O documento descreve um experimento de cromatografia em papel para separar e identificar aminoácidos. O experimento envolveu a aplicação de uma mistura de aminoácidos em papel e a utilização de um solvente para separá-los. Os aminoácidos foram identificados após reagirem com ninidrina e formarem manchas coloridas em locais diferentes no papel. Os resultados mostraram que aminoácidos mais polares migraram menos que os menos polares.

1. EXPERIMENTO 2 - SEPARAÇÃO DE AMINOÁCIDOS
POR CROMATOGRAFIA EM 4PAPEL
1) OBJETIVOS
1) Analisação cromatográfica de uma mistura de aminoácidos, usando
como padrões aminoácidos conhecidos que são aplicados
separadamente em papel, onde sua posição é revelada pela reação com
ninidrina.
2) Introduzir o conceito de Rf (razão de fluxo) e demonstrar a separação
e identificação de aminoácidos através da cromatografia em papel.
2) REAGENTES E SOLVENTES
Soluções de ninidrina (0,1% em acetona)
Mistura desconhecida de aminoácidos
Aminoácido desconhecido
Soluções-padrão de aminoácidos
Mistura de n-butanol: ácido acético: água (4:1:1, v / v / v)
3) MATERIAL
• Papel Whatman nº1
• Lápis, régua, clip
• Béquer (2L)
• Placa de Petri
• Capilar de vidro
4) PROCEDIMENTOS
Fazer um traço de lápis ao longo do comprimento maior e a 2cm da borda
de uma folha (21x16cm) de papel Whatman nº1, evitando tocar com os
dedos o papel durante toda a operação. Marcar 5 pontos sobre o traço que
distem 3cm um do outro e numerá-los a lápis de 1 a 5. Aplicar as amostras
nos pontos numerados com o auxílio de um capilar de vidro, de forma que
a mancha sobre o papel tenha o menor diâmetro possível. Nos pontos de 1 a
4 aplicar os padrões e no 5 a amostra a ser analisada. Enrolar o papel de
modo a transformá-lo num cilindro e prender as extremidades superiores

2. com a ajuda de um clip. Colocar 25ml do solvente de Patridge (n-butanol:
ácido acético: água 4:1:1, v, v, v) em uma placa de Petri e mergulhar o
cilindro de papel em seu interior de modo que este fique perfeitamente
vertical. Evitar que o papel toque a parede da placa. Cobrir o sistema com
um béquer de 2 litros e deixar o solvente migrar cerca de 10cm. Retirar o
papel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente usando lápis.
Secar o papel na capela com o exaustor ligado, mergulhar em solução 0,1%
de ninidrina em acetona e levar à estufa (80-100ºC) durante 3 a 4 minutos.
Delimitar com lápis as manchas que aparecem no papel.
Figura 2.1: Ilustração da parte inicial da experiência (montagem do sistema onde o
solvente irá subir ao longo da folha de papel por capilaridade, carregando consigo os
aminoácidos depositados previamente e representados por manchas cinzas na figura).

3. RESULTADOS OBTIDOS
Aminoácido Deslocamento do centro imaginário
Prolina 2 cm
Alanina 1,8 cm
Leucina 4 cm
Histidina 0,8 cm
Mistura 0,8 cm / 1,8 cm / 2 cm / 4 cm
Desconhecido 0,8 cm
Tabela 2.1: Resultado da cromatografia realizada em diversos aminoácidos
simultaneamente, sendo que uma solução continha uma mistura de aminoácidos, por
isso são apresentados quatro valores (um para cada mancha detectada). Essa mistura
continha prolina, alanina, leucina e histidina.
Essa migração dos aminoácidos ocorre devido ao fato de que o solvente
sobe ao longo do papel por causa da capilaridade e arrasta os aminoácidos
previamente depositados. Caso o solvente seja menos polar que a celulose
do papel, pode-se prever que substâncias pouco polares migrarão mais do
que as polares. É justamente esta diferença do comportamento que permite
uma separação eficiente. As posições dos aminoácidos (depois de
concluída a experiência) são reveladas pois eles reagem com a ninidrina
formando compostos que apresentam cor.
A tabela abaixo apresenta os valores de Rf calculados e os valores de Rf
fornecidos para comparação. Os valores de Rf calculados foram obtidos
através da fórmula
Rf = d / Lf
onde d é a distância migrada pela substância (as distâncias fornecidas na
tabela 2.1) e Lf é a distância percorrida pelo solvente. Considerando a reta
formada pelos pontos de aplicação dos aminoácidos como o marco 0, o
valor de Lf obtido na experiência foi de 6,5 cm.

4. Aminoácido Valor de Rf calculado Valor de Rf fornecido
Prolina 0,30 0,43
Alanina 0,27 0,38
Leucina 0,61 0,73
Histidina 0,12 0,20
Mistura 0,12 / 0,27 / 0,30 / 0,61 ----
Desconhecido 0,13 ----
Tabela 2.1: Resultado da cromatografia realizada em diversos aminoácidos
simultaneamente, sendo que uma solução continha uma mistura de aminoácidos, por
isso são apresentados quatro valores (um para cada mancha detectada). Essa mistura
continha prolina, alanina, leucina e histidina.
A identificação do aminoácido desconhecido aponta para uma forte
contradição: enquanto o valor obtido para seu Rf indica que ele é a lisina, a
sua distância de migração é praticamente a mesma da histidina. Em
compensação, se ao invés de se utilizar o centro hipotético da mancha for
utilizado o ponto de maior alcance da mancha, os valores de Rf obtidos
possuem grande concordância com os valores fornecidos.
Aminoácido Valor de Rf calculado Rf fornecido Ponto máximo da mancha
Prolina 0,40 0,43 2,6 cm
Alanina 0,38 0,38 2,5 cm
Leucina 0,75 0,73 4,9 cm
Histidina 0,20 0,20 1,3 cm
Mistura 0,2 / 0,38 / 0,40 / 0,75 ---- 1,3 cm / 2,5 cm / 2,6 cm / 4,9 cm
Desconhecido 0,21 ---- 1,4 cm
Tabela 2.2: Ao invés de ser utilizado o centro hipotético para o cálculo dos valores de
Rf os valores acima foram calculados a partir do alcance máximo de cada mancha de
cada aminoácido. Observe que a concordância com os valores de Rf fornecidos é
grande, o que torna relevante esse fato.
Uma possível explicação para o fato de os valores de Rf só terem
concordados com os fornecidos é a seguinte: na aplicação dos aminoácidos
no papel Whatman nº1 as soluções dos aminoácidos não foram aplicadas de
forma a preencher os pontos marcados, ou seja, os aminoácidos acabaram
se "espalhando" e, ao migrarem, formaram manchas muito grandes. Isso
indica que, se estes aminoácidos tivessem sido aplicados numa região
menor, a mancha também seria menor e o centro hipotético acabaria por
estar bem próximo do topo da mancha (o topo da mancha é justamente
onde estão localizados os aminoácidos que estava no ponto correto no
início da experiência). Essa explicação também tem seu valor dado o fato
de que os aminoácidos com menores manchas tiveram maior precisão nos
valores de Rf calculados, visto que são minimizados erros sistemáticos
(imprecisão na demarcação do centro hipotético e medição das distâncias).

5. Figura 2.2: Reação da ninidrina com a alanina.
Figura 2.3: Reação da ninidrina com a histidina.

6. Figura 2.4: Reação da ninidrina com a leucina.
A reação da ninidrina com os aminoácidos primários produz um
pigmento púrpura, conforme exibido nas figuras 2.2, 2.3 e 2.4. É a partir
desse pigmento que se torna possível localizar o deslocamento dos
aminoácidos na cromatografia em papel. O único aminoácido que é
exceção é a prolina que, por possuir um grupo imino ao invés de um grupo
amino (tem radical cíclico ligado ao N), forma um composto de cor
amarela ao invés de púrpura. Por ser mais complexa e diferente, a reação da
ninidrina com a prolina não está exibida nesse relatório, porém sua
fórmula estrutural está exibida abaixo:
Figura 2.5: Fórmula estrutural da prolina.

7. Os comportamentos cromatográficos (maior ou menor migração em relação
aos padrões) dos aminoácidos estão justificados abaixo:
ALANINA
A alanina é um aminoácido não polar e alifático. Apesar disso, o seu
pequeno grupo R (somente um grupo CH3), estando ligado diretamente ao
carbono-α, sofre polarizações devido à interação com a parte carregada do
aminoácido. Ignorar esse fato acabaria levando à conclusões erradas, ou
seja, acabaria levando à idéia de que a alanina iria subir bem mais durante a
cromatografia.
PROLINA
A prolina apresenta um comportamento de certa forma análogo ao da
alanina, mas isso acontece por ela ter uma cadeia cíclica (ver figura 2.5),
onde o carbono-δ está ligado diretamente ao grupo imino (NH2+), sendo
que a carga positiva desse também exerce influência sobre tal átomo de
carbono. Assim como acontece com a alanina, essa polarização da uma
parte da cadeia da prolina acaba gerando interações mais fortes com a
celulose (polar), o que faz com que ela suba menos.
LEUCINA
A leucina é a que tem a cadeia (grupo R) mais apolar de todas, estando
ela também no grupo de aminoácidos não polares e alifáticos. Isso justifica
o fato de ela ter subido mais do que todos os outros aminoácidos e
apresentar, portanto, o maior valor de Rf (razão de fluxo). A fórmula
estrutural da leucina está disponibilizada na figura 2.4.
HISTIDINA
A histidina difere dos três aminoácidos acima pois pertence ao grupo dos
aminoácidos com grupo R carregado positivamente. Assim como era
esperado, a sua polaridade evitou que ela subisse tanto durante a
cromatografia, justamente porque o meio imóvel (celulose) também é
apolar (ver estrutura da histidina na figura 2.3).