Caractérisation des microparticules, des
mitochondries libres et des mito-MPs produites par
des cellules d’adénocarcinome ...
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1. INTRODUCTION
Microvésicules de RCC et immunomodulation
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Objectifs généraux
1.  Caractériser les microparticules produites par les cellules
d’adénocarcinome rénal (RCC)
2.  Caract...
Cancer du rein
Introduction
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RCC
Renal Cell Carcinoma ou adénocarcinome rénal
•  Cancer du rein le plus fréquent (~90%)
•  Causé par une mutation du gè...
RCC
25 à 30 % des patients diagnostiqués avec le RCC
présentent déjà des métastases.

Le taux de survie à 5 ans pour le mR...
The new england journal of medicine
Figure 1. Staging Overview and Five-Year Survival Rates for Renal Cancer.
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medical progress
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Lignée cellulaire 786-O
•  Cellules de RCC immortalisées
•  Mutées au gène du VHL
•  Vendues par ATCC
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786-O, 10 décemb...
Cancer et système immunitaire
Introduction
12
Rôle des macrophages
doi:10.1038/nri3073
13
Polarisation des macrophages
14
Rôle des macrophages dans l’inflammation
15	
doi:10.1038/ni.1937
Vésicules extracellulaires
Introduction
16
by conveying information between tumour cells and between tumour and
neighbouring cells
■ High levels of circulating proco...
Nomenclature
Vésicules extracellulaires (EV)
•  Corps apoptotiques
•  Microvésicules
•  Exosomes
•  … etc.
18
Nomenclature
Microparticules (MP) = Microvésicules (MV) = Ectosomes
•  Diamètre de 80 - 1300 nm
•  Bourgeonnement externe ...
Nomenclature
freeMitos: mitochondries (fonctionnelles) retrouvées dans le
milieu extracellulaire.

mitoMPs: microvésicules...
La nomenclature est pourrie,
c’est une toute nouvelle science.
Introduction
21
Nombre de publications par année
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2000
2500
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Ectosomes
Microparticles
Microvesicles
Exosomes
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Et alors? Pourquoi s’y intéresser?
Introduction
23
Nature Reviews | Immunology
Donor cell Acceptor cell
mRNAs and small non-coding
RNAs (miRNAs)
MVB
mRNAs
Extracellular
vesi...
Rôle des EVs dans l’inflammation
25	
doi:10.1038/nrrheum.2014.19
Transfert de PAMPs de pathogènes et de DAMPs du soi
Rôle des EVs dans l’inflammation
26	
Autoantigènes de surface
 Cytokines phlogistiques
doi:10.1038/nrrheum.2014.19
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Les freeMitos sont un substrat pour la
sPLA2-IIA et sont très phlogistiques.
Rôle des...
28	
Rôle des mitoMPs dans inflammation
Les neutrophiles, qui jouent aussi un rôle crucial dans
l’inflammation, ont une durée...
Rôle des EVs dans le cancer
29	
Les métastases les plus
fréquentes sont dans les
ganglions lymphatiques, les
poumons, les ...
Bref. On s’en va où avec ça?
Introduction
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Objectifs généraux
1.  Caractériser les microparticules produites par les cellules
d’adénocarcinome rénal (RCC)
2.  Caract...
Méthodes
•  Culture cellulaire (expériences in vitro)
•  Microscopie à fluorescence (mise au point des marquages)
•  Micros...
2. PRODUCTION DE MICROPARTICULES
Microvésicules de RCC et immunomodulation
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Production de microparticules

Pas le temps de niaiser quand on veut faire la mise au point!
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On peut utiliser du A23187 ou la thapsigargine pour augmenter le Ca2+
intracellulaire et provoquer la formation de micropa...
•  Augmenter le Ca2+ intracellulaire change complètement
l’état des cellules.#

•  Les MPs produites sont probablement dif...
3. DÉTECTION DES MICROVÉSICULES
Microvésicules de RCC et immunomodulation
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Détection des MPs: le challenge
Les microvésicules et les exosomes sont très petits.
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Le pipeline
FACS
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Pipeline d’analyses
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Acquisition

des données
Traitement de données à l’aide de
logiciels commerciaux
Publication
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logiciels open-source
Publication
Acquisition des données
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Le MoFlo™ XDP
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Principe de fonctionnement
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Principe de fonctionnement
Hydrodynamic focusing
Les particules en suspension
sont attirées une-à-une avec le
sheath fluid....
Considérations particulières pour les MPs
Problème: passage de
plusieures microparticules
simultanément à travers le laser...
Considérations particulières pour les MPs
Problème: les particules
peuvent passer à travers le
laser à différents endroits...
Considérations particulières pour les MPs
Problème: les particules très
petites donnent un signal faible

Stratégie: rédui...
Traitement des données
FACS
53
R est une plateforme d’analyse statistique
54
R est un language facile et un
framework puissant!

CRAN

7829 packages

Bioconductor

1104 packages

On peut facilement:
...
Analyse bioinformatique (FACS)
Les données brutes obtenues du MoFlo™ XDP sont conformes au
standard FCS 3.1 et sont sauveg...
Analyse bioinformatique (FACS)
Où c’est approprié, les valeurs linéaires sont transformées par la fonction
logicle plutôt ...
Résultats préliminaires
FACS
58
Détection par FACS avec le MoFlo™ XDP
59	Signal-to-noise ratio: 17
424 événements
 7098 événements
Limite de détection
Les mesures de fluorescence sont en général plus sensibles que les
mesures de transmittance:
•  Le FSC ...
TEM
Détection des MPs
61
Microscopie électronique à transmission (UPEI)
doi:10.3402/jev.v1i0.19179
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4. CARACTÉRISATION DES MICROVÉSICULES
Microvésicules de RCC et immunomodulation
63
•  Taille des microparticules (FACS vs NanoSight)
•  Quantification absolue et études cinétiques
•  Visualisation des mitoc...
Distribution de taille des MPs
FACS et NanoSight
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Taille des microparticules (MoFlo™ XDP)
66
Taille des microparticules (MoFlo™ XDP)
67	
250 nm
580 nm
790 nm
1 340 nm
Bruit de fond
Taille des microparticules (MoFlo™ XDP)
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580 nm
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790 nm
1 340 nm
Bruit de fond
600
800
1300
Taille approximative ...
Résolution de taille du MoFlo™ XDP:
•  < 200 nm (en théorie)
•  400-500 nm (en réalité)

Puisque ~80 % des microvésicules ...
NanoSight (Nanoparticle Tracking Analysis)
La dispersion de la lumière est mesurée avec une caméra vidéo ou un
microscope....
NanoSight (Nanoparticle Tracking Analysis)
La dispersion de la lumière est mesurée avec une caméra vidéo ou un
microscope....
Cinétique de production des MPs
Quantification absolue
73
Simulation d’un time-course et quantification absolue à l’aide d’une concentration
connue de billes de polystyrène (rouge),...
freeMitos et mitoMPs
FACS, TEM et microscopie confocale
75
Est-ce qu’il y a beaucoup de mitochondries dans les cellules
de RCC?
76
Tempsd’incubation:45minutes
77
Excellent!
Prochaines étapes: FACS, TEM et microscopie confocale
78
freeMitos et mitoMPs
doi:10.1182/blood-2014-05-573543 (L. Boudreau et al.)
 79
Marqueurs de surface et triage
FACS
80
FACS, marqueurs de surface et triage
81	
Les marqueurs de surface permettent d’identifier des sous-populations
de EVs d’int...
L’option triage du FACS a déjà été testée avec succès dans notre labo
avec des microparticules de plaquettes.

Le rendemen...
5. EFFET DES MPs SUR LE SYSTÈME IMMUNITAIRE
Microvésicules de RCC et immunomodulation
83
•  Macrophages et HL-60
•  Analyse du phénotype (M1 vs M2) par FACS
•  Analyse fonctionnelle (cytokines) par ELISA
Effet de...
Modèle cellulaire
Polarisation des macrophages
85
La lignée cellulaire HL-60 est dérivée d’un patient atteint de leucémie
aiguë promyélocytaire. C’est le modèle qu’on utili...
L’hypothèse nulle c’est que les microparticules n’ont aucun
effet sur la polarisation des macrophages.
HL-60 et macrophage...
L’hypothèse alternative c’est que les microparticules ont un
effet sur la polarisation des macrophages.
HL-60 et macrophag...
Analyse de phénotype (M1 vs M2)
Polarisation des macrophages
89
Le concept de macrophages M1 et M2 est très joli, mais en pratique ils
représentent des extrêmes d’un continuum de phénoty...
Analyse fonctionnelle (cytokines)
Polarisation des macrophages
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Cytokines et ELISA
92
93
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Timeline approximatif
95
Perspectives futures
•  Quel rôle jouent les mitoMPs dans le RCC?
•  Quel est le rôle des MPs de RCC dans l’angiogénèse?
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Proposition 1.2

  1. 1. Caractérisation des microparticules, des mitochondries libres et des mito-MPs produites par des cellules d’adénocarcinome rénal et de leur effet sur la polarisation des macrophages Sous la supervision de: Luc Boudreau Alain Simard Sandra Turcotte Guillaume Pelletier
  2. 2. 2
  3. 3. 1. INTRODUCTION Microvésicules de RCC et immunomodulation 3
  4. 4. Objectifs généraux 1.  Caractériser les microparticules produites par les cellules d’adénocarcinome rénal (RCC) 2.  Caractériser l’impact des différentes populations de microparticules de RCC sur la polarisation des macrophages 4
  5. 5. Cancer du rein Introduction 5
  6. 6. RCC Renal Cell Carcinoma ou adénocarcinome rénal •  Cancer du rein le plus fréquent (~90%) •  Causé par une mutation du gène VHL 6
  7. 7. RCC 25 à 30 % des patients diagnostiqués avec le RCC présentent déjà des métastases. Le taux de survie à 5 ans pour le mRCC est inférieur à 10 %. 7
  8. 8. The new england journal of medicine Figure 1. Staging Overview and Five-Year Survival Rates for Renal Cancer. 8
  9. 9. 9
  10. 10. medical progress 10
  11. 11. Lignée cellulaire 786-O •  Cellules de RCC immortalisées •  Mutées au gène du VHL •  Vendues par ATCC 11 786-O, 10 décembre 2015
  12. 12. Cancer et système immunitaire Introduction 12
  13. 13. Rôle des macrophages doi:10.1038/nri3073 13
  14. 14. Polarisation des macrophages 14
  15. 15. Rôle des macrophages dans l’inflammation 15 doi:10.1038/ni.1937
  16. 16. Vésicules extracellulaires Introduction 16
  17. 17. by conveying information between tumour cells and between tumour and neighbouring cells ■ High levels of circulating procoagulant MVs have been found in patients with acute liver failure and might contribute to normal or hypercoagulable global haemostasis in this setting ■ MVs have promise as diagnostic and prognostic biomarkers in patients with liver diseases available MVs cou Increas MVs hav fluids, in vitreous atherosc Neverthe because t MVs are ders, thro several g MVs in p increase lating M increased (Figure 2 Enhance Several c in partic and featu betes,33 o ity.36 Live as the ma tosis and Furtherm includin inflamma Cells Extracellular vesicles MVB PS 1 2 Microvesicle 0.1–1 μm Exosome 40–100 nm Apoptotic body 1–4 μm doi:10.1038/nrgastro.2014.7 Vésicules extracellulaires 17 Taille d’une cellule 8 – 12 μm
  18. 18. Nomenclature Vésicules extracellulaires (EV) •  Corps apoptotiques •  Microvésicules •  Exosomes •  … etc. 18
  19. 19. Nomenclature Microparticules (MP) = Microvésicules (MV) = Ectosomes •  Diamètre de 80 - 1300 nm •  Bourgeonnement externe de la membrane cellulaire Exosomes •  Diamètre de 30 - 120 nm •  Exocytose des corps multivésiculaires 19
  20. 20. Nomenclature freeMitos: mitochondries (fonctionnelles) retrouvées dans le milieu extracellulaire. mitoMPs: microvésicules qui contiennent des mitochondries fonctionnelles. 20
  21. 21. La nomenclature est pourrie, c’est une toute nouvelle science. Introduction 21
  22. 22. Nombre de publications par année 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Ectosomes Microparticles Microvesicles Exosomes 22
  23. 23. Et alors? Pourquoi s’y intéresser? Introduction 23
  24. 24. Nature Reviews | Immunology Donor cell Acceptor cell mRNAs and small non-coding RNAs (miRNAs) MVB mRNAs Extracellular vesicle Endosome Fusion with limiting membrane of endocytic vesicle? Fusion with cell membrane? Translation into proteins Endocytosis miRNAs Post-transcriptional regulation of target mRNAs 78 Figure 4 | Mechanism of transfer of exosomal shuttle RNAs between cells. mRNAs and small non-coding RNAs, including microRNAs (miRNAs), are transported inside the lumen of secreted extracellular vesicles. Once released, the extracellular vesicles are trapped by acceptor cells. Release of the vesicular RNAs into the cytosol of the acceptor cell requires fusion of the vesicle membrane with the plasma membrane or probably with the limiting membrane of endocytic vesicles, after the extracellular vesicles have been internalized. MVB, multivesicular body. REVIEWS doi:10.1038/nri3622 Transfert horizontal d’information 24 Information: ARN non codants Lipides membranaires Protéines membranaires Récepteurs membranaires Autres métabolites Contenu du cytosol Petites organelles Pathogènes intracellulaires?
  25. 25. Rôle des EVs dans l’inflammation 25 doi:10.1038/nrrheum.2014.19 Transfert de PAMPs de pathogènes et de DAMPs du soi
  26. 26. Rôle des EVs dans l’inflammation 26 Autoantigènes de surface Cytokines phlogistiques doi:10.1038/nrrheum.2014.19
  27. 27. 27 doi:10.1182/blood-2014-05-573543 Les freeMitos sont un substrat pour la sPLA2-IIA et sont très phlogistiques. Rôle des freeMitos dans inflammation
  28. 28. 28 Rôle des mitoMPs dans inflammation Les neutrophiles, qui jouent aussi un rôle crucial dans l’inflammation, ont une durée de vie limitée à 6-8 h dans la circulation. L’internalisation de mitoMPs par les neutrophiles est un mécanisme proposé pour l’augmentation de leur viabilité dans des pathologies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde.
  29. 29. Rôle des EVs dans le cancer 29 Les métastases les plus fréquentes sont dans les ganglions lymphatiques, les poumons, les os, le foie et le cerveau. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis Nature, 19 novembre 2015# (Hoshino et al.)
  30. 30. Bref. On s’en va où avec ça? Introduction 30
  31. 31. Objectifs généraux 1.  Caractériser les microparticules produites par les cellules d’adénocarcinome rénal (RCC) 2.  Caractériser l’impact des différentes populations de microparticules de RCC sur la polarisation des macrophages 31
  32. 32. Méthodes •  Culture cellulaire (expériences in vitro) •  Microscopie à fluorescence (mise au point des marquages) •  Microscopie confocale (visualisation) •  FACS (caractérisation et triage) •  NanoSight (caractérisation et validation) •  TEM (visualisation) •  Analyses bioinformatiques (open source) •  ELISA (validation) 32
  33. 33. 2. PRODUCTION DE MICROPARTICULES Microvésicules de RCC et immunomodulation 33
  34. 34. Production de microparticules
 Pas le temps de niaiser quand on veut faire la mise au point! 34
  35. 35. On peut utiliser du A23187 ou la thapsigargine pour augmenter le Ca2+ intracellulaire et provoquer la formation de microparticules. Ca2+ intracellulaire et vésiculation rapide PMID:9028933 35
  36. 36. •  Augmenter le Ca2+ intracellulaire change complètement l’état des cellules.# •  Les MPs produites sont probablement différentes des MPs produites normalement.# •  On peut le faire pour faire la mise au point. Limites expérimentales 36
  37. 37. 3. DÉTECTION DES MICROVÉSICULES Microvésicules de RCC et immunomodulation 37
  38. 38. Détection des MPs: le challenge Les microvésicules et les exosomes sont très petits. 38
  39. 39. Le pipeline FACS 39
  40. 40. Pipeline d’analyses 40 Acquisition
 des données Traitement de données à l’aide de logiciels commerciaux Publication
  41. 41. Pipeline d’analyses 41 Acquisition
 des données Traitement de données à l’aide de logiciels commerciaux Publication
  42. 42. Pipeline d’analyses 42 Acquisition
 des données Traitement de données à l’aide de logiciels open-source Publication
  43. 43. Pipeline d’analyses 43 Acquisition
 des données Traitement de données à l’aide de logiciels open-source Publication
  44. 44. Pipeline d’analyses 44 Acquisition
 des données Traitement de données à l’aide de logiciels open-source Publication
  45. 45. Pipeline d’analyses 45 Acquisition
 des données Traitement de données à l’aide de logiciels open-source Publication
  46. 46. Acquisition des données FACS 46
  47. 47. Le MoFlo™ XDP 47
  48. 48. Principe de fonctionnement 48
  49. 49. Principe de fonctionnement Hydrodynamic focusing Les particules en suspension sont attirées une-à-une avec le sheath fluid. Le laser ne frappe donc qu’une particule à la fois. 49
  50. 50. Considérations particulières pour les MPs Problème: passage de plusieures microparticules simultanément à travers le laser Stratégie: réduire la pression de l’échantillon (réduit le diamètre du central core) Stratégie: diluer l’échantillon 50
  51. 51. Considérations particulières pour les MPs Problème: les particules peuvent passer à travers le laser à différents endroits Stratégie: réduire la pression de l’échantillon (réduit le diamètre du central core) 51
  52. 52. Considérations particulières pour les MPs Problème: les particules très petites donnent un signal faible Stratégie: réduire au minimum la pression du sheath fluid pour •  augmenter le temps de transit •  augmenter la probabilité de dispersion de la lumière •  augmenter le temps d’émission de fluorescence 52
  53. 53. Traitement des données FACS 53
  54. 54. R est une plateforme d’analyse statistique 54
  55. 55. R est un language facile et un framework puissant! CRAN
 7829 packages Bioconductor
 1104 packages On peut facilement: •  développer de nouveaux outils •  améliorer les outils existants 55 R est une plateforme d’analyse statistique
  56. 56. Analyse bioinformatique (FACS) Les données brutes obtenues du MoFlo™ XDP sont conformes au standard FCS 3.1 et sont sauvegardées en plaintext. Les analyses bioinformatiques sont faites avec R et python au besoin. Exemples de librairies utilisées •  flowCore: manipuler des données de cytométrie en flux •  flowQ: contrôle-qualité •  flowStats: analyse statistique •  flowViz et ggplot2: visualisation des données 56
  57. 57. Analyse bioinformatique (FACS) Où c’est approprié, les valeurs linéaires sont transformées par la fonction logicle plutôt que d’utiliser des échelles logarithmiques. 57 4000 50%2000 50% 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 101 102 103 104 105 0 103 104 105 0 103 10 4 105 + ++ + ++ 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 0 10 3 10 4 10 5 + + ++ ++ Logarithmic ‘Logicle’ CD5 lgD value in each dimension (Fig. 1, dark red crosses) further demonstrates the problem with logarithmic data visualization. By defi- nition, half of the data values in each rectan- gular region are greater than the median and half are less than that value. However, whereas the locations of the median values in the ‘log- icle’ displays (Fig. 1, right) correspond to the visual centers of the subsets, the locations of the median values in the logarithmic displays (Fig. 1, left) are substantially offset from the apparent peak of the subset. In fact, each of the subsets in the logarithmic display is broken up into a ‘false peak’ above the median value, a sparsely populated region between this peak and the baseline, and a ‘pileup’ of a large frac- tion of the cells on the baseline. This artificial subdivision is also visible when data are plotted as a one-dimensional histogram on a logarithmic scale (Fig. 1, bot- tom left). The sharp rise at the lowest value on the scale reflects the ‘pileup’ of the minimally fluorescent cells at the lowest value on the scale. This ‘peak’ tends to be overlooked because it is nearly coincident with the axis. However, it represents roughly 40% of the minimally fluorescent population and 20% of the cells in the overall population. The ‘valley’ and the ‘false peak’ are also in the histogram, creating a total of three peaks rather than the two that actually exist. This problem does not occur in histograms plotted on ‘logicle’ axes (Fig. 1, bottom right), in which the minimally fluo- rescent cells form a peak centered at or near zero and extending symmetrically above and below the peak center,thereby representing the cells whose measured fluorescence values are below zero. In two-dimensional logarithmic displays, of the cells in the sample. Notably, these‘miss- ing’ cells are readily visible in‘logicle’ displays, tral overlap before visualization in histo dot plots and contour maps. In essence 0 103 104 105 0 1000 2000 3000 4000 50% 30% 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 0 50 1000 1500 2000 30% 50% 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 101 102 103 104 105 0 103 104 105 0 103 10 4 105 + ++ + ++ 10 1 10 2 0 ++ ++ CD5 lgD CD5 Figure 1 ‘Logicle’ displays provide improved representation of cells with minimal fluorescence. C with minimal fluorescence can be visualized with ‘logicle’ displays (right) but are ‘piled up’ on the with logarithmic displays (left). The true center of each gated population (median fluorescence va each dimension; dark red crosses) matches the visual peak for that population in ‘logicle’ displays top and middle) but does not match the visual peak in the logarithmic displays (left, top and midd Because logarithmic scales cannot display cells with zero or negative values, these cells are ‘piled the axis in the logarithmic displays. However, they are properly visualized in the ‘logicle’ display ( right, red shaded region). Data provided by E. Ghosn (Stanford University, Stanford, California). ©2006NaturePublishingGrouphttp://www.nature.com/natureimmunology doi:10.1038/ni0706-681
  58. 58. Résultats préliminaires FACS 58
  59. 59. Détection par FACS avec le MoFlo™ XDP 59 Signal-to-noise ratio: 17 424 événements 7098 événements
  60. 60. Limite de détection Les mesures de fluorescence sont en général plus sensibles que les mesures de transmittance: •  Le FSC est une mesure d’une petite variation sur un signal de forte intensité. •  Les détecteurs de fluorescence mesurent des signaux relativement forts par rapport à un signal de fond excessivement faible. Un marquage des membranes au PKH67 a été validé pour la détection de microparticules au FACS. Des essais sont en cours présentement. 60
  61. 61. TEM Détection des MPs 61
  62. 62. Microscopie électronique à transmission (UPEI) doi:10.3402/jev.v1i0.19179 62
  63. 63. 4. CARACTÉRISATION DES MICROVÉSICULES Microvésicules de RCC et immunomodulation 63
  64. 64. •  Taille des microparticules (FACS vs NanoSight) •  Quantification absolue et études cinétiques •  Visualisation des mitochondries par fluorescence et microscopie confocale •  Quantification relative des freeMitos et des mitoMPs •  Marqueurs de surface et triage par FACS Caractérisation des microparticules 64
  65. 65. Distribution de taille des MPs FACS et NanoSight 65
  66. 66. Taille des microparticules (MoFlo™ XDP) 66
  67. 67. Taille des microparticules (MoFlo™ XDP) 67 250 nm 580 nm 790 nm 1 340 nm Bruit de fond
  68. 68. Taille des microparticules (MoFlo™ XDP) 68 250 nm 580 nm 790 nm 1 340 nm Bruit de fond
  69. 69. Taille des microparticules (MoFlo™ XDP) 69 250 nm 580 nm 790 nm 1 340 nm Bruit de fond 600 800 1300 Taille approximative (nm) 250 200
  70. 70. Résolution de taille du MoFlo™ XDP: •  < 200 nm (en théorie) •  400-500 nm (en réalité) Puisque ~80 % des microvésicules sont de taille inférieure à 130 nm, l’information obtenue sur la distribution de taille est peu utile. En revanche, le NanoSight résolve la taille des particules entre 10 et 2 000 nm. Résolution de taille 70
  71. 71. NanoSight (Nanoparticle Tracking Analysis) La dispersion de la lumière est mesurée avec une caméra vidéo ou un microscope. Le principe est similaire au FACS, mais l’échantillon est en suspension et est plus ou moins immobile. Mesure: •  Concentration •  Taille des particules •  Fluorescence spécifique On obtient un graphe de la distribution# de tailles des microparticules. 71
  72. 72. NanoSight (Nanoparticle Tracking Analysis) La dispersion de la lumière est mesurée avec une caméra vidéo ou un microscope. Le principe est similaire au FACS, mais l’échantillon est en suspension et est plus ou moins immobile. Mesure: •  Concentration •  Taille des particules •  Fluorescence spécifique On obtient un graphe de la distribution# de tailles des microparticules. 72 doi:10.3402/jev.v1i0.19179
  73. 73. Cinétique de production des MPs Quantification absolue 73
  74. 74. Simulation d’un time-course et quantification absolue à l’aide d’une concentration connue de billes de polystyrène (rouge), corrigée pour la taille de la population de cellules. Cinétique de production des MPs 74
  75. 75. freeMitos et mitoMPs FACS, TEM et microscopie confocale 75
  76. 76. Est-ce qu’il y a beaucoup de mitochondries dans les cellules de RCC? 76
  77. 77. Tempsd’incubation:45minutes 77
  78. 78. Excellent! Prochaines étapes: FACS, TEM et microscopie confocale 78
  79. 79. freeMitos et mitoMPs doi:10.1182/blood-2014-05-573543 (L. Boudreau et al.) 79
  80. 80. Marqueurs de surface et triage FACS 80
  81. 81. FACS, marqueurs de surface et triage 81 Les marqueurs de surface permettent d’identifier des sous-populations de EVs d’intérêt.
  82. 82. L’option triage du FACS a déjà été testée avec succès dans notre labo avec des microparticules de plaquettes. Le rendement est relativement faible, mais cette technique permet néanmoins l’enrichissement de sous-populations de EVs. FACS, marqueurs de surface et triage 82
  83. 83. 5. EFFET DES MPs SUR LE SYSTÈME IMMUNITAIRE Microvésicules de RCC et immunomodulation 83
  84. 84. •  Macrophages et HL-60 •  Analyse du phénotype (M1 vs M2) par FACS •  Analyse fonctionnelle (cytokines) par ELISA Effet des MPs sur le système immunitaire 84
  85. 85. Modèle cellulaire Polarisation des macrophages 85
  86. 86. La lignée cellulaire HL-60 est dérivée d’un patient atteint de leucémie aiguë promyélocytaire. C’est le modèle qu’on utilise actuellement afin de tester les agonistes silencieux de la nicotine. HL-60 et macrophages 86
  87. 87. L’hypothèse nulle c’est que les microparticules n’ont aucun effet sur la polarisation des macrophages. HL-60 et macrophages – H0 87
  88. 88. L’hypothèse alternative c’est que les microparticules ont un effet sur la polarisation des macrophages. HL-60 et macrophages – H1 88
  89. 89. Analyse de phénotype (M1 vs M2) Polarisation des macrophages 89
  90. 90. Le concept de macrophages M1 et M2 est très joli, mais en pratique ils représentent des extrêmes d’un continuum de phénotypes (et il existe d’autres classifications). Il existe peu de marqueurs de surface utiles pour les M1, mais on peut utiliser une combinaison de marqueurs générals de macrophages et de marqueurs de M2 pour identifier nos populations de cellules. CD11b: macrophages M1 et M2 CD80 / CD86 high: M1; CD80 / CD86 low: M2 CX3CR1 low: M1; CX3CR1 high: M2 CCR2 / Ly-6c high: M1; CCR2 / Ly-6c low: M2 CD163: M2 FACS et marqueurs de surface 90
  91. 91. Analyse fonctionnelle (cytokines) Polarisation des macrophages 91
  92. 92. Cytokines et ELISA 92
  93. 93. 93
  94. 94. 94
  95. 95. Timeline approximatif 95
  96. 96. Perspectives futures •  Quel rôle jouent les mitoMPs dans le RCC? •  Quel est le rôle des MPs de RCC dans l’angiogénèse? •  Quel est l’effet des MPs de RCC sur la polarisation des autres cellules du système immunitaire (eg.: cellules lymphoïdes)? •  Opportunité pour études –omiques? 96

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