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Spectrophotomètre

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Spectrophotomètre
Master Spécialisé Systèmes Embarqués et Ingénierie
Biomédical
2019/2020
sommaire
Interaction LUMIERE– MATIERE
01
Définition et présentation du
spectromètre
02
Utilisation du spectrophotomètre
03
Mesure de l’absorbance avec
spectrophotomètre
04
Loi de Beer-Lambert
05
Application
06
Introduction
Conclusion
Introduction
Au sein d’un établissement hospitalier, le laboratoire
représente un des secteurs majeurs et certainement
l’un des plus emblématiques . Le laboratoire se
compose de plusieurs services et est constitué d’une
diversité de dispositifs médicaux, les différents services
sont :
 Service de biologie.
 Service de biochimie.
 Service d’Hématologie.
1. Interaction Lumière – Matière
 La spectrophotométrie est l’étude quantitative des interactions entre la lumière et la matière.
 La lumière traverse une substance, elle est en partie transmise et en partie absorbée.
 Si une substance absorbe dans le domaine visible (400nm<λ0<800nm), alors elle est colorée.
 Eclairée par de la lumière blanche, elle prendra la couleur des radiations
qui parviennent à traverser, couleurs complémentaires des couleurs absorbées.
Lecture du cercle chromatique :
 Les couleurs sont placées par ordre croissant de longueur d’onde le long du cercle.
 Deux couleurs complémentaires se trouvent l’une en face de l’autre.
La spectrophotométrie est une méthode d'analyse qui permet de déterminer l'absorbance d'une substance chimique en solution.
L'absorbance d'une substance chimique dépend de la nature et de la concentration de cette substance ainsi que de la longueur
d'onde à laquelle on l'étudie.
Master SEIB 3
1. Interaction Lumière – Matière
Master SEIB 4
Lumière
VISIBLE
Infra
rouge
Ultra
violet
Rayons
X
Rayons
Gamma
Rayonnement
radio
SPECTRE DES ONDES ÉLECTROMAGNÉTIQUES
2. Définition et présentation du spectromètre
C’est un appareil mesurant la quantité de lumière absorbée ou bien transmise par une solution, pour des longueurs d’onde
données. Afin de permettre de tracer des courbes d’analyses spectrales utilisées pour étudier la composition de solutions, de
déterminer la concentration de solutions ou de suivre l’apparition d’une espèce chimique colorée au cours du temps.
 Nous mesurons la valeur de l’ « absorption » appelée plus précisément absorbance (appelée aussi densité optique) pour une
longueur d’onde choisie, notée A qui est définie par :
A = log10 (I0/Is)
avec I0 = intensité lumineuse du faisceau à l’entrée de la cuve et Is son intensité à la sortie de la cuve
A n’a pas d’unité.
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  • 1. Spectrophotomètre Master Spécialisé Systèmes Embarqués et Ingénierie Biomédical 2019/2020
  • 2. sommaire Interaction LUMIERE– MATIERE 01 Définition et présentation du spectromètre 02 Utilisation du spectrophotomètre 03 Mesure de l’absorbance avec spectrophotomètre 04 Loi de Beer-Lambert 05 Application 06 Introduction Conclusion
  • 3. Introduction Au sein d’un établissement hospitalier, le laboratoire représente un des secteurs majeurs et certainement l’un des plus emblématiques . Le laboratoire se compose de plusieurs services et est constitué d’une diversité de dispositifs médicaux, les différents services sont :  Service de biologie.  Service de biochimie.  Service d’Hématologie.
  • 4. 1. Interaction Lumière – Matière  La spectrophotométrie est l’étude quantitative des interactions entre la lumière et la matière.  La lumière traverse une substance, elle est en partie transmise et en partie absorbée.  Si une substance absorbe dans le domaine visible (400nm<λ0<800nm), alors elle est colorée.  Eclairée par de la lumière blanche, elle prendra la couleur des radiations qui parviennent à traverser, couleurs complémentaires des couleurs absorbées. Lecture du cercle chromatique :  Les couleurs sont placées par ordre croissant de longueur d’onde le long du cercle.  Deux couleurs complémentaires se trouvent l’une en face de l’autre. La spectrophotométrie est une méthode d'analyse qui permet de déterminer l'absorbance d'une substance chimique en solution. L'absorbance d'une substance chimique dépend de la nature et de la concentration de cette substance ainsi que de la longueur d'onde à laquelle on l'étudie. Master SEIB 3
  • 5. 1. Interaction Lumière – Matière Master SEIB 4 Lumière VISIBLE Infra rouge Ultra violet Rayons X Rayons Gamma Rayonnement radio SPECTRE DES ONDES ÉLECTROMAGNÉTIQUES
  • 6. 2. Définition et présentation du spectromètre C’est un appareil mesurant la quantité de lumière absorbée ou bien transmise par une solution, pour des longueurs d’onde données. Afin de permettre de tracer des courbes d’analyses spectrales utilisées pour étudier la composition de solutions, de déterminer la concentration de solutions ou de suivre l’apparition d’une espèce chimique colorée au cours du temps.  Nous mesurons la valeur de l’ « absorption » appelée plus précisément absorbance (appelée aussi densité optique) pour une longueur d’onde choisie, notée A qui est définie par : A = log10 (I0/Is) avec I0 = intensité lumineuse du faisceau à l’entrée de la cuve et Is son intensité à la sortie de la cuve A n’a pas d’unité. Master SEIB 5
  • 7. 2. Définition et présentation du spectromètre Exemple d’utilisation du spectrophotomètre :  En biochimie il est utilisé lors de la purification de protéines, pour les quantifier et déterminer leur niveau de pureté .  En médecine L'analyse de différentes enzymes sanguines, dosage de la phosphatase alcaline : cholestase , infarctus du myocarde, hémolyse.  En chimie L'analyse de l'absorption des solutions à une longueur d'onde donnée permet le dosage de ces solutions selon la loi de Beer-Lambert Le suivi dans le temps de l'absorption est une méthode de caractérisation de la vitesse de réactions chimiques (cinétique). Master SEIB 6
  • 8. 2. Définition et présentation du spectromètre Types des spectrophotomètres :  Spectrophotomètre monofaisceau –monocanal  Spectrophotomètre double faisceau –monocanal  Spectrophotomètre monofaisceau-multicanal : Master SEIB 7
  • 9. 2. Définition et présentation du spectromètre • Spectrophotomètre monofaisceau –monocanal : Il comporte un monochromateur ( en général un réseau par réflexion suivi d’une fente) qui permet de n’envoyer vers l’échantillon qu’un intervalle de longueurs d’onde très étroit ( communément de l’ordre du nm )appelé la " bande passante ". Grâce à un miroir réfléchissant, une partie de la puissance est envoyée vers un premier capteur, une partie égale vers l’échantillon. Le faisceau transmis par l’échantillon absorbant est reçu par un capteur n°2 ( photodiode par exemple) Types des spectrophotomètres : Master SEIB 8
  • 10. 2. Définition et présentation du spectromètre • Spectrophotomètre double faisceau –monocanal : Le faisceau issu de la source est envoyé vers un monochromateur puis vers un rupteur qui envoie alternativement le faisceau vers la cuve de référence puis vers la cuve contenant l’échantillon. Un système de miroir permet d’envoyer ces deux faisceaux vers le même capteur qui reçoit donc alternativement le faisceau de puissance Po de référence et le faisceau de puissance P transmis par l’échantillon. Le signal du capteur est alors traité par un microprocesseur qui permet d’afficher l’absorbance. Types des spectrophotomètres : Master SEIB 9
  • 11. 2. Définition et présentation du spectromètre • Spectrophotomètre monofaisceau-multicanal : Ce type d’appareil ne comporte pas de monochromateur. La lumière de la source est envoyée sur la cuve qui en transmet une partie vers un réseau. Le réseau disperse cette lumière. L’intérêt d’un tel dispositif est que la mesure de la puissance transmise se fait instantanément sur l’ensemble du spectre de longueurs d’onde. Types des spectrophotomètres : Master SEIB 10
  • 12. 2. Définition et présentation du spectromètre Absorbance d’une solution  L’absorbance d’une solution, notée A, est une grandeur physique qui mesure la quantité de lumière absorbée en fonction de la lumière qui traverse un échantillon de solution.  L’absorbance n’a pas d’unité et qui dépend de la longueur d’onde de la lumière et de la concentration de l’espèce colorée de la solution.  L’absorbance d’une solution se mesure à l’aide d’un spectrophotomètre. Master SEIB 11
  • 13. 3. Utilisation du spectrophotomètre Appareillage CUVE SPECTROPHOTOMÈTRE Master SEIB 12
  • 14. 3. Utilisation du spectrophotomètre Appareillage Un spectrophotomètre UV-Visible est constitué : - d’une source lumineuse ; - d'une cellule de mesure ; - d’un sélecteur de longueur d’onde ou monochromateur ; - d’un système de mesure de l’intensité lumineuse ou détecteur ; - d’un dispositif d’affichage et de traitement du signal Master SEIB 13
  • 15. 3. Utilisation du spectrophotomètre - Sources lumineuses: Beaucoup de spectromètres comportent deux lampes à usage de sources: • une lampe à arc au deutérium sous moyenne pression pour la partie UV (<350 nm). • une lampe à incandescence avec un filament de tungstène et une enveloppe de verre de silice (quartz) pour la partie visible du spectre (à partir de 350 nm). Appareillage Master SEIB 14
  • 16. 3. Utilisation du spectrophotomètre - Sélecteur de longueurs d’onde Le monochromateur, est un système qui permet d’extraire de la lumière émise par la source et de sélectionner les longueurs d’onde du spectre. Il est constitué d’une fente d’entrée, d’un système de dispersion et d’une fente de sortie Appareillage Master SEIB 15
  • 17. 3. Utilisation du spectrophotomètre - Cellules La cellule d’analyse se présente sous forme de parallélépipède à base carrée de 1 cm ayant deux faces opposées . On utilise des cuves en plastique transparent ou en verre ordinaire , destinées aux mesures dans le domaine du visible et des cuves en quartz pour les mesures dans le domaine de l’ultraviolet. - Détecteurs Le signal lumineux est convertit en signal électrique à l’aide d’un détecteur photo électrique. On utilise soit un tube photomultiplicateur, soit un semi-conducteur (détecteur à transfert de charge ou photodiode au silicium). Appareillage Master SEIB 16
  • 18. Principe L'intensité de la lumière monochromatique émise (I0) est connue. un faisceau parallèle de lumière (flux de lumière/ radiation lumineuse) monochromatique d’intensité I0 traversant une solution absorbante de concentration C sur une longueur de cuve de 1 cm. L’intensité du faisceau émergeant est P . On définit la transmittance par: NB : Po ou I désigne la même notion : intensité 3. Utilisation du spectrophotomètre Master SEIB 17
  • 19. Principe Une fois le détecteur mesure le flux lumineux en sortie. L’absorbance est directement affichée sur un écran du spectrophotomètre. 3. Utilisation du spectrophotomètre Master SEIB 18
  • 20. Influence de la longueur d'onde La courbe ci-dessous donne le spectre d’absorption d’une solution de diiode de concentration molaire 10–4 mol.L–1 (dans l'iodure de potassium à 0,1 mol.L-1 ) en fonction de la longueur d’onde de la lumière monochromatique. 3. Utilisation du spectrophotomètre L’absorbance dépend de la longueur d’onde de la lumière. Le maximum d’absorption du diiode se situe autour de λ = 350 nm, ce qui explique la coloration jaune de la solution (absorption dans l’ultraviolet). Master SEIB 19
  • 21. Réglage du zéro pour que la diminution de l'intensité lumineuse ne provienne que de l'espèce colorée à étudier, il faut éliminer toutes les autres causes d’absorption. Pour s'affranchir de tous ses paramètres, on étalonne le spectrophotomètre en effectuant le réglage du zéro avec une cuve contenant le solvant et les espèces autres que celle à étudier. Cette solution s'appelle un blanc. Variation de la longueur d’onde d’étude Courbe absorbance A partir d'une série de variation de longueur d’onde on trace la courbe de l’absorbance du solution en fonction des longueurs d’onde Afin de pouvoir calculer la concentration d’une solution , la mesure de son absorbance est obligatoire . Il faut travailler en étapes : 4. Mesure de l’absorbance avec spectrophotomètre Absorbance maximale A En remarquant la courbe on détermine l’absorbance maximale , qu’on pourra placer pour vérifier la loi de Bert Lambert afin de calculer la concentration Master SEIB 20
  • 22. 4. Mesure de l’absorbance avec spectrophotomètre Master SEIB 21
  • 23. max  650 nm Spectre d’absorption Couleur absorbée bande d’absorption 4. Mesure de l’absorbance avec spectrophotomètre Exemple 1 : Master SEIB 22
  • 24. max  430 nm bande d’absorption Spectre d’absorption Couleur absorbée 4. Mesure de l’absorbance avec spectrophotomètre Exemple 2 : Master SEIB 23
  • 25. 5. La loi de Beer-Lambert La valeur de l’absorbance A dépend de la concentration C de l’espèce colorée. Influence de la concentration La courbe donne le spectre d’absorption d’une solution de diiode en fonction de sa concentration molaire, pour une longueur d’onde fixée de λ = 400 nm. L’absorbance de la solution est proportionnelle à la concentration en diiode jusqu’à une valeur limite de l’ordre de 10-1 mol.L-1. Master SEIB 24
  • 26. 5. La loi de Beer-Lambert Loi de Beer-Lambert l’absorbance dépend aussi de l’épaisseur l de l’échantillon traversée par le flux lumineux. L’absorbance A est donc proportionnelle à la concentration C et à l’épaisseur l de la cuve. La relation entre l’absorbance A et la concentration C en espèce colorée est : Master SEIB 25
  • 27. Conditions de validité de la loi de Beer-Lambert  la lumière utilisée est monochromatique  la concentration n'est pas trop élevée : c ≈ 10-2 mol.L-1 en général pour que les interactions entre molécules soient négligeable NB : Il faut travailler en lumière monochromatique car ε est fonction de la nature du corps absorbant, de la température et de la longueur d'onde. Pour avoir une bonne sensibilité, il faut déterminer la longueur d'onde que la solution absorbe le plus, c'est à dire la longueur d'onde dont la teinte est complémentaire de celle de la solution. 5. La loi de Beer-Lambert Master SEIB 26
  • 28. • la solution est violette • La solution absorbe tout sauf le bleu et le rouge • la solution absorbe le vert 6. Application Permanganate de Potassium Master SEIB 27
  • 30. • - Spectre du Permanganate de Potassium  Pour chaque longueur d’onde du spectre de la lumière blanche, l’absorbance de la solution.  On peut déterminer la valeur maximale de l’absorption : λmax.  Pour le permanganate de potassium, on a une valeur de 520 nm située dans le domaine du vert.  Cela est normal puisque la solution de permanganate apparaît magenta et absorbe au maximum dans sa couleur complémentaire qui est le vert. 6. Applications Master SEIB 29
  • 31. • - Déterminer la concentration A partir de l’absorbance, on peut déterminer la concentration en espèce colorée d’une solution. Il y a plusieurs possibilités pour déterminer la concentration d’une solution colorée :  L'échelle de teintes En effet, plus la solution est concentrée en espèce colorée et plus elle est foncée. On le voit ici avec C1, C2, C3, C4. La concentration augmente de droite à gauche. On n'aura pas la valeur exacte de la concentration, mais juste un encadrement. Pour avoir la valeur exacte, on utilise la loi de Beer-Lambert et l’absorbance. 6. Applications Master SEIB 30
  • 32. • - Déterminer la concentration  Loi de Beer-Lambert Pour chaque concentration, on mesure l’absorbance A1, A2, A3, A4. On mesure l’absorbance en fixant la longueur. Ensuite, on trace la courbe qui représente l’absorbance en fonction de la concentration et on obtient une droite qui passe par l’origine. C’est la loi de Beer-Lambert. 6. Applications Master SEIB 31
  • 33. Conclusion • La spectroscopie d’absorption dans les régions de l’ultraviolet (UV) et le visible du spectre électromagnétique a été largement utilisée dans l’analyse pharmaceutique et biomédicale à des fins quantitatives pour la caractérisation des médicaments, impuretés. • la possibilité d’avoir la non fiabilité des résultats à causes des effets de lumière parasite et le type de solvant peuvent également conduire à un non-respect de la loi Beer-Lambert. • On ne peut pas utiliser le spectrophotomètre pour un grand nombre d’échantillons.
  • 34. M e rc i p o u r votre attention

Notes de l'éditeur

  1. Un spectrophotomètre est un appareil de laboratoire Le laboratoire se compose de plusieurs services et est constitué d’une diversité de dispositifs médicaux, les différents services sont : Service de biologie. Service de parasitologie. Service de biochimie. Service d’Hématologie.
  2. , elle prendra la couleur des radiations qui parviennent à traverser, couleurs complémentaires des couleurs absorbées. Il s’agit de transitions électroniques. La spectrophotométrie permet l'étude de solutions colorées dans l'infrarouge (1 100 nm au maximum), dans le visible et dans l'ultraviolet (190 nm).
  3. Chaque photosite du capteur ne reçoit qu’un très petit intervalle de longueur d’onde l ± d l sur lequel il mesure la puissance Po(l )lorsque la cuve contient la référence ou P(l ) lorsque la cuve contient l’échantillon.
  4. Une solution colorée absorbe une partie de la lumière qui la traverse.
  5. Sources : UV : lampe à deutérium visible : lampe à incandescence
  6. Sources : UV : lampe à deutérium visible : lampe à incandescence
  7. Sources : UV : lampe à deutérium visible : lampe à incandescence La lampe à arc xénon qui couvre tout le domaine de 200 à 1100nm, est utilisée pour les appareils de routine. Cette source plus énergétique est souvent utilisée. Elle est choisie comme source unique par les constructeurs lorsqu'il s'agit d'un appareil de routine allant de 300 à 1100nm.
  8. Le spectrophotomètre est un appareil permettant de mesurer l’absorbance d’une solution, pour différentes longueurs d’ondes. Pour cela, il fait passer un rayon d’une longueur d’onde choisie à travers une cuve contenant la solution à étudier (figure I.16). Les molécules de la solution absorbent plus ou moins le rayon lumineux, on définit alors l’absorbance pour cette longueur d’onde
  9. Plus la concentration diminue et plus le spectre s’étale. Donc, si on ne se met pas à la longueur d’onde du maximum d’absorption, au bout d’une certaine concentration on aura des valeurs qui seront trop faibles à exploiter