Dépistages toxicologiques - Tout savoir sur les tests

1. François Parant Pharmacien - Biologiste Médical Praticien Hospitalier francois.parant@chu-lyon.fr Tout savoir sur les tests Dépistages toxicologiques M2 de Biochimie et Biologie Moléculaire Module Bioessais, bioréactifs, biodiagnostics et bioprocédés Université Lyon 1 octobre 22

2. Introduction Les fondamentaux en toxicologie Dépistage de la consommation de DROGUES Dépistage de la consommation d’ALCOOL 2

3. Introduction Les fondamentaux en toxicologie Un XÉNOBIOTIQUE (du grec xenos « étranger » et bios « vie ») est une substance présente dans un organisme vivant mais qui lui est étrangère Médicaments  Quelques exemples de xénobiotiques Bénéfiques pour la santé Polluants atmosphériques Contaminants alimentaires (pesticides, colorants, …) Produits chimiques industriels Poisons naturels (mycotoxines, …) Nocifs pour la santé Les xénobiotiques Drogues 3

4. Introduction Les fondamentaux en toxicologie Un XÉNOBIOTIQUE (du grec xenos « étranger » et bios « vie ») est une substance présente dans un organisme vivant mais qui lui est étrangère Médicaments  Quelques exemples de xénobiotiques Bénéfiques pour la santé Nocifs pour la santé Les xénobiotiques Drogues Pharmacologie Toxicologie Usages détournés de médicaments Morphiniques 4

5. 5  La toxicocinétique est l’étude des EFFETS DE L’ORGANISME sur un xénobiotique toxique Introduction Les fondamentaux en toxicologie Toxicocinétique 5  Différentes phases : o Absorption o Distribution o Métabolisme o Excrétion du toxique (ADME) La toxicocinétique étudie le devenir des produits toxiques dans l'organisme juste après l'exposition : les produits chimiques qui pénètrent dans le corps par les différentes voies respiratoire, cutanée, digestive sont distribués dans l'organisme par voie sanguine avant d'être transformés éventuellement par métabolisation sous l'effet de l'action d'organes tels le foie ou les reins puis excrétés par voie urinaire ou fécale, ou parfois accumulés dans les tissus et le lait maternel.

6. Introduction Les fondamentaux en toxicologie 6 Toxicocinétique Absorption Distribution Métabolisme Excrétion Accumulation Exposition Comment le xénobiotique est assimilé, transformé et éliminé par l’organisme Toxicodynamie et mécanismes d’action Organes ou tissus cibles Cellules ou molécules cibles (récepteur, ADN, …) Effets nocifs Comment le xénobiotique agit sur l’organisme Toxicocinétique Toxicodynamie versus

7. Injectées : héroïne, cathinones, crack… Introduction Pharmacocinétique des drogues 7 Drogues o Absorption o Distribution o Métabolisme o Excrétion Lorsque les drogues sont injectées, leurs effets peuvent survenir plus rapidement, plus intensément ou les deux Avalées : comprimés d’ecstasy, cannabis ingéré (space cake), … Snifées : cocaïne, … Fumées : cannabis, crack (cocaïne base), …

8. Introduction Pharmacocinétique des drogues 8 o Absorption o Distribution o Métabolisme o Excrétion Toxicodynamie Les drogues vont • perturber la transmission entre les neurones • interférer avec le circuit de la récompense Toxicocinétique Les drogues traversent la barrière hémato-encéphalique CERVEAU Accumulation Tétrahydocannabinol (THC)  molécule très lipophile  s’accumule dans les graisses Tissus ADIPEUX SALIVE CHEVEUX SUEUR SANG

9. Introduction 9 o Absorption o Distribution o Métabolisme o Excrétion Métabolisme du delta-9-THC C H3 O C H3 OH CH3 d -9-trans-tétrahydrocannabinol (THC) Actif Dérivés glucuroconjugués C H3 O C H3 OH CH3 Cannabinol C H3 O C H3 OH CH2OH 11-hydroxy-d -9-THC (11 OH THC) Actif Acide 11-nor-d-9-THC-carboxylique (THC COOH) C H3 O C H3 OH COOH Principal métabolite urinaire du THC

10. Introduction 10 o Absorption o Distribution o Métabolisme o Excrétion Métabolisme de la cocaïne Principal métabolite urinaire de la cocaïne

11. Introduction 11 o Absorption o Distribution o Métabolisme o Excrétion Métabolisme des opiacés - Le métabolisme des opiacés naturels ou hémisynthétiques s’organise autour de la morphine - Tous les dérivés de la morphine estérifiés en 3 (héroïne, codéïne, codéthyline, pholcodine) sont désalkylés. La vitesse et l’intensité de cette réaction sont variables en fonction de la molécule envisagée. Drogue Médicament Médicament Médicament Médicament Drogue

12. Introduction 12 o Absorption o Distribution o Métabolisme o Excrétion Métabolisme des opiacés En conséquence, Si présence d’opiacés dans une matrice biologique (sang, urines, salive, cheveux, …) … se poser la question : prise licite ou illicite ?

13. Introduction Pharmacocinétique des drogues 13 o Absorption o Distribution o Métabolisme o Excrétion Métabolites principalement éliminés par les URINES

14. Introduction Les fondamentaux en toxicologie Dépistage de la consommation de DROGUES Dépistage de la consommation d’ALCOOL 14

15. 15 Dépistage de la consommation de DROGUES - Pourquoi réaliser un dépistage de drogues ? - Techniques de dépistage urinaire - Passer à travers le dépistage - Matrices alternatives - Pourquoi réaliser un dépistage de drogues ? - Techniques de dépistage urinaire - Passer à travers le dépistage - Matrices alternatives

16. Pourquoi réaliser un dépistage de drogues ? Dopage Médecine du travail (Postes à risque) Substitution (Centre de Soins, d’Accompagnement et de Prévention en Addictologie) Affaires criminelles (Trafic – Homicides – Soumission chimique) Sécurité routière Psychiatrie Toxicologie d’urgence (Overdoses – Suicides…) Assurances 16

17. 17 http://www.bandolier.org.uk/bandopubs/cannfly/cannfly.html  Simulateur de vol Médecine du travail (Postes à risque)

18. 18 Prise de drogues ? Analyses toxicologiques Contexte • Soit dépistage seul • Soit dépistage puis confirmation si positif (chromatographie) • Soit techniques chromatographiques seules Du prélèvement à l’interprétation Interprétation Prélèvements Sang (plasma, sérum, sang total) Urines Salive, … Contexte

19. 19 Dépistage de la consommation de DROGUES - Pourquoi réaliser un dépistage de drogues ? - Techniques de dépistage urinaire - Passer à travers le dépistage - Matrices alternatives

20. 20 Techniques de dépistage URINAIRE Idéalement Simple Rapide Peu coûteux Sensible Spécifique Matrices Urines Salive Sueur Cheveux Méconium « Dépister : se mettre sur la piste » Tests immunologiques - Réaction antigène (drogue) – anticorps - Révélation par une « coloration » (kit unitaire) ou une lecteur photométrique (analyseur)

21. Tests en conditionnement unitaire (bandelettes - « savonnettes » - cassettes) • Simple (ne requière pas de compétences particulières) • Rapide (quelques minutes) • Relativement coûteux 21  Dépistage d’une seule drogue par cassette  Dépistage simultané de plusieurs drogues Dépistage urinaire Techniques de dépistage URINAIRE C = Control T = Test

22. À titre d’exemple : Gamme TOX/See® de Bio-Rad 22 Dépistage urinaire Techniques de dépistage URINAIRE

23. 23 Integrated E-Z Split Key Cup Flacon de recueil des urines + Savonnette multi-drogues Dépistage urinaire  Systèmes compacts (recueil d’urines + dépistages) Techniques de dépistage URINAIRE

24. Le principe de ces tests unitaires Immunochromatographie (Lateral flow test, ou LFT, en anglais) 24 Dépistage urinaire Tests de grossesse (HCG) Nombreuses applications dans différentes matrices (sang, urines, …) Etc. Drogues VIH COVID-19 Hépatite C Techniques de dépistage URINAIRE Dispositifs Médicaux de Diagnostic In Vitro (DMDIV) destinés à être réalisé • par un professionnel de santé : TROD (tests rapides d’orientation diagnostique) • Par le public : Autotests

25. 25 Techniques de dépistage URINAIRE Le principe de ces tests unitaires Immunochromatographie (Lateral flow test, ou LFT, en anglais) Dépistage urinaire Comment ça fonctionne ? Analytes de grande taille, plusieurs épitopes possibles Exemple : HCG Analytes de petite taille, un seul épitope Exemple : morphine Essais sandwichs Essais compétitifs

26. Le principe de ces tests unitaires Immunochromatographie (Lateral flow test, ou LFT, en anglais) 26 Dépistage urinaire Techniques de dépistage URINAIRE Essais sandwichs Les tests sandwichs sont généralement utilisés pour les analytes de grande taille (car nécessite deux épitopes). Lorsque l'échantillon migre dans le test, il rencontre d'abord un conjugué, qui est un anticorps spécifique à l'analyte cible marqué avec un marqueur visuel, généralement de l'or colloïdal. Les anticorps se lient à l'analyte cible dans l'échantillon et migrent ensemble jusqu'à ce qu'ils atteignent la ligne de test. La ligne de test contient également des anticorps immobilisés spécifiques à l'analyte cible, qui se lient au complexe analyte-conjugués qui ont migré. La ligne de test présente alors un changement visuel dû à la concentration du marqueur visuel, confirmant ainsi la présence des molécules cibles. La majorité des tests sandwichs ont également une ligne de contrôle qui apparaît, que l'analyte cible soit présent ou non, afin de garantir le bon fonctionnement du tampon à flux latéral. Positif Négatif

27. Le principe de ces tests unitaires Immunochromatographie (Lateral flow test, ou LFT, en anglais) 27 Dépistage urinaire Techniques de dépistage URINAIRE Les tests compétitifs sont généralement utilisés pour les analytes de petite taille (un seul épitope est nécessaire). L'échantillon rencontre d'abord des anticorps dirigés contre l'analyte cible marqué par un marqueur visuel (particules colorées). La ligne de test contient l'analyte cible fixé à la surface. Lorsque l'analyte cible est absent de l'échantillon, les anticorps non liés se lieront à ces molécules d'analyte fixées, ce qui signifie qu'un marqueur visuel apparaîtra. Inversement, lorsque l'analyte cible est présent dans l'échantillon, il se lie aux anticorps pour les empêcher de se lier à l'analyte fixe dans la ligne de test, et donc aucun marqueur visuel n'apparaît. Cette méthode diffère des tests sandwichs en ce sens que l'absence de bande signifie que l'analyte est présent. Essais compétitifs Positif Négatif

28. Tests sur analyseurs Cadences élevées Le système ARCHITECT c16000 permet d'effectuer jusqu'à 1800 tests par heure 28 Dépistage urinaire Techniques de dépistage URINAIRE Cobas® 6000 (Roche) Différents automates multiparamétriques ARCHITECT ® c16000 (Abbott) Quelques exemples

29. Tests sur analyseurs 29 Dépistage urinaire Techniques de dépistage URINAIRE COBAS 6000 e601

30. Tests sur analyseurs 30 Dépistage urinaire Techniques de dépistage URINAIRE Automatisation du plateau technique • du tri pré-analytique, • de la centrifugation, • de l’aliquotage, etc.

31. EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay) KIMS (Kinetic Interaction of Microparticles in Solution) …. Si le principe des réactions est parfois complexe, au laboratoire, ces dépistages sont relativement simples à mettre en œuvre 31 Dépistage urinaire Techniques de dépistage URINAIRE Différentes architectures d’immunoanalyse Tests sur analyseurs Immunoanalyses en phase homogène • avec marqueur enzymatique (EMIT, CEDIA) • … ou sans marqueur enzymatique (KIMS)

32. Schneider, R. S. et al., Homogeneous enzyme immunoassay for opiates in urine. Clin. Chem. 19, 821 (1973) EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) Drogue - G6PD* (enzyme) (Réactif R1) 1/ Cas d’un échantillon SANS drogue * G6PD = Glucose-6-phosphate déshydrogènase Anticorps anti-drogue (Réactif R2) Inhibition de l’activité enzymatique 32 Techniques de dépistage URINAIRE Tests sur analyseurs

33. Anticorps anti-drogue (Réactif R2) Compétition Drogue - G6PD* (enzyme) (Réactif R1) Drogue (échantillon) Inhibition de l’activité enzymatique Addition du substrat (G6P** / NAD***) et lecture à 340 nm 2/ Cas d’un échantillon AVEC drogue Schneider, R. S. et al., Homogeneous enzyme immunoassay for opiates in urine. Clin. Chem. 19, 821 (1973) EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) * G6PD = Glucose-6-phosphate déshydrogènase ** G6P = Glucose-6-phosphate *** NAD = Nicotinamide Adénine Dinucléotide NAD -> NADH, H+ 33 Techniques de dépistage URINAIRE Tests sur analyseurs

34. Henderson DR, et al. CEDIA, a new homogeneous immunoassay system. Clin Chem. 1986 Sep;32(9):1637-41. CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay) b-galactosidase scindée par génie génétique en deux polypeptides (Enzyme Donor et Acceptor) 1 fragment Enzyme Donor (ED) et 1 fragment Enzyme Acceptor (EA) se réassocient spontanément (en réalité, il s’agit de 4 fragments ED + 4 fragments EA qui se réassocient) + La fixation d’une molécule de drogue sur ED ne gène pas la complémentation + Absence de drogue dans les urines Présence de drogue dans les urines Mélange réactionnel : réactif 1 (EA + anticorps anti-drogue) + réactif 2 (Drogue fixée à ED) + urines La fixation de l’anticorps anti- drogue sur la drogue fixée à ED gène la complémentation 34 Techniques de dépistage URINAIRE Tests sur analyseurs

35. Anticorps fixés à des microparticules Drogues fixées sur un support « multivalences » Agrégation Drogues présentes dans l’échantillon Inhibition d’agrégation KIMS (Kinetic Interaction of Microparticles in Solution) OnLine Gener. II 35 Techniques de dépistage URINAIRES Tests sur analyseurs

36. Biopuces Système de la société Randox : Biochip Array Technology® Biopuce 9 mm2 Dépistage de 10 stupéfiants et 1 test de dilution (créatinine) sur une seule biopuce Cassettes de 9 biopuces 36 Techniques de dépistage URINAIRES Tests sur analyseurs

37. Cadence très élevée 180 patients x 10 tests / heures Caméra CCD (Couple Charged Device ou Dispositif à Transfert de Charge) Révélation par chimiluminescence Immunodosage par compétition 37 Techniques de dépistage URINAIRES

38. • sont exprimés de façon qualitative (positif ou négatif) • par rapport au seuil de positivité (cut-off ) prédéfini Les résultats 38 Techniques de dépistage URINAIRES Dépistage urinaire Pourquoi ? Dans les urines : - mélange de molécule mère et de différents métabolites - … en concentrations variables d’une personne à l’autre - …et qui présentent des pourcentages de croisement très différents vis-à-vis de l’anticorps  quantification ou semi- quantification impossible ! ex. Pourcentages de croisement des anticorps anti-opiacés CEDIA Microgenics :  morphine 100 %  codéïne 125 %  morphine-3-glucuronide 81 %  morphine-6-glucuronide 47 %

39. Accidents de la voie publique (1) 50 µg/L 300 µg/L 300 µg/L 1000 µg/L Drogues Cannabis Opiacés Cocaïne Amphéta- miniques Molécule recherchée THC-COOH Morphine Benzoyl- ecgonine d- méthamphe- tamine 1 Arrêté du 5 septembre 2001 fixant les modalités du dépistage urinaire des stupéfiants et des analyses et examens prévus par le décret n° 2001-751 du 27 août 2001 relatif à la recherche de stupéfiants pratiquée sur les conducteurs impliqués dans un accident mortel de la circulation routière 39 Techniques de dépistage URINAIRES Les résultats Les seuils de positivité pour les dépistages urinaires

40. Fenêtres de détection 40 Techniques de dépistage URINAIRES Dépistage urinaire La fenêtre de détection dépend du Cut-off retenu

41. Seuil de positivité Fenêtre de détection (moyenne) Cocaïne 300 µg/L 2-3 jours Opiacés 300 µg/L 2 jours (héroïne) 15 jours (pholcodine) Amphétamines 1000 µg/L 3 jours Cannabis 50 µg/L 2-4 jours (fumeur occasionnel) Plusieurs semaines (fumeur régulier) 41 Techniques de dépistage URINAIRES Dépistage urinaire La fenêtre de détection dépend de la fréquence et de la quantité des drogues consommées Fenêtres de détection

42. Sensibilité et spécificité Technique chromatographiques Confirmation Vrais positifs Identification et quantification de la drogue Faux positifs Éventuellement identification de la substance interférente (intérêt scientifique) Techniques immunologiques Dépistage Positifs Négatifs Présumés positifs Faux positifs Faux négatifs Seuil de positivité 42 Techniques de dépistage URINAIRES

43. Faux positifs Molécules impliquées * Cocaïne Très rares // Opiacés Rares Ofloxacine (CEDIA, EMIT, KIMS) Rifampicine (Syva RapidTest ; KIMS) Cannabis Rares Efavirenz-SUSTIVA® (CEDIA) Morniflumate-NIFLURIL suppo® (TRIAGE 8) Amphétamines Fréquents Nombreuses * Seuls certains réactifs peuvent être sensibles à une molécule interférente ** ** Très variable d’une trousse à l’autre 43 Techniques de dépistage URINAIRES Sensibilité et spécificité Fréquences des faux positifs ?

44. Techniques de confirmation 44 Chromatographie couplée à la spectrométrie de masse Chromatographie GAZEUSE • couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) • ou spectrométrie de masse tandem (GC-MS/MS) Chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) - Méthodes de référence - Identification « absolue » et quantification - Méthode relativement laborieuse Les méthodes par GC associent une hydrolyse des glucuronides, une extraction et une dérivation (la dérivation permettant de rendre les substances volatiles pour la GC) Chromatographie LIQUIDE • couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) • ou spectrométrie de masse haute résolution (LC-HR-MS) Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC- MS/MS)

45. 45

46. 46 Dépistage de la consommation de DROGUES - Pourquoi réaliser un dépistage de drogues ? - Techniques de dépistages urinaires - Passer à travers le dépistage - Matrices alternatives

47. Passer à travers les tests de dépistage – Substitution – Dilution – Adultération des urines

48. Passer à travers les tests de dépistage Substitution • Systèmes utilisés - Réservoirs dissimulés - Urines lyophilisées achetées sur Internet • Substitution des urines « positives » - par des urines « propres » humaine ou animale - par un autre liquide d’aspect similaires aux urines Le kit complet 48

49. Les parades • Doser la créatinine urinaire Créatininurie < 20 mg/L (0,2 mmol/L)  ce ne sont pas des urines • Contrôler « visuellement » l’émission des urines • Contrôler la température des urines La consommation d’une bière bien fraîche ne rafraîchie pas les urines !! 49 Passer à travers les tests de dépistage

50. Dilution • Dilution « ex vivo » Par rajout d’eau aux urines • Dilution « in vivo » Par absorption d’un liquide (eau, tisane, boissons « détoxifiantes ») en grande quantité dans les heures précédents le recueil urinaire  Augmentation de la diurèse  dilution du stupéfiant 50 Passer à travers les tests de dépistage

51. • Mesurer la densité urinaire Si densité urinaire < 1.003  les urines sont diluées • Doser la créatinine urinaire Créatininurie < 200 mg/L (2 mmol/L)  les urines sont diluées • Pas d’eau chaude disponible dans les sanitaires – ajout d’un colorant à l’eau froide 51 Passer à travers les tests de dépistage Les parades

52. 1000 1005 1010 1015 1020 1025 -100 -50 0 50 100 150 200 Densité Temps (min) Consommation d’1 L d’eau 52 Passer à travers les tests de dépistage

53. Adultération Ajout d’une substance dans l’urine émise • bases ou acides • oxydants (nitrites, javel, chlorochromate de pyridinium) • glutaraldéhyde • savon, chlorures de sodium, etc. … Ingestion d’une substance médicamenteuse, chimique ou naturelle :  qui modifie les caractéristiques physico-chimiques de l'urine pour perturber les tests de dépistage (ex : les modificateurs de pH)  ou qui réduit les concentrations urinaires du stupéfiant (ex : probénécide) 53 Passer à travers les tests de dépistage Adultération « in vivo » Adultération « in vitro »

54. • Les adultérants disponibles sur Internet Chlorochromate de pyridinium Glutaraldéhyde ( liaison aux protéines) 54 Passer à travers les tests de dépistage

55. Cas de l’eau de Javel • Oxydant très efficace + + + Oxydation des drogues (les confirmations par GC/MS sont également perturbées) Oxydation du NADH H+ en NAD → technique EMIT très sensible • Altération du pH de l’urine Altération de la liaison antigène (drogue) / anticorps des tests immunologiques Modification de la solubilité des drogues 55 Passer à travers les tests de dépistage

56. • Effet de l’eau de Javel sur les dépistages en EMIT 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 THC AMP BE OP CONTRÔLE 25% 50% Urines non adultérées Urines + 25 % eau de Javel Urines + 50 % eau de Javel % d’urines positives Cannabis Amphét. Cocaïne Opiacés 56 Passer à travers les tests de dépistage

57. L’ajout d’un adultérant peut avoir l’effet inverse de celui recherché !! La javel ou le glutaraldéhyde « positivent » les dépistages réalisés en KIMS Online 2 57 Passer à travers les tests de dépistage

58. • Rechercher la présence d’oxydants • Possibilité de réaliser une recherche spécifique de Javel et de Nitrites Nitrites > 500 mg/L  adultération, En cas d’infection urinaire, présence de nitrites < 500 mg/L • Rechercher le glutaraldéhyde • Mesurer le pH urinaire si pH < 3 ou pH > 11  adultération • Mesurer la densité urinaire si densité urinaire > 1.035  ajout de NaCl (?) 58 Passer à travers les tests de dépistage Les parades

59. 59 Dépistage de la consommation de DROGUES - Pourquoi réaliser un dépistage de drogues ? - Techniques de dépistages urinaires - Passer à travers le dépistage - Matrices alternatives

60. Matrices alternatives (Salive – Sueur - Cheveux…) 60

61. La salive • Les xénobiotiques sont transférés du sang vers la salive ( mécanismes de sécrétion – réabsorption) • Trois glandes salivaires principales (parotides, sublinguales et sous-maxillaires) Matrices alternatives Bouchon Tampon Support Tube pour centrifugation Recueille de la salive par centrifugation de la salivette • Plusieurs modes de recueil possible : - crachat - « salivettes » (tampon absorbant) - frottement d’un « coton tige » 61

62. 62 Matrices alternatives Salivette

63. Garder l’écouvillon en bouche 2 à 5 minutes Système type « coton tige » : Intercept Oral Fluid Drug Test® 63 Matrices alternatives En France, la mise en évidence d’une consommation de stupéfiants chez les conducteurs repose sur la réalisation d’un test de dépistage salivaire sur écouvillon nylon Floqswab® Écouvillon

64. Bonne corrélation entre concentrations sanguines et concentrations salivaires Rappels Un dépistage de stupéfiants positif enclenche une confirmation par chromatographie (soit par prélèvement sanguin, soit sur la salive) Seule la présence de drogue dans le sang permet d’affirmer que l’individu est sous influence Intérêt pour les dépistages réalisés dans le cadre de la sécurité routière Positivité sang Positivité salive Positivité urines temps Individu sous influence 64 Le décret n° 2016-1152 du 24 août 2016 (3) et l’arrêté du 13 décembre 2016 (4) fixent les modalités du dépistage, des analyses et des examens témoignant de l’usage de substances ou plantes classées comme stupéfiants prévus par le code de la route. Le législateur a choisi de sanctionner l’usage de stupéfiant, et non pas une conduite sous l’influence de stupéfiant. Matrices alternatives Le prélèvement peut être effectué : • sans atteinte à l’intimité ( dépistage « au bord de la route ») • sous contrôle du personnel médical ou des forces de l’ordre ( peu de risques de substitution ou d’adultération) Avantages des dépistages salivaires

65. Rappel : les dépistages urinaires utilisent des anticorps anti-métabolites qui reconnaissent mal les molécules mères • Exemple 1 : l’anticorps utilisé pour le dépistage urinaire de la cocaïne à 10 fois moins d’affinité pour la cocaïne que pour la benzoylecgonine (principal métabolite urinaire de la cocaïne) • Exemple 2 : l’anticorps utilisé pour le dépistage urinaire du cannabis à 100 fois moins d’affinité pour le THC que pour le THC-COOH (principal métabolite urinaire du THC) 65 Matrices alternatives Inconvénients des dépistages salivaires 1/ Dans la salive, les stupéfiants sont retrouvés essentiellement sous forme non-métabolisée  Il faut donc développer des kits dédiés à la matrice salivaire avec des anticorps dirigés contre les molécules mères

66. Seuils salivaires proposés : - amphétamines 160 µg/L - THC 4 µg/L - cocaïne 20 µg/L - morphine 40 µg/L • Les kits de 1ère génération (RapiScan®, Drugwipe®, SalivaScreen® et OralLab®) manquaient de sensibilité +++ vis-à-vis du cannabis !! Walsh et al., J Anal Toxicol. 2003 • Amélioration des performances avec les kits de 2ème génération (Cozart DDSV®)  seuil de positivité ≈ 15 µg/L de THC  fenêtre de détection d’ ≈ 2-3h Kintz et al., Ther Drug Monit. 2009 66 Matrices alternatives Inconvénients des dépistages salivaires 2/ Les kits doivent être très sensibles - les concentrations salivaires sont souvent beaucoup plus basses que les concentrations urinaires

67.  Les kits les plus récents semblent atteindre le seuil de 4 µg/L ! 67 Matrices alternatives

68. La sueur L’excrétion des xénobiotiques par la sueur est connue depuis 1911 (Tachau H. et al) On retrouve principalement les formes non-métabolisées • Le patch peut être porté de 1 à 10 jours • La membrane collante n’est adhésive qu’une seule fois (le retrait temporaire du patch pour masquer une consommation illicite est impossible) Recueil de la sueur par le patch PharmChem® • Les composants liquides de la sueur sont captés par une membrane absorbante recouverte d’un film protecteur. Seuls peuvent diffuser à travers ce film l’eau et le CO2 68 Matrices alternatives

69. Applications : Permissions de WE des détenus (Les permissions de WE des détenus en maison d’arrêt sont conditionnées par l’abstinence vis-à-vis des stupéfiants) Avantage du patch PharmChem® par rapport aux tests urinaires Contrairement aux tests urinaires, ce test à la sueur permet d’identifier le lundi matin une prise de substances illicites le vendredi soir 69 Matrices alternatives

70. Le kit Drugwipe® (test préconisé pour la sueur et la salive) Application potentielle : dépistage des drogues illicites au bord de la route par les forces de l’ordre Mais ce test ne donne pas satisfaction car : - La sueur est exposée à une contamination par l'environnement  risques de faux positifs - La persistance des stupéfiants dans ce milieu est entièrement dépendante du moment du dernier lavage  risques de faux négatifs - Le THC excrété dans la sueur est en très faible quantité en raison d'un pKa peu favorable  Cannabis très mal détecté Recueil par simple essuyage du front 70 Matrices alternatives

71. Méconium • Le méconium concentre les xénobiotiques issus de l’exposition maternelle  historique de l’exposition fœtal (recherche des opiacés, cocaïne, nicotine …) • 1ères matières fécales du nouveau-né évacuée dans les 4 jours qui suivent la naissance (généralement dans les 24ères heures de vie) Humeur vitrée (ou vitré) Le dosage de l’éthanol dans l’humeur vitrée est particulièrement utile en médecine légale : • Le rapport éthanol dans le vitré (EV) sur l’éthanol dans le sang (ES) permet de préciser si le décès est survenu pendant la phase d’absorption (EV/ES <1) ou en phase d’élimination (EV/ES >1) • L’éthanol dans le vitré n’a pas d’origines exogènes (la sclérotique protège des infiltrations bactériennes)  Intérêt si cadavres putréfiés 71 Matrices alternatives

72. Les cheveux • Les cheveux se développent puis chutent de façon individuelle selon trois phases : - Phase de croissance (anagène) - Phase de transition - Phase de repos et chute (télogène) • À un instant donné, environ 80 % des cheveux sont en phase anagène et poussent de 0,7 à 1,5 cm/mois - Diffusion interne du sang vers les cellules en croissance des bulbes pileux - Diffusion externe à partir des sécrétions sudorales et sébacées Incorporation des xénobiotiques dans les cheveux 72 Matrices alternatives

73. Le problème des substances déposées sur les cheveux par voie passive (fumées, etc.) Applications - L’analyse segmentaire des cheveux permet de réaliser un « historique » de la consommation Marqueur d’exposition chronique Techniques CG/MS ou LC/MS ou LC/MS-MS Exemple : analyses segmentaires de cheveux chez un ancien héroïnomane substitué par de la buprénorphine (N.B. la 6-acétylmorphine est un métabolite de l’héroïne) Racine Mèche 73 Matrices alternatives - Déposées sur la cuticule, elles sont moins bien liées à la matrice et peuvent être éliminées par une procédure de décontamination - L’identification dans le cheveux de métabolites prouve une consommation (Ex : identification THC-COOH pour une consommation de cannabis) Les parades

74. Applications anecdotiques - De la cocaïne et son principal métabolite, la benzoylecgonine, ont été retrouvées dans des cheveux de momies péruviennes - Des concentrations anormalement élevée d’arsenic ont été retrouvées dans des cheveux de Napoléon Ier prélevés à l’île de Ste Hélène Adultération des cheveux ? Problèmes des soins cosmétiques Coloration Décolorations Permanentes 74 Matrices alternatives

75. Fenêtre de détection des différentes matrices N.B. Fenêtre de détection dans le sang ≈ celle de la salive 75 Matrices alternatives

76. Dépistage de la consommation de DROGUES Dépistage de la consommation d’ALCOOL 76 Introduction Les fondamentaux en toxicologie

77. 77 ÉTHANOL Intoxication aiguë Intoxication chronique Ivresse Éthylisme Marqueurs de l’éthylisme o Éthanolémie o Éthanol dans l’air expiré Marqueurs non spécifiques : transferrine désialylée (carbohydrate-deficient transferrine – CDT), la gamma- glutamyl transférase (GGT), Volume globulaire moyen (VGM), … Nouveaux marqueurs : l’éthylglucuronide (EtG) et le phosphatidyléthanol (PEth), …

78. 78 • Grande variabilité inter-individuelle aux effets toxiques de l’éthanol Intoxications aiguës  ivresse Alcoolémie de l’ordre de 1 g/L Phase d’EXCITATION psychomotrice : désinhibition avec euphorie, loquacité et incoordination motrice  Ébriété Alcoolémie de l’ordre de 2 g/L Phase de DÉPRESSION psychomotrice : diminution importante des réflexes, des facultés de perception et d’attention Vasodilatation périphérique et ischémie cérébrale  Soûlerie Symptomatologie Signes biologiques associés :  Acidose respiratoire / acidose métabolique avec hyperlactatémie  Hyperkaliémie / hypoglycémie N.B. les hypoglycémies s’observent surtout chez l’enfant et chez l’adulte dénutri à jeun et sont responsables de convulsions et d’encéphalopathies Installation progressive d’un COMA ÉTHYLIQUE qui peut être mortel ! Alcoolémie supérieure à 3 g/L  « Ivre-mort » - Hypothermie - Hypotension - Hypotonie musculaire - Dépression respiratoire  pneumopathie d’inhalation

79. 79 F. Parant - Laboratoire de Pharmacologie - Toxicologie. Centre de Biologie Sud. Lyon (oct.-22) Métabolisme de l’éthanol C H3 C H2 OH C H3 C H O C H3 COOH C H3 COSCoA C H3 C H2 OH C H3 COOH Oxydation de l'éthanol en acétaldéhyde NAD+ NADH H+ Alcool déshydrogénase (ADH) Ethanol Acétaldéhyde Oxydation de l'acétaldéhyde en acétate NAD+ NADH H+ Acétaldéhyde déshydrogénase (ALDH) Acétate ATP AMP +PPi CoA-SH Thiokinase Cycle de Krebs Ethanol Hépatocyte (foie) Acétate L'essentiel de l'acétate est exporté vers les tissus extra-hépatiques Acétyl -CoA H2O - Seul 2 à 10 % de l’éthanol est éliminé non métabolisé par les voies pulmonaire, urinaire et sudorale - L’éthanol subit un important métabolisme oxydatif hépatique

80. 80 L’éthanol dans l’air expiré Éthylotests Éthylomètres Loi de HENRY

81. 81 Loi de Henry Rapport constant de 1 / 2000 entre les concentrations d’alcool dans l’air alvéolaire et dans le sang

82. 82 DOSAGE de l’éthanol dans l’air expiré Éthylomètres 679 T et 679 E • Homologué et scellé par le ministère de l’industrie, apporte la preuve de la conduite en état d’ivresse au même titre que l’alcoolémie • Basée sur la spectrométrie infrarouge : absorption par l’éthanol d’une radiation infrarouge spécifique (≈ 9,4 µm) • La quantité d’alcool dans l’air expiré est quantifié par la loi de Beer-Lambert Log ( I / I0 ) = -K . C . L Avec : I0 = intensité de lumière reçue en l’absence d’éthanol I = intensité de lumière reçue en présence d’éthanol K = coefficient d’extinction moléculaire C = concentration d’éthanol dans l’air expiré L = trajet optique Éthylomètre 679 E

83. 83 DÉPISTAGE de l’alcool dans l’air expiré Deux types d’éthylotests : - éthylotests à affichage électronique (type A) - éthylotests chimiques « ballons » (type B) Le ballon mesure le volume d'air. Dans le tube, une ampoule contient un mélange d'acide sulfurique et de bichromate de potassium sur gel de silice de couleur jaune. En présence d’alcool  réduction du bichromate de potassium qui vire au vert sur une longueur proportionnelle à la quantité d'alcool contenu dans l'air. Si le niveau marqué est dépassé (marge d'erreur 15 %) ; une prise de sang déterminera l'alcoolémie précise. NB: La chaleur nécessaire à la réaction est produite par réaction de la vapeur d’eau présente dans l’air expiré sur l’acide sulfurique Alcoolémie à 0 mg par litre d'air expiré. Alcoolémie inférieure à 0,25 mg par litre d'air expiré. Alcoolémie supérieure à 0,25 mg par litre d'air expiré. Éthylotests

84. 84 Éthylotests à affichage électronique On immerge 2 électrodes de platine dans un bain d’acide sulfurique. Il se crée une oxydation de l’alcool qui convertit l’éthanol C2H5- OH en acide acétique CH3-COOH. Cela produit un nombre d’électrons proportionnel aux molécules d’alcool créant ainsi un courant électrique entre les électrodes. Le courant généré est évalué par un microprocesseur et converti en mesure proportionnelle sur l'indicateur. Cette mesure reste moins précise et moins fiable que celle utilisant la technologie par infrarouge. Elle permet néanmoins de développer des produits mobiles et transportables. Cellules électrochimiques (Fuel Cell) When the user exhales into a breathalyzer, any ethanol present in their breath is oxidized to acetic acid at the anode: CH3CH2OH(g) + H2O(l) → CH3CO2H(l) + 4H+(aq) + 4e- At the cathode, atmospheric oxygen is reduced: O2(g) + 4H+(aq) + 4e- → 2H2O(l) The overall reaction is the oxidation of ethanol to acetic acid and water. CH3CH2OH(l) + O2(g) → CH3COOH(l) + H2O(l) = principe d’une pile DÉPISTAGE de l’alcool dans l’air expiré Éthylotests

85. 85 Éthylotests à affichage électronique On élève à haute température un fil chauffant se trouvant dans l'élément sensible. Une couche d'oxyde d'étain génère alors des électrons à la surface du semi conducteur. Les molécules d'alcool absorbent alors les électrons provoquant une modification de la résistivité. Cette mesure est proportionnelle à la quantité d'alcool présent dans l'échantillon à analyser. Elle reste néanmoins peu précise convenant à une application de dépistage (éthylotest) grâce à des faibles coûts de revient.. Semi conducteur DÉPISTAGE de l’alcool dans l’air expiré Éthylotests

86. 86 Éthylotests anti-démarrage DÉPISTAGE de l’alcool dans l’air expiré

87. FIN 87

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