Publicité
chem320-lec1.ppt
Signaler
HayderAliqabi1Suivre
20 Mar 2023•0 j'aime•19 vues
0 j'aime
Soyez le premier à aimer ceci
afficher plus
vues
Nombre de vues
0
Sur Slideshare
0
À partir des intégrations
0
Nombre d'intégrations
0
Check these out next
chem320-lec1.ppt
20 Mar 2023•0 j'aime•19 vues
0 j'aime
Soyez le premier à aimer ceci
afficher plus
vues
Nombre de vues
0
Sur Slideshare
0
À partir des intégrations
0
Nombre d'intégrations
0
Télécharger pour lire hors ligne
Signaler
Carrière
الطرد المركزي
HayderAliqabi1Suivre
Publicité
Publicité
Publicité
chem320-lec1.ppt
- الحيوية التكنولوجيا برنامج ز ى ك مقرر 320 الطبيعية الحيوية الكيمياء بالتدريس القائم : أ . د . حسن شعبان محمد أ . د . إسماعيل أحمد حمادى الزراعية الكيمياء قسم - الزراعة كلية – المنيا جامعة السادسة المحاضرة : المركزى الطرد
- المركزى والطرد الترسيب Sedimentation and centrifugation • الترسيب : عندما يسمح لمعلق فى محلوله داخل أنبوبة اختبار ت حت تأثير الجاذبية األرضية فإن الجسيمات األكثر كثافة ترسب ببطء . • الطرد المركزى : عملية الترسيب لهذا المعلق يتم تسريعها بواس طة قوة طاردة مركزية عن طريق جهاز الطرد المركزى . • أساس الفصل فى جهاز الطرد المركزى : فصل الجسيمات particles من المحلول ً بناءا على حجمها size ، وشكلها shape ، وكثافتها density ، ولزوجة الوسط viscosity ، وسرعة الـ rotor ( الدوار ) . • المركزى الطرد استخدامات : ي ستخدمًفىًفصل : ًالخاليا - ًالمكوناتًالخلوية - عضياتًالخلية – ًالبروتينات - ًاألحماضًالنووية (DNA or RNA) .
- الدوار rotor المركزى الطرد لعملية المستخدم ًطولًالمسافةًلتحركًالجسيمًقبل ترسيبهًيعطىًنتيجةًأفضلًللف ًصلًكما فىًالطردًالمركزىًمتدرجًالكثافة أسهلًفىًسحبًالمحلولًالرائق بدونًالمساسًبالراسب - تأخذًالجسيماتًالمترسبةًمس ًافة قصيرةًقبلًوصولهاًللترسي ًب . Swinging bucket Rotor Fixed Angle Rotor Centrifuge Rotors المتأرجح الدوار الثابت الزاوية الدوار - يأخذًالطردًالمركزىًوقتًأقصر . - هذاًالنوعًمنًالروترًأكثرًاستخدام ً ا
- المركزى الطرد أجهزة أنواع Types of Centrifuges • بدون أو تبريد بنظام البنش على مركزى طرد - ًالسرعةًأقلًمن 4000 rpm - ًشائعًفىًالمعاملًاإلكليكينية ( ًفصلًالدم – ًالبالزما - ا لسيرم ) - ًيمكنًاستخدامًأنابيبًحتىًحوالى 100 بناءًعلىًقطرًالروتر • ميكرو مركزى طرد Microcentrifuge (Eppendorf) - ًيستخدمًأنابيبًحجمًحتى 2 ملليلتر - ًشائعًفىًمعاملًالبيولوجياًالجزيئية - ًتصلًالسرعةًفيهًإلى 15000xg - يوجدًمنهًالعملًبنظامًتبريد أوًبدونًتبريد
- • السرعة عالى مركزى طرد High Speed centrifuge : - ًتصلًالسرعة 15000-20000 RPM - أحجامًمختلفةًمنًالعيناتًوالتىًتعتمدًعلىًالـ rotor - نظامًتحتًتفريغًوتبريد - روترًذاتًمقاساتًمختلفة المركزى الطرد أجهزة أنواع Types of Centrifuges
- • السرعة فائق مركزى طرد Ultracentrifuge : - تصلًسرعةًالـ rotor ًإلى 500000g ًوهىًتعادل 75000 لفةًفىًالدقيقةًلـ rotor ًنصفًقطره = 8 cm - ينشأًعنًالسرعةًالفائقةًحر ًارة ًشديدةًولذاًيزودًجهازًالطرد المركزىًبنظامًتبريدًتحتًت فريغ - ًمزودًبنظامًتسجيلًضوئى ًيستدلًبهًعلىًمراحلًًفصل العينةًأثناءًعمليةًالطردًالمرك زى المركزى الطرد أجهزة أنواع Types of Centrifuges
- السرعة فائق المركزى الطرد تابع • يستخدمًإلجراءًنوعينًمنًالتجارب : • - ًتجاربًسرعةًالترسيب Sedimentation velocity experiments • لمعرفةًالشكلًوالوزنًالجزيئىًللجزيئاتًالعمالق ًةًفى ًودراسةًالتغيراتًفىًشكلًهذهًالجزيئات،ًمحاليلها • - ًتجاربًالترسيبًالمتزن sedimentation equilibrium experiments • ًًلدراسةًثوابتًاالتزانًلألنظمةًالحيوية
- المركزى الطرد جهاز استخدام طريقة • ًتوضعًالعينةًالمرادًفصلهاًوترسيبهاًفيًأنبوبةًالجهازًداخلًالـ rotor وفيًالجهةًالمقابلةًتوضعًأنبوبةًبهاًماءًوبنفسًوزنًأنبوبةًالع ينة . • ًيغلقًغطاءًالجهازًوتحددًالفترةًالزمنيةًللتشغيلًمنًمفتاحًالـ Timer . • ًتحددًسرعةًالدوران ( عددًاللفات / الدقيقة ) بتحريكًمؤشرًالسرعات للسرعةًالمطلوبة . • بعدًالتأكدًمنًأنًالجهازًيعملًعليًنفسًتيارًالمختبرًيشغلًمفت ًاحًالتيار الكهربي . • يشغلًمفتاحًالتبريدًوالتفريغًانًوجدًثمًيضغطًعليًمفتاحًال ًتشغيل واالنتظارًالمدةًالزمنيةًالمحددةًواالنتظارًحتيًتوقفًالدورانًتماما . • ويالحظًانًفيًبعضًاألجهزةًمفتاحًالتوقيتًيعملًايضاًكمفتاحًت شغيل . • فيًاالجهزةًالمطورةًمزودةًبمفتاحًإيقافًتلقائيًومنًسماعًصوتًاال ًيقاف يبدأًفتحًبابًأوًغطاءًالجهازًوينزعًالـ rotor ًبرفقًوتؤخذًأنبوبةًالعينة ًوتسكبًفيًدورق (supernatant) ًأماًماًتبقيًفيًقاعًاالنبوبةًفهو العينةًالمرادًفصلهاًوترسيبهاًتجمعًبدقةًوتنقلًألنبوبةًوتحف ًظًفيًدرجة حرارةًتحتًالصفرًلحينًالعملًعليها .
- المرك الطرد بجهاز للعناية توافرها يجب احتياطات زى • يجبًعدمًتشغيلًالجهازًقبلًموازنةًكلًأنبوبتينًمتقابلتي ًنًلضمان التوازن . • الًتفتحًالجهازًاثناءًالدورانًقبلًأنًيتوقفًتماماًعنًالدوران ًوفي األجهزةًالحديثةًالًتوجدًمشكلةًفيًذلكًألنًالغطاءًالًينفتحًا ًالًبعد االيقافًالتلقائي . • ًالًتحاولًإيقافًالـ rotor أوًإبطاؤهًباستخدامًاليدًفذلكًيتلفًالج هاز . • فصلًالجهازًعنًالتيارًالكهربيًبعدًكلًاستخدامًمعًمراعاةًالن ًظافة الجيدةًوالتجفيفًالتامًثمًيغطيًبغطاءًبالستيكيًخاصًب ه .
- للترسيب النظرى األساس • ًعندًوضعًجسيم particle ًفىًأنبوبةًطردًمركزىًمملوءةًبسائلًفإنه يتعرضًلثالثًقوىًوهى : • ًقوةًالطردًالمركزى (Fc) centrifugal force ًًمعوالتىًتتناسبًطرديا ًجسيمًوزنه (m) g ًًمربعًًالسرعةًالزاوية، ()radius/s ًًنصفًقطر، الـ rotor (r) cm • Fc = m2r • ًقوةًالطفو (Fb) buoyant force ًًًًًًًًًمعوالتىًتتناسبًطرديا mdis: the mass of equal volume of solvent. و ًمربعًًالسرعة ًالزاوية ()2 ًًنصفًقطرًالـ، cm rotor (r) Fb = mdis2r mdis= m fluid/ particle V= 1/ particle • Fb = mV2r • ًقوةًاالحتكاك (Ff) frictional force ًًمعًًسرعةوالتىًتتناسبًطرديا ًالجسيم (v) m/s ًومعاملًاالحتكاك () • Ff = v - - -
- Fc – Fb – Ff = 0 m2r – mV2r – v = 0 قوةًالطردًالمركزى قوةًالطفو قوةًاالحتكاك نصفًقطرًالـ rotor السرعة الزاوية ًوزن الجسيم لالتز قوى الثالث تصل السرعة ثبات عند ان : S : الترسيب معامل : سرعةًترسيبًالجسيمًمقسو ًما علىًقوةًالطردًالمركزى . v = m2r (1-V) - v/2r = m(1-V)/ - s = m(1-V) / - v = m2r – mV2r - - m2r – mV2r – v = 0 - v = m2r – mV2r -
- • معامل الترسيب ( m/s2 (vm/s/2r : سرعة ترسيب الجسيم ً مقسوما على قو ة الطرد المركزى . • وحدات معامل الترسيب بالثانية (m/s / m/s2) ، وألن العديد من الجزيئات البيولوجية لها معامل ترسيب أكبر من 10-13seconds فإن هذه الكمية تعرف بوحدات سفيدبرج Svedberg units (S) نسبة للعالم السويدى سفيدبرج . ولهذا فإن تحت وحدة الريبوسوم التى لها معامل ترسيب 18x10-13s تسمى 18S ( حرف S مالصق للعدد 18 ) . • وحدات سفيدبرج مقياس لحجم الجسيم ً معتمدا على معدل تحركه فى أنبوبة الطرد المركزى تحت تأثير الجاذبية األرضية . • تتراوح قيمة S فى معظم الجزيئات البيولوجية من 1S – 10000S . • كلما قلت قيمة S كلما تباطأ تحرك الجسيم فى مجال الطرد المركزى ، أو : كلما كبر حجم الجسيم كلما زادت سرعة ترسيبه وبالتالى عظمت قي مة S . الحظ أن 40S يرسب فى زمن أقل من 20S بالرغم من أن 40S = 40x10-13s ، 0S = 20x10-13s ( عكس ما يبدو ً ظاهريا ) فسر ذلك ؟ الترسيب معامل Sedimentation coefficient (s)
- • بفرض بروتين MW له = 150 كيلو دالتون ، وضع فى جهاز طرد مركزى سرعته الطاردة centrifugal acceleration 2r = 4.9x108cm/s2 ً علما بأن معدل ترسيب جسيمات البروتين sedimentation rate v = 3.4x10-4cm/s . احسب معامل ترسيب sedimentation coefficient (s) هذا البروتين ؟ • s = v/2r • s = 3.4x10-4/4.9x108 = 7x10-13 = 7S • تحت وحدة الريبوسوم 40S ، 60S ً معا التساوى 100S وإنما = 80S ألن معدل الترسيب اليعتمد على وزن أو حجم الجسيم فقط ، فمعامل الترسيب اليتغير بشكل خطى مع الوزن الجزيئى ، وار تباط وحدتى الريبوسوم ً معا يحدث فقد فى المساحة السطحية لهما .
- المركزى الطرد سرعة Speed of Centrifugation يمكنًالتعبيرًعنًالقوةًالدافعةًللطردًالمركزىًبطريقتين : • ًقوةًالطردًالمركزىًالنسبى RCF (g) • ًعددًدوراتًالروترًفىًالدقيقة Rotation Per Minute (rpm) - إذا افترضنا وجود 2 روتر ذو قطرين مختلفين فإن نفس العينات سيتم ترسيب مكوناتها بسرعات مختلفة من الـ (rpm) . لذا يستخدم فى أجهزة الطرد المركزى اصطالح قوة الطرد المركزى النسبى (RCF) . - تعتمد القوة الدافعة للطرد المركزى على ( أو تنسب إلى ) قوة ال جاذبية األرضية g . ً فمثال 500xg تعنى أن القوة الدافعة للطرد المركزى تساوى 500 مرة أكبر من قوة الجاذبية األرضية . g = 980 cm/s2 - ويعبر عن RCF بوحدات الجاذبية (g) ً بديال عن عدد دورات الـ rotor فى الدقيقة (rpm) - لهذا يجب استنتاج العالقة بين RCF و rpm كاآلتى :
- FC = 2 r RCF = 2 r 980 rpm = 60ω 2 π = π (rpm) 30 (πrpm)2r RCF = 302 980 RCF = (1.12 × 10-5) (rpm)2 r ًحيث Fc : قوةًالطردًالمركزى : ًالسرعةًالزاوية ( ًلفة / ثان ية ) r : نصفًقطرًالدوارًبالسم RCF : قوةًالطردًالمركزىًالنسبى ًباستنتاجًقيمة ثمًالتعويضًعنهاًف ًى ًمعادلة RCF rpm : عددًاللفاتًفىًالدقي قة g = 980 cm/s2 g : acceleration العجلة بين العالقة استنتاج RCF و rpm
- A diagram illustrating the variation of RCF with r, the distance of the sedimenting particles from the axis of rotation.
- • احسب قيمة الـ RCF آخذا في االعتبار قمة وقاع العينة في االنبوبة المثبت بالـ rotor . فإذا فرضنا أن rmin = 4.8 cm و rmax = 8.0 cm كما بالشكل ، وسرعة الدوران rpm = 12000 دورة / دقيقة RCF mean = (1.12 x 10-5)(12000)2 x 6.4 = 10313 xg RCF = (1.12 × 10-5) (rpm)2 r 4.8 cm 8 cm 8 + 4.8/2 = 6.4 cm
- المركزى الطرد تصنيف التحليلى Analytical centrifugation الكثافة متدرج المركزى الطرد Density gradient centrifugation التجزيئى المركزى الطرد Differential centrifugation المتزن المركزى الطرد Equilibrium centrifugation (isopycnic) الطبقى المركزى الطرد Rate zonal centrifugation التحضيرى Preparative centrifugation المنخفض – العالى – السرعة الفائق law, high and ultra- centrifugation
- Preparative Centrifugation • يستخدمًلفصلًعضياتًالخليةًوالجزيئات • يمكنهًاستخدامًأحجامًكبيرةًمنًالمحاليل • طرقًالفصلًًالمستخدمةًفىًالطردًالمركزىًفائقًالس ًرعة التحضيرى - الطردًالمركزىًالتجزيئى Differential Centrifugation - الطردًالمركزىًمتدرجًالكثافة Density Gradient Centrifugation التحضيرى المركزى الطرد
- التجزيئى المركزى الطرد اجراء طريقة • ًًًًًًًتقطعًاألنسجةًفىًمحلولًمنظمًأيسوتونكًبارد cold isotonic buffer ( ًمحلولًمنظمًلمقاومةًالتغير قىًدرجةًالـ pH – ًالمحلولًباردًلوقفًنشاطًاإلنزيم – محلولًأيسوتونكًلوقفًاألسموزية • طحنًالخالياًفىًخالطًلتكسيرًالخالياًوفتحها • الترشيحًإلزالةًالموادًغيرًالذائبة التجزيئى المركزى الطرد Differential Centrifugation • ًفىًتجزئًالخالياأكثرًالطرقًشيوعا • التجزيئًيعنىًفصلًالعضياتًالمختلفةًداخلًالخلي ة
- • ًعملًطردًمركزىًللراشح ًًعلى 1000g ًلمدة 10 دقائق الراسبًالمتحصلًعليهًم ًن الطردًالمركزىًعبارةًعن : ًالنواةًوهىًأكبرًعضيات الخليةًكثافة
- • ًعملًطردًمركزىًللراشح ًًالسابقًًعلى 10000g ًلمدة 30 دقيقة - الراسبًالمتحصلًعليه ًمنًالطردًالمركزىًعبارة عن : الميتوكندرياًوهىًث ًانى أكبرًعضياتًالخليةًكث افة
- • ًعملًطردًمركزىًللراشح ًًالسابقًًعلى 100000g ًلمدة 30 دقيقة - الراسبًالمتحصلًعليه ًمنًالطردًالمركزىًعبارة عن : الشبكةًاإلندوبالزمي ًة – ًجهازًجولجى – ًاألغشية الخليةًاألخرى
- • ًعملًطردًمركزىًللراشح ًًالسابقًًعلى 300000g ًلمدة 3 ساعات - الراسبًالمتحصلًعليه ًمنًالطردًالمركزىًعبارة عنًالريبوسومات
- Density Gradient Centrifugation • تقنيةًهامةًلتنقيةًعضياتًالخليةًوالجزيئاتًالعمالقةًم ًثل البروتيناتًواألحماضًالنووية • ينشأًتدرجًالكثافةًمنًوضعًطبقةًبعدًطبقةًمنًوسطًمت درج • ًيوجدًنوعانًمنًالتجاربًتستخدمًهذاًالنوعًمنًالطرد المركزى : - ًالطردًالمركزىًالطبقى Zonal centrifugation - ًالطردًالمركزىًالمتزن Equilibrium centrifugation الكثافة متدرج المركزى الطرد
- الطبقى المركزى الطرد • توضع العينة المراد فصل مكوناتها على سطح محلول الس كروز متدرج الكثافة يزيد كلما اتجهنا الى قاع أنبوبة الطرد ال مركزى • فى عملية الطرد المركزى تنفصل مكونات العينة حسب أ وزانها الجزيئية فى محلول السكروز متدرج الكثافة • بعد االنتهاء من الطرد المركزى تثقب قاع األنبوبة ويجمع المحلول فى أنابيب تجميع • يستدل على مكونات العينة فى أنابيب التجميع بطرق ا لقياس اللونية zonal Centrifugation
- zonal Centrifugation Sample is layered on top of gradient الطبقى المركزى الطرد
- المتزن المركزى الطرد • ًًتخلطًالعينةًمعًمحلولًمنًكلوريدًالسيزيوم CsCl • فى عملية الطرد المركزى تتدرج مكونات العينة حسب كثافتها مع تدرج محلول كلوريد السيزيوم فى أنبوب ة الطرد المركزى ( أعلى كثافة فى القاع وأقل كثافة فى قمة األ نبوبة ) • بعدًاالنتهاءًمنًالطردًالمركزىًتثقبًقاعًاألنبوبةًوي ًجمع ًالمحلولًفىًأنابيبًتجميع • يستدلًعلىًمكوناتًالعينةًفىًأنابيبًالتجميعًبطر ًقًالقياس اللونية Equilibrium Centrifugation
- Equilibrium Centrifugation Sample is mixed with CsCl solution المتزن المركزى الطرد
- المركزى الطرد عملية : - الترسيبًتامًحيثًتكونًكثافةًال ًجسيم ًفىًحالةًاتزانًمعًكثافةًالوسط - ًالسرعةًمنخفضة ( 5 - 25 ًالف rpm ) - ًوقتًأطول ( 20 - 96 ساعة ) المركزى الطرد عملية : - الترسيبًغيرًكاملًحيثًيوقفًالط ًرد قبلًوصولًراسبًالىًقاعًاألنبوب ًة - ًالسرعةًعالية ( 40 - 60 ًالف rpm ) - ًوقتًمحدد ( 1 - 3 ساعات ) العينة : - ًالكثافةًواحدةًوالوزن الجزيئىًمختلف - مثلًالبروتينات العينة : - الكثافةًمختلفةًوالوزن الجزيئىًواحد - ًمثلًاألحماضًالنووية – عضياتًالخلية والطبقى المتزن المركزى الطرد بين مقارنة الطبقى المتزن
- التحليلى المركزى الطرد Analytical centrifugation • يقيس الطرد المركزى التحليلى الخواص الطبيعية ل لجسيمات المترسبة مثل معامل الترسيب والوزن الجزيئى . • تالحظ الجزيئات العمالقة بنظام ضوئى أثناء الطرد المركزى فى المحلول وهى تتحرك فى مجال الجاذبية . • تصور العينة أثناء الطرد المركزى بنظام ضوئى يظه ر على الحاسب اآللى . • يحدد تركيز المحلول فى أنبوبة الطرد المركزى عند ن قط مختلفة بقياس اإلمتصاص بواسطة التحليل الطيفى
- THE END
Publicité