1. Indicadores Físicos,
Químicos y biológicos
para la Esterilización
Tecnología Farmacéutica II
1701 – Equipo 8
Bernal Albarrán Luis Daniel
Pérez Pérez José Manuel
Sánchez Flores Rosa María
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2. Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización 2008
Esterilización
La acción conseguida con la esterilización es la asepsia. Por tanto, un material aséptico es
un material estéril. Lo contrario es séptico que significa que está contaminado por virus,
bacterias y hongos. Con la esterilización se destruye toda forma de vida microbiana ya sea
vegetativa o de resistencia, por lo que no se puede utilizar sobre personas. Los objetos
que se someten a la esterilización son los utensilios críticos (instrumental quirúrgico,
sondas urinarias, implantes)
Esterilización Concepto estadístico
Cuando una población bacteriana es sometida a un proceso de esterilización que le
provoca la pérdida de la viabilidad, se observa una disminución progresiva en el número
de microorganismos sobrevivientes en función del tiempo de exposición al agente
esterilizante. La muerte microbiana sigue un comportamiento de tipo exponencial, por lo
que se hace asintótico y nunca se llega a un número de microorganismos igual a cero.
N = N0. e - Kt
Donde N es el número de microorganismos viables, N0 es el número de microorganismos
viables iniciales, k es la tasa de muerte (min-1) y t es el tiempo de exposición al agente. El
coeficiente k es función de las condiciones de esterilización (temperatura, tenor de
humedad, concentración del agente químico) y de la resistencia del microorganismo al
proceso de esterilización. Si esta ecuación se transforma a base 10 resulta:
N = N0. 10 - t / D
En donde D (min) se denomina Tiempo de reducción decimal, esto es el tiempo requerido
para reducir la población microbiana un 90% o un orden de magnitud. El valor de D se
deduce cuando t=D y por lo tanto N=0.1 N0. Comparando las ecuaciones anteriores se
llega a que:
D = ln 10 / K = 2.303 / K
Esto significa que D está inversamente relacionado con k. Entonces, menores valores de D
significan una mayor tasa de muerte o una muerte más rápida.
Graficando el logarítmo del número de microorganismos sobrevivientes en función del
tiempo de exposición a un determinado agente esterilizante se obtiene una recta. La
pendiente está dada por -1/D y la ordenada al origen es log N0. Por lo explicado
anteriormente, la pendiente de la recta está determinada por las condiciones de
esterilización y de la resistencia del microorganismo.
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3. Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización 2008
Cuando el log del número de
sobrevivientes es menor a cero se
habla de probabilidad de
sobrevivencia. Por lo tanto cuando el
valor de la probabilidad sea -1
significa que hay 0.1
microorganismos viables por unidad,
o correctamente expresado una
unidad contaminada por cada 10
unidades idénticas procesadas.
Un producto se considera estéril cuando la probabilidad de encontrar unidades
contaminadas es menor o igual a 10-6, esto es una unidad contaminada cada millón de
unidades idénticas procesadas.
A mayor número de microorganismos y/o resistencia de la población se necesitará mayor
tiempo de esterilización, o lo que es lo mismo mayor tiempo para alcanzar la probabilidad
de sobrevivencia.
Durante el proceso de esterilización por calor debe tenerse en cuenta que el tiempo de
esterilización comienza cuando se ha alcanzado la temperatura óptima en el interior del
aparato (autoclave o estufa) y que generalmente el contenido de un autoclave puede
requerir tiempos más largos para alcanzar la temperatura de esterilización.
Hay diferentes métodos de
esterilización: físicos (por
medio de calor seco o
húmedo) y químicos
(utilizando óxido de etileno,
glutaraldehído). Para
controlar la esterilización
existen indicadores físicos,
químicos y biológicos. De
todo ellos, es conocido el uso
de Bacillus
Estearothermophilus como
indicadores biológicos para comprobar el grado de esterilización en autoclave.
Controles de Esterilización
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4. Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización 2008
Son controles que se realizan sobre el método de esterilización. Monitorean o controlan si
el proceso de esterilización funciona correctamente. En la actualidad no es suficiente
someter los materiales al proceso de esterilización, sino que además se requiere cierto
grado de seguridad en la eficiencia del procedimiento. Los controles de esterilización se
pueden clasificar en tres grupos:
Controles físico-químicos
Controles de Monitorean el proceso de
Esterilización esterilización
Controles biológicos
Transferencia a medios de cultivo
Test de promoción del
Controles de crecimiento Monitorean el material
Esterilidad esterilizado
Test de bacteriostásis
Filtración por membranas
1. Monitores físicos:
Son elementos incorporados al esterilizador como termómetros, manómetros de presión,
sensores de carga, válvulas y sistemas de registro. Estos monitores físicos son de gran
utilidad, pero no son suficientes como indicadores de esterilización. Deben ser calibrados
periódicamente.
Métodos físicos se dividen en:
- Calor seco: flameado, incinerado y horno Pasteur.
- Calor húmedo: Tindalización (calentamiento tres veces), uperización (hasta 150º C
durante 1 a 20 segundos. Tratamiento de productos lácteos) y autoclave (vapor saturado a
presión).
- Radiaciones ionizantes: rayos X, rayos gamma y rayos ultravioleta (UV tiene una baja
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5. Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización 2008
capacidad de penetración. Destruye bacterias y esporas).
- Filtración: Los filtros no destruyen las formas vitales, sino que las separan del resto.
Ejemplos: filtros de Berkelfeld, de vidrio poroso, de membrana.
Filtración por Membranas
Se utiliza para determinar la esterilidad de medios de cultivo, soluciones de antibióticos,
etc. Se filtran los medios y se procesa el filtro como en un control de esterilidad para
determinar si hay microorganismos presentes.
2. Indicadores químicos:
Los indicadores químicos son productos comerciales consistentes en sustancias químicas
que cambian de color si se cumple un elemento clave del proceso de esterilización como
por ejemplo la temperatura necesaria; un indicador es una sustancia natural o sintética
que añadida a la muestra sobre la que se desea realizar el análisis produce un cambio
físico que es apreciable por los sentidos (generalmente, un viraje de color). Este cambio en
el indicador se produce debido a que durante el análisis se lleva a cabo un cambio en las
condiciones de la muestra e indica el punto final de la valoración. Algunos indicadores
requieren más de un parámetro como cierto tiempo de exposición y humedad para
cambiar de color. Pueden ser fabricados de papel especial, cintas autoadhesivas o
consistir en tubos de vidrio con líquidos especiales. Todos estos indicadores tienen la
desventaja que pueden reaccionar cambiando de color aún cuando no se han dado los
parámetros necesarios para obtener la esterilización. Los indicadores químicos son
diferentes de acuerdo al proceso utilizado (calor seco, húmedo o gas).
3. Indicadores biológicos:
Un indicador biológico es una preparación caracterizada de un microorganismo específico
resistente a un proceso de esterilización en particular. Los indicadores biológicos se
utilizan como auxiliares en la operación de la calificación física de aparatos de
esterilización, en el desarrollo y establecimiento de un proceso de esterilización validado
para un producto, en la verificación periódica de esterilización validada de un equipo,
materiales y componentes de empaque que se empleen en procedimientos asépticos y en
programas de verificación periódica de ciclos de esterilización previamente establecidos y
documentados.
Los indicadores biológicos pueden presentarse principalmente en dos formas en las cuales
se utiliza un cultivo de un microorganismo de una especie conocida. En una de las
presentaciones, las esporas de adicionan a un soporte (disco o tira de papel filtro, vidrio o
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6. Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización 2008
plástico) y se empaca tanto para mantener la integridad del soporte inoculado, como para
permitir que el agente esterilizante ejerza su efecto sobre el empaque individual. Otra
presentación es cuando las esporas se adicionan a unidades de lote por esterilizar
(producto sin inocular) o a unidades similares; el producto inoculado no afecta
negativamente las características de germinación de las esporas viables. Cuando el
producto por esterilizar es un líquido, en el cual no es práctico adicionar el indicador
biológico a las unidades seleccionadas, las esporas viables pueden agregarse a un
producto simulado cuya resistencia al proceso de esterilización no difiere a la presentada
por el producto por esterilizar.
Para utilizar efectivamente un indicador biológico, se precisa tener un conocimiento
completo del producto por esterilizar y de sus componentes (materiales y empaque) y
tener una idea general del número y tipos de microorganismos que constituyen la carga
microbiana presente en el inoculó inmediatamente antes de la esterilización. Cuando un
producto es más sensible a la esterilización se realiza una evaluación más extensa de la
carga microbiana. La selección del indicador biológico es crítica y requiere del
conocimiento de su resistencia al proceso específico de esterilización de tal manera que
cuando es utilizado bajo características de operación representa un desafío al proceso de
esterilización que excede al reto de la carga microbiana natural presente en el producto.
Las esporas seleccionadas para utilizarse como indicadores biológicos de un proceso en
particular, no necesariamente son adecuadas para emplearse en diferentes condiciones
del mismo o en otros procesos de esterilización.
Las características de un indicador biológico se definen utilizando aparatos especiales y
perfectamente calibrados, bajo condiciones estrictamente establecidas. Es importante
que todos los laboratorios usuarios de un indicador biológico dado tengan acceso a tales
aparatos. Las características de resistencia en condiciones de uso de un indicador
biológico pueden no ser idénticas a las mencionadas en la etiqueta, si se emplean
condiciones y aparatos de esterilización diferentes, el usuario averigua el efecto de tales
variaciones y utiliza apropiadamente el indicador biológico para el propósito requerido
como en la verificación periódica de ciclos de esterilización o en la validación de un
proceso de esterilización, esto es, certificar que la esterilización se llevo a cabo y con una
letalidad adecuada. No obstante en la mayoría de los casos, los ciclos de esterilización
pueden diseñarse usando como guía lo que indica la etiqueta y evaluando las
modificaciones necesarias debidas a las diferencias ya mencionadas en las condiciones de
esterilización del fabricante y del usuario. Mantener los aparatos y condiciones de
esterilización con especificaciones constantes de un ciclo de esterilización a otro para un
uso válido del indicador biológico.
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7. Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización 2008
En los procesos de esterilización por vapor a ciertas temperaturas, se emplean
comúnmente esporas de cepas apropiadas de Bacillus stearothermophilus (ATCC 7953),
debido a la resistencia que presentan a esta forma de esterilización. En los procesos de
esterilización por calor seco u óxido de etileno, se emplean comúnmente esporas de una
subespecie de Bacillus subtillis (ATCC 9372). Las esporas de cepas de Bacillus pumilus
(ATCC 27142), han sido utilizadas como indicadores biológicos para verificación periódica
de procesos de esterilización por radiaciones ionizantes.
La preparación de la suspensión concentrada de esporas de los microorganismos
seleccionados, requiere del desarrollo de procedimientos apropiados que incluyan cultivos
masivos, cosechas y mantenimiento de la suspensión de esporas. La suspensión
concentrada contiene predominantemente formas inactivas (no germinativas) que se han
mantenido en medios líquidos no nutritivos. Es necesario tomar precauciones para
asegurar que la preparación de! indicador biológico no altera sustancialmente la
resistencia al proceso de esterilización de los microorganismos indicadores. El
funcionamiento del indicador biológico depende tanto de la cuenta inicial de esporas
viables, como de su resistencia al proceso de esterilización. Es importante, por tanto, que
el indicador biológico mantenga su interdependencia entre el número de esporas viables y
las características de resistencia a través de su período de vigencia. Un indicador biológico
preparado a partir de esporas de una cepa microbiana en particular y que se pretende;
utilizar en una variedad de ciclos empleando el mismo método de esterilización, puede
tener diferentes presentaciones: una clase que contenga un número relativamente grande
de esporas por inoculo o acarreador, digamos 106 o 107, requiere que el grado de
exposición a la esterilización, esto es, el número de valores D aplicados se determinen por
la cuantía de la reducción de esporas viables a través de una cuenta real. Otros
indicadores biológicos contienen solamente el número de esporas requerido para indicar
que e! ciclo validado ha sido aplicado. El resultado final necesario sería presencia o
ausencia de crecimiento microbiano cuando se cultiva la preparación del indicador
biológico. No se realiza una cuenta de esporas particularmente. Otros indicadores
biológicos pueden tener cantidades altas o bajas para aplicaciones especiales particulares
para verificar periódicamente la esterilización por vapor de instrumental quirúrgico
esterilizado en emergencias en el quirófano, cada forma de indicador biológico ha sido
validado para cada aplicación.
INDICADORES BIOLÓGICOS EN TIRAS DE PAPEL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO.
Son Preparaciones de esporas viables obtenidas a partir de un cultivo derivado de una
cepa específica de Bacillus subtillis subespecie niger (ATCC 9372), impregnadas en una tira
de papel de calidad satisfactoria, (un papel de calidad adecuada puede ser un papel filtro
de velocidad de filtración media puro y derivado del algodón; cualquier grado de oscurecí-
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8. Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización 2008
miento sin desmenuzamiento no interfiere en su uso) empacadas
individualmente en un recipiente adecuado permeable al aire caliente, caracterizado
en su resistencia a la esterilización por calor seco y son empleados en programas para
calificar, validar y verificar periódicamente les ciclos de esterilización por calor seco
INDICADORES BIOLÓGICOS EN TIRAS DE PAPEL PARA ESTERILIZACIÓN POR VAPOR
Son preparaciones de esporas viables obtenidas a partir de un cultivo derivado de una
cepa especifica de Bacillus stearothermophilus impregnadas en una tira de papel de
calidad satisfactoria (un papel de calidad apropiada puede ser un papel filtro de
velocidad de filtración media, puro y derivado del algodón) empacadas
individualmente en un recipiente adecuado fácilmente permeable por el vapor, la
cepa se caracteriza por su resistencia a la esterilización por vapor. Estos indicadores son
empleados para calificar, validar y verificar periódicamente ciclos de esterilización por
vapor. Si el indicador biológico tiene una concentración de esporas declarada de 5 xlO-3
esporas a menos de 5 xlO6 esporas por tira y se sujeta a condiciones de esterilización por
vapor a I21°C ± 0,5°C tiene un valor D entre 1,3 y 1,9 min, un tiempo de sobrevivencia no
menor 3.9 min y un tiempo de muerte no mayor a 19 min. Si se tiene ora concentración
de esporas declarada y se sujeta el indicador a esterilización por vapor de 121°C ±
0,5°C tiene un valor D entre 1.3 min y 1,9 min y los tiempos de muerte y de sobrevivencia
que corresponden a los especificados en la Tabla 31 para varias concentraciones de
esporas. Si los indicadores son recomendados para temperaturas de esterilización
diferentes cumplen con las especificaciones anteriores cuando se sujetan a condiciones de
esterilización de 121 ± 0.5°C. Evaluar al indicador biológico en una cámara provista de
dispositivos que permitan verificar y controles que permitan regular la temperatura, el
tiempo y la presión de vapor. Evaluar al indicador biológico en una cámara provista de
dispositivos que permitan verificar y controles que permitan regular la temperatura, el
tiempo y la presión de vapor. El contenido de aire dentro de la cámara es
reemplazado completamente por vapor en un máximo de 10 s. hasta alcanzar una
temperatura de 121,5°C ± 0,5"C con la correspondiente presión de vapor saturado,
cuando la cámara se vacía se alcanza la presión atmosférica en no menos de 5 s
Determinación de los tiempos de sobrevivencia y de muerte: tomar 200 muestras del
indicador biológico cuatro recipientes adecuados, distribuirlos en la cámara de empaque
individual repartidas en números iguales en dos o cuatro recipientes adecuados de
esterilización, se calibra previamente a su uso con cámara expuestos a las condiciones de
esterilización establecidas. La esterilización en una posición específica para que estén los
recipientes pero sin muestras, durante por lo menos 60 min. Para realizar la prueba,
precalentar la cámara a la temperatura especificada, mantenerse así durante 5 min
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9. Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización 2008
Debe enfriarse la cámara y abrirse la puerta lo más pronto posible, una vez abierta la
puerta, introducir inmediatamente él o los recipientes con las muestras, esta operación no
dura mucho establecer la temperatura deseada y mantener ésta durante el tiempo
seleccionado por más de 5 s. Aumentar la presión hasta obtener la temperatura por un
período de exposición para la determinación de los tiempos de sobrevivencia y de muerte,
se selecciona dependiendo de la concentración de esporas para un indicador , una
temperatura de esterilización de 121°C± 0,5°C y un biológico con una concentración de
esporas de 1 x 106 por tira valor D de 1,6 mm, el tiempo de exposición es de 5 min,
transcurriendo éste, la cámara es enfriada lo más pronto posible, y el o
los recipientes con las 100 muestras se extraen. Para determinar el tiempo de
muerte, repetir el procedimiento inmediatamente con las 100 muestras
restantes, en caso de ser necesario precalentar la cámara. Para el ejemplo dado exponer
durante 16 min a la temperatura especificada. Terminado e! ciclo de prueba y de
transcurrir 1 h, sembrar las ultras en tubos que contengan 10 mL de caldo de soya-
tripticaseína . Incubar los tubos entre 55°C y 60°C y observarlos diariamente, hasta
completar siete días de incubación. La prueba es satisfactoria si todos los tubos
sembrados con las muestras expuestas para determinar el sembrados con las muestras
expuestas para determinar el tiempo de sobrevivencia muestran crecimiento específico de
Bacillus stearothermophilus y si en ninguno de los tubos inoculados con las tiras
empleadas para determinar tiempo de muerte presentan crecimiento.
Selección de indicadores para procesos de esterilización específicos.
La selección de un indicador biológico requiere el conocimiento de la resistencia del
sistema indicador biológico con respecto al proceso de esterilización específico. Se debe
establecer que el sistema indicador biológico ofrece mayor resistencia al proceso de
esterilización que la correspondiente a la carga microbiana natural presente en el
producto. El uso eficaz de indicadores biológicos en el ciclo de desarrollo, proceso y
validación del producto y en el control de la producción de rutina de un proceso de
esterilización requiere un profundo conocimiento del producto que se va a esterilizar y de
sus componentes. En el desarrollo o la validación de un proceso de esterilización solo se
deben usar los indicadores biológicos ampliamente reconocidos en la monografía del
indicador biología específico.
Calor húmedo: con frecuencia se utilizan esporas de cepas adecuadas de Bacillus
stearothermophilus, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis y Bacillus coagulans.
Calor seco: Algunas veces se emplean esporas de Bacillus subtillis.
Radiación ionizante: las esporas de Bacillus pumilus se han usado para controlar los
procesos de esterilización que emplean radiación ionizante; sin embargo, esta practica se
esta abandonando.
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Óxido de etileno: habitualmente se emplean esporas de una subespecie de Bacillus
subtilis.
Peroxido de hidrógeno en fase de vapor: Bacillus sterothermophilus es el indicador
biológico mas utilizado para validar el proceso.
Transferencia Directa a Medios de Cultivo
Se transfiere una parte de la muestra a medios de cultivos apropiados que permitan el
crecimiento de cualquier contaminante.
Tioglicolato para anaerobios y aerobios (37°C).
Soya-Tripticaseína para aerobios (25°C).
Las muestras representativas se incuban en estos medios durante un período de 14 días,
al cabo del cual no se debe observar ningún tipo de crecimiento.
Puede ocurrir que la muestra no se encuentre estéril pero que no se produzca crecimiento
durante la incubación por algún motivo inherente al medio o a la muestra, por ejemplo
presencia de algún inhibidor, etc.
Promoción del Crecimiento
Es un testigo del control de esterilidad. Son testigos que se utilizan para los medios de
crecimiento del control ya que estos medios tienen capacidad de promover el
crecimiento. Para estos testigos se utilizan microorganismos con exigencias nutricionales.
Los medios deben ser inoculados con un bajo número de microorganismos, se incuban
durante 7 días, al cabo de los que se debe observar un abundante crecimiento.
Observación e interpretación de resultados.
A intervalos durante el periodo de incubación, y al momento de su finalización, examinar
los medios en busca de evidencias macroscópicas de crecimiento microbiano. Si no se
hallan evidencias de crecimiento bacteriano, el producto examinado cumple con la prueba
d esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no
cumple con la prueba d esterilidad, a menos de que pueda demostrarse claramente que la
prueba resulto invalida por causas no relacionadas con el producto examinado. La prueba
puede considerarse inválida solo si se cumplen una o más de las siguientes condiciones:
Los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para pruebas de esterilidad
demuestran una falla.
Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba en cuestión revela una
falla.
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11. Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización 2008
Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el
crecimiento de esta especie (o especies) puede atribuirse de manera equivoca a fallas con
respecto al material o a la técnica usados al realizar el procedimiento de la prueba de
esterilidad.
Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo numero de unidades de la
prueba original. Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida,
el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas de
crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la
prueba d esterilidad.
Bacteriostásis
Es un control que se realiza para determinar si la muestra supuestamente estéril no posee
propiedades bacteriostáticas. De esta forma se previenen falsos negativos pues no se
produce crecimiento habiendo en la muestra microorganismos viables. Para este test se
toman los medios de cultivo con microorganismos de ensayo y se siembran en las
muestras a testear. Se incuban durante 7 días. Si se produce crecimiento esto indica que el
material no contenía inhibidores.
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