie. Université Paul Sabatier. Toulouse. Blanvillain S, Meyer D, Boulanger A, Lautier M, Guynet C, Denancé N, Vasse J, Lauber E & Arlat M (2007) Plant Carbohydrate Scavenging through TonB-Dependent Receptors: A Feature Shared by Phytopathogenic and Aquatic Bacteria. PLoS One. 2(2):e244. Bottin A, Lautier M & Jacquet C (2011) Méthodes expérimentales et publication scientifique : interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène, régulation transcriptionnelle. Master MABS - UE EM7BMGEM. Université Paul Sabatier. Toulouse. Boulanger A (2007) Analyse d'un nouveau système CUT impliqué dans l'acquisition et l'utilisation du N-acétylglucosamine par Xanthomonas campestris pathovar campestris. Doctorat de microbiologie. Université Paul Sabatier. Toulouse. Brasset AL (2011) Analysis of the pathogenicity and transcriptional regulation of the pathogen Xanthomonas campestris pv. campestris. Master MABS. Université Paul Sabatier. Toulouse. NCBI (2011) Fiche Gene XCC3534 1,4-beta-cellobiosidase (ID: 1000107) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1000107
  • 42. Références des illustrations (Classées selon leur ordre d'apparition) - http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Crucifers/BlackRot_Cruc/BR_CrucFS4.jpg - http://www.omafra.gov.on.ca/IPM/images/brassica/diseases/black-rot-cabbage_zoom.jpg
  • 43. Pretseille Emmanuelle Master 1 MABS UE EM7BMGEM - Méthodes expérimentales et publication scientifique Interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoir pathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire, Xanthomonas campestris pv campestris
  • 44. Annexe 1 : Conjugaison triparentale 2 Transfert par conjugaison du promoteur du gène Xcc0119 3 Construction d'un mutant d'insertion dans le gène Xcc3534 Présentation des souches Bactérie donneuse Bactérie cible E. coli avec pVO 155 + 300b de Xcc 3534 Xcc WT (Kan R) (Rif R) Souche « helper » Plasmide vecteur E. coli avec Bactérie PRK 600 non transformable (Spectinomycine R) Plasmide « helper »
  • 45. Conjugaison triparentale Culture des souches Culture sur milieu Moka (milieu riche) Transfert du vecteur « helper » dans la souche donneuse puis Culture sur milieu Moka et ATB : conjugaison vers Xcc Rifampicine et Kanamycine Xcc avec pVO 155 + 300b de Xcc3534 (Rif R et Kan R) Sélection des clones Rif R et Kan R Xcc i3534
  • 46. 3 Annexe 2 : PCR sur colonies chez Xanthomonas 4 Référence : Chez E. coli, suspension d'une colonie dans de l'eau stérile puis ajout du mix PCR. Non applicable chez Xanthomonas ! Adaptation du protocole - Mise en suspension d'une colonie dans le l'eau stérile - Lyse des bactéries ! Tampon de lyse au PEG Obtention d'un « jus Xcc » (ADN) - Mix PCR (eau, tampon vert, dNTPs, Taq pol, oligo 1 et oligo 2) - Cycle/Programme PCR - Révélation taille du fragment obtenu → électrophorèse sur gel
  • 47. http://www.sesep.uvsq.fr/formation/PCR4.jpg PCR sur Xcc Vitesse GoTaq : 1 min/ kb Schéma bilan de la PCR
  • 48. Annexe 3 : Analyse de gel d'électrophorèse 3 Electrophorèse sur gel d'agarose des PCRs réalisées sur Xcc WT pl750 et Xcc pl 750 + prom 119 4 Electrophorèse sur gel d'agarose des PCRs réalisées sur Xcc WT pVO155 et Xcc pVO155 + Xcc3534 (= mutant d'insertion) DNA Clones testés ladder (en pb) 10000 8000 6000 Fragment d'intérêt à 1kb 5000 4000 3000 2500 PCR ayant amplifiée le promoteur du 2000 gène Xcc0119 de 1kb 1500 → taille correspondante 1000 750 500 Validation des clones obtenus
  • 49. Pretseille Emmanuelle Master 1 MABS UE EM7BMGEM - Méthodes expérimentales et publication scientifique Interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoir pathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire, Xanthomonas campestris pv campestris