El documento trata sobre la enzima lacasa y su potencial para degradar compuestos fenólicos como el fenol. La lacasa es una enzima producida por hongos y bacterias que puede oxidar una variedad de sustratos aromáticos. Se ha estudiado su uso para la degradación de compuestos fenólicos en efluentes industriales debido a su alta especificidad y versatilidad. La lacasa es más estable a pH alcalinos y puede conservar su actividad en un amplio rango de pH y temperatura.

1. INTRODUCCIÓN
La enzima lacasa se encuentra ampliamente distribuida en plantas y hongos
degradadores de la lignina, lo que permite suponer que la lacasa cumple un papel
importante en la madera y en la delignificación de la pulpa. Bajas concentraciones
de varias lacasas se producen en la madera y en cultivos de hongos sumergidos,
mientras que altas concentraciones son inducidas por la adición de compuestos
aromáticos como la xilidina y el ácido ferúlico
Las lacasas son glicoproteínas producidas por algunos hongos y bacterias,
que catalizan la oxidación de diferentes compuestos fenólicos. Son enzimas
excepcionalmente versátiles, que pueden ser empleadas en diversos procesos
industriales (bioblanqueo y depuración de los efluentes de industrias papeleras,
degradación de compuestos fenólicos contaminantes, etc).
Los fenoles son sustancias tóxicas frecuentemente encontradas en los
ambientes acuáticos como resultado de la contaminación a partir de una gran
variedad de fuentes (industriales, biogeoquímicos, degradación de pesticidas,
entre otras). La alta toxicidad de los compuestos fenólicos ha hecho que la
Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de América (USEPA) y
la Comunidad Económica Europea, los consideren como contaminantes
prioritarios. En tal sentido, la remoción de fenoles de las aguas residuales
industriales tiene gran importancia ambiental.
La degradación de los compuestos fenólicos puede ser llevada a cabo por
organismos procariotas y eucariotas, tanto en condiciones aeróbicas (oxígeno
como aceptor final de electrones) como anaeróbicas (nitrato, sulfato, iones
metálicos o dióxido de carbono como aceptores finales de electrones
De los muchos métodos existentes aplicables para la degradación de fenol, el
tratamiento biológico empleando la lacasa es especialmente recomendable porque
tiene un potencial capaz de degradar casi completamente el fenol generándose
productos finales inocuos.
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2. MARCO TEÓRICO
Gianfreda et al. (1999) reportan que la lacasa (p-difenol:oxígeno oxidorreductasas)
son glicoproteínas extracelulares que contienen cobre y un peso molecular en el rango de
60.000 y 80.000. Tienen la capacidad de reducir el oxígeno molecular a dos moléculas de
agua y simultáneamente, trabajan en la oxidación de un electrón de muchos sustratos
aromáticos. El rango de sustratos oxidables es amplio, e incluye polifenoles, monofenoles,
aminas aromáticas y otros compuestos aromáticos fácilmente oxidables.
Generalmente las lacasas son más estables en pH alcalinos que en pH ácidos, lo
cual se debe probablemente a la inhibición del grupo hidróxido sobre el proceso de auto-
oxidación. Las lacasas también se pueden inactivar por la pérdida de los átomos de cobre o
por condiciones de proteólisis o desnaturalización, entre otras. En condiciones idénticas,
las lacasas termófilas generalmente son más termoestables que las lacasas mesófílas.
Las lacasas conservan su actividad en un rango de pH de 3 a 10 y en un
rango de temperatura de 5 a 55 °C. La formación de las lacasas amarillas-marro-
nes es el resultado del enlace de moléculas derivadas de la lignina a la proteína de
la enzima. Esto sucede en cultivos de fermentación en estado sólido, y no pre-
sentan el espectro típico de las oxidasas.
Son enzimas del tipo fenol-oxidasa dependiente de cobre que tiene la
capacidad de catalizar reacciones de desmetilación. Este es un paso importante en
la biodegradación de polímeros que contengan grupos aromáticos fenólicos.
Debido a esta propiedad, la lacasa es utilizada en la oxidación del índigo
(colorante de tipo fenólico) en la preparación de telas para jeans. Esta enzima es
extraída de hongos, como Trametes hirsuta y Sclerotium rolfsii .
Además, en procesos de oxidación de muchos compuestos (principalmente de
compuestos fenólicos) la lacasa presenta una gran especificidad para un gran
número de compuestos no biodegradables, por lo cual se empezó a utilizar en
tratamientos de efluentes industriales.
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3. El fenol es un constituyente común de las aguas residuales originarias de
varias industrias. Es tóxico aun a bajas concentraciones y es por ello que son
necesarios métodos de tratamiento eficientes para reducir la concentración de
fenol en las aguas residuales a niveles aceptables. De los muchos métodos
existentes aplicables para la degradación de fenol, el tratamiento biológico es
especialmente recomendable porque tiene un potencial capaz de degradar casi
completamente el fenol generándose productos finales inocuos. El pentaclorofenol
es el más tóxico de los clorofenoles y el trinitrofenol (ácido pícrico) es el
compuesto más tóxico de los nitrofenoles.
Denominaciones:
N° CAS: 108-95-2 Nombre registrado: Fenol
Nombre químico: Fenol
Sinónimos/nombres comerciales: Ácido fénico, ácido carbólico, hidroxibenceno,
monohidroxibenceno, hidróxido de fenilo, ácido fenil
Nombre químico (inglés): Phenol, carbolic acid, hydroxybenzene, oxybenzene,
monohydroxybenzene, phenic acid, phenyl hydrate, phenyl hydroxide, phenyl
acid
Aspecto general: Sustancia incolora a blanco rosado o masa fundida incolora; de
olor dulzón.
Datos físico-químicos básicos:
Fórmula empírica: C6H6O
Masa molecular relativa: 94,11 g
Densidad: 1,07 g/cm3
a 20 C
Densidad relativa del gas: 3,24
Punto de ebullición: 181,75°C
Punto de fusión: 40,8°C
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4. Presión de vapor: 0,2 hPa a 20°C
3,5 hPa a 50°C
54 hPa a 100°C
Punto de inflamación: 82°C
Temperatura de ignición: 595°C
Límites de explosividad: 1,3-9,5% V
Umbral de olor: 0,18 mg/m3
= 0,046 ppm
Solvólisis:
En agua: 82 g/l; se disuelve
fácilmente en alcohol, éter,
cloroformo, grasas y aceites
esenciales.
Factores de conversión: 1 ppm = 3,91 mg/m3
1 mg/m3
= 0,26 ppm
Los vapores y líquidos del fenol son tóxicos y pueden ingresar fácilmente
al cuerpo por vía cutánea de los seres humanos. Los vapores inhalados lesionan
las vías respiratorias y el pulmón. El contacto del líquido con la piel y los ojos
produce severas quemaduras (el fenol es un poderoso tóxico protoplasmático). La
exposición prolongada paraliza el sistema nervioso central y produce lesiones
renales y pulmonares. La parálisis puede desembocar en la muerte. Los síntomas
que acompañan la afección son cefalalgias, zumbido en los oídos, mareos,
trastornos gastrointestinales, obnubilación, colapso, intoxicación, pérdida del
conocimiento, respiración irregular, paro respiratorio (apnea), paro cardíaco y, en
algunos casos, convulsiones. Según HORN (1989), el fenol ejerce efectos
teratógenos y cancerígenos. Según el ensayo Ames, el fenol carece de potencial
mutagénico.
En el medio ambiente el fenol incide notablemente en:
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5. Agua: El fenol es más pesado que el agua y se hunde. Se disuelve lentamente y
forma, incluso en dilución soluciones tóxicas, y se encuadra en el grupo de
sustancias clasificadas como "Amenaza para el agua" debido a su considerable
toxicidad en este medio.
Aire: Los vapores son más pesados que el aire y, expuestos al calor, forman
mezclas explosivas. La oxidación del fenol en el aire se acelera por efecto de la
luz o de impurezas que actúan como catalizadores.
Suelo: Debido a la degradación microbiana (aeróbica o anaeróbica) la
acumulación de fenol en el suelo es escasa; el nivel de esta acumulación depende
de la presencia de minerales arcillosos (gran afinidad con el óxido de aluminio).
Cadena alimentaria: Se produce poca acumulación en los alimentos. Los
fumadores están más expuestos, porque el humo del cigarrillo contiene fenoles.
La presencia de fenol en aguas subterráneas también contamina el agua potable, la
que ya no se podrá consumir debido a su sabor desagradable.
ESTUDIOS REALIZADOS
Actualmente, los estudios van dirigidos a la búsqueda de nuevas lacasas con
mayor estabilidad, y, sobre todo, al empleo de enzimas inmovilizadas. La
inmovilización no solo contribuye a la estabilización de la proteína, sino que
facilita la reacción enzimática a gran escala. Los soportes empleados para ello son
muy diversos: celulosas modificadas, chitosano, carbón activado, perlas de vidrio,
entre otros. La unión se puede efectuar a través de enlaces covalentes con el
soporte o con un agente entrelazante, o bien por adsorción iónica a la matriz.
En 1997 Muñoz et al. caracterizaron las iso-enzimas I y II de lacasa a partir
de P. eryngii, y reportaron que éstas eran glicoproteínas monoméricas con 7 y 1%
de carbohidratos y peso molecular de 65 y 61 KDa. La tasa de oxidación más alta
del ABTS (Acido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolin -6-sulfónico) con la lacasa I se
obtuvo a 65 °C y pH 4. En el caso de la lacasa II ocurrió a 55 °C y pH 3. En este
mismo estudio se reportó que las dos isoenzimas fueron estables a pH alto (8-12),
manteniendo una actividad del 60 al 70% después de 24 horas. Ensayos con
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6. anticuerpos contra lacasa I reaccionaron con lacasa II, junto con lacasas de P.
ostreatus y P. pulmonaris.
Biorremediación enzimática de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) en
vertidos marinos. (Miguel Alcalde Galeote)
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) son un grupo de
xenobióticos muy peligroso (mutagénicos, carcinogénicos y teratogénicos) que se
encuentran distribuidos ampliamente en ambientes terrestres y acuáticos. Las
principales fuentes de emisión proceden de vertidos marinos (el 52,7% del
contenido total del fuel del buque Prestige fueron PAHs), los motores de los
vehículos, procesos industriales o incendios forestales. Las últimas tendencias en
eliminación de PAHs apuntan a la combinación de métodos químicos y biológicos
como tratamiento de choque para la oxidación de estos nocivos compuestos. Sin
embargo, los PAHs de alto peso molecular (los más recalcitrantes y nocivos) no
pueden ser biodegradados con éxito por las poblaciones bacterianas, ya sean
autóctonas o introducidas, en aplicaciones in situ o ex-situ (bio-reactores). El
único grupo de organismos conocidos capaces de oxidar eficazmente PAHs de
alto peso molecular (más de 4 anillos aromáticos) son los hongos de la
podredumbre blanca. Estos organismos no se han implantado con éxito todavía en
procesos de biorremediación a gran escala, debido a numerosos factores. Una
reciente tecnología química en constante desarrollo es la utilización de
biocatalizadores (enzimas) en biotratamiento de PAHs. De las enzimas secretadas
por los hongos de la podredumbre blanca, la enzima multicobre lacasa es el
sistema más prometedor y versátil en la oxidación de PAHs. Se proponemos la
utilización de lacasas fúngicas en detoxificación de PAHs, tanto de alto como de
bajo peso molecular, presentes en vertidos marinos y aguas residuales. La
dependencia de mediadores redox y la inestabilidad de la lacasa han limitado su
aplicación práctica. Por ello, el estudio de la lacasa en detoxificación de PAHs
será abordada desde tres vertientes principales:
1.- Ingeniería del biocatalizador por evolución molecular dirigida (mutagénesis
aleatoria o recombinación y screening) para aumentar la estabilidad de la enzima
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7. frente a disolventes orgánicos. El principal problema en biorremediación es la
biodisponibilidad de los xenobióticos. La presencia de disolventes aumentaría la
solubilidad de los PAHs y por ende disminuiría los problemas de transferencia de
masa.
2.-El incremento del potencial redox del biocatalizador aumentará la velocidad de
oxidación de PAHs por la lacasa y la hará menos dependiente de mediadores. Se
realizará la construcción de genotecas combinatorias mediante mutagénesis
saturada, buscando aumentar el potencial de ionización de la lacasa.
3.-Se inmovilizará el biocatalizador en soportes acrílicos y se diseñará un bio-
reactor de lecho fijo donde se harán pruebas con efluentes contaminados con
PAHs y fuel donado por la compañía petroquímica Repsol-YPF (quien apoya la
candidatura de esta propuesta).
Remoción de contaminantes en aguas artificialmente contaminadas utilizando
lacasa producida por Pleurotus ostreatus. (María del Rosario Castro Oropeza)
Los efluentes líquidos son residuos líquidos o residuos líquidos mezclados
con sólidos. Desde el punto de vista de su origen, resultan de la combinación de
los líquidos o desechos arrastrados por el agua, procedentes de las viviendas,
instituciones y establecimientos comerciales e industriales, más las aguas
subterráneas, superficiales o de precipitación que pudiera agregarse. Los efluentes
industriales vertidos al medio ambiente provocan diferente impacto sobre éste en
función de su naturaleza. El color pocas veces considerado una forma de
contaminación a pesar de los daños que provoca, puede estar asociado a la
presencia de compuestos tóxicos y grupos cromóforos o polímeros. Uno de los
hongos de la podredumbre blanca capaz de mineralizar una gran variedad de
hidrocarburos aromáticos policíclicos es Pleurotus ostreatus. Este hongo juega un
papel primordial en la descomposición de lignocelulosa, la lignina es degradada
por la interacción de un complejo de enzimas extracelular, principalmente
peroxidasas y lacasas. La lacasa (p-difenol:dioxigeno:oxido-reductasa), es una
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8. enzima extracelular producida por casi todos los hongos de la podredumbre
blanca, la cual usa al oxigeno molecular como oxidante.
El objetivo de este trabajo fue de remover los colorantes cibacron y
solofenil, así como polimerizar a la anilina y 2-clorofenol en aguas contaminadas
utilizando lacasa de Pleurotus ostreatus
Para ello se utilizo una cepa de Pleurotus ostreatus proveniente del
Departamento de Investigaciones en Ciencias Agrícolas de la BUAP, la cual se
propago en medio PDA, para la producción de enzima lacasa se prepararon
medios líquidos minerales a base de fibra 1 de maizoro y bagazo deshidratado de
chayote en las proporciones 100%, 75%-25%, 50%-50% y 25%-75%
respectivamente, se monitoreo la producción de lacasa en fermentación liquida a
los 7, 14 y 21 días utilizando como sustrato al 2-metoxifenol como prueba
presuntiva y al ABTS como confirmativa para el ensayo enzimàtico. La enzima
con mayor actividad se aplico en aguas contaminadas con los colorantes azul
cibacron y azul solofenil a 50 ppm así como a los compuestos aromáticos anilina
y 2-clorofenol a 100 ppm, todas las determinaciones se realizaron por triplicado
utilizando un espectrofotometro Agilent 8453 UV-visible.
El tratamiento con el cual se obtuvo una mayor cantidad de enzima lacasa
es la que tuvo una proporción 50%-50% de fibra 1 y bagazo de chayote, teniendo
una actividad de 2216 U/L usando 2-metoxifenol como sustrato y 542 UI/mL
utilizando ABTS, es importante resaltar que el bagazo de chayote proviene como
residuo en el proceso de obtención de zumo utilizado para la purificación de
peroxidasas. Al aplicar la enzima en las muestras de aguas contaminadas se
tuvieron porcentajes de decoloración del 94% para azul cibacron y 77% para azul
solofenil, además se logró demostrar que esta enzima es capaz de polimerizar a la
anilina y al 2-clorofenol, generando productos insolubles que eventualmente
pudieran ser aplicados como conductores.
“Caracterización parcial de Lacasa y Tirosinasa de Ustilago maydis y su efecto
sobre la actividad antioxidante de compuestos fenólicos” (Dra. Rosa Martha
Desentis Mendoza)
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9. Los flavonoides son un grupo de polifenoles de bajo peso molecular con
características antioxidantes in vitro. En este trabajo se caracterizaron
parcialmente la lacasa y la tirosinasa de Ustilago maydis y se investigaron sus
efectos sobre la actividad antioxidante de algunos compuestos fenólicos. Puesto
que se detectó la polimerización enzimática de los compuestos fenólicos, el
tamaño de los agregados se determinó y relacionó con su actividad antioxidante.
La morfología de los polímeros se analizó por IR y microscopía de fuerza
atómica.
Se encontró un efecto dosis dependiente del polímero sobre la inhibición
de ROS y lipoperoxidación en membrana celular en línea WRL-68. Las menores
concentraciones del polímero inhibieron hasta en un 140% y en lipoperoxidación
hasta un 137% y presentó efecto prooxidante hasta en un 460%.
Los resultados demostraron que la polimerización de quercetina catalizada
por lacasa y tirosinasa produjo agregados de relativamente bajo peso molecular
pero con mayor actividad antioxidante que la quercetina monomérica. Empleando
kaempferol, los agregados alcanzaron pesos moleculares y longitudes mayores en
las primeras dos horas de reacción incrementando su actividad antioxidante.
En el caso del kaempferol, los agregados adoptaron formas que pudiesen
tener naturaleza fractal similares al coral en el caso del sistema kaempferol-lacasa
y de helecho en el caso del sistema kaempferol-tirosinasa.
APLICACIONES
El fenol se utiliza para la preparación de resinas sintéticas, colorantes,
medicamentos, plaguicidas, curtientes sintéticos, sustancias aromáticas, aceites
lubricantes y solventes.
En el grupo de los fenoles, los cresoles y el compuesto base mismo son los
compuestos más importantes, además del timol, los naftoles, la fenolftaleína, el
triclorofenol y el pentaclorofenol. Los compuestos naturales (pirocatequina,
guayacol y sus derivados) no son tóxicos. Un derivado conocido de la
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10. pirocatequina es la adrenalina. El fenol se presenta en la Naturaleza en la madera
y en las agujas de pino, en la orina de los herbívoros (fenolsulfato) y en el
alquitrán de hulla. De los fenoles monohídricos se obtienen numerosas esencias
(aromáticas) naturales, como por ejemplo: vainillina, timol, carvacrol,
"zingiverón" (en jenjibre), aldehído salicílico. Entre los fenoles multivalentes
sintéticos, el hexaclorofeno es particularmente tóxico.
El fenol se obtiene a partir de la destilación del alquitrán de hulla, con 1
tonelada de hulla se obtiene aproximadamente 0,25 kg de fenol. Actualmente, sin
embargo, predomina la producción sintética por disociación del hidroperóxido de
cumeno, obteniéndose acetona como producto secundario. En parte aún se recurre
a la síntesis a partir del benceno, utilizando ácido bencenosulfónico o
clorobenceno.
Surgen emisiones por combustión incompleta de la gasolina y del alquitrán
de hulla, en el agua residual de coquerías y como metabolitos en la fotólisis del
benceno y del clorobenzeno
INNOVACIÓN
Diseñan la enzima lacasa Mutante R2, potencial base de nuevos fármacos y
biocombustibles
Un equipo del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC),
junto a científicos de la Universidad de Lund, en Suecia, y del Instituto
Tecnológico de California, en Estados Unidos, ha diseñado una enzima con alta
resistencia a disolventes orgánicos. La lacasa Mutante R2 ha sido creada mediante
una metodología conocida como evolución artificial o dirigida, técnica que emula
los pasos claves de la evolución natural y que reduce el proceso de miles de
millones de años a sólo meses o semanas.
Esta nueva enzima podría tener aplicaciones en la eliminación de
contaminantes ambientales, producción de biocombustibles o para crear nuevos
fármacos.
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11. Con este sistema, se ha diseñado una enzima resistente a elevadas
concentraciones de disolventes orgánicos, necesarios para solubilizar
contaminantes ambientales y pueden utilizarse en procesos de síntesis de nuevos
fármacos. La ventaja de la nueva enzima es que no resulta afectada por los
disolventes y puede reutilizarse con máxima eficacia. Además, este mutante se
está probando para la síntesis de moléculas con actividad neuroprotectora, con
posibles aplicaciones en Alzheimer.
REFERENCIAS
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12.  Albertario María. Degradación biológica del fenol utilizando técnicas
respirométricas Documento en línea disponible en:
http://64.233.183.104/search?
q=cache:Ec1zsYZf5U4J:www.metrik.cl/aidis/%3Fp
%3D215+degradacion+del+fenol&hl=es&ct=clnk&cd=1&gl=ve
 Biotecnología aplicada a la industria textil. Documento en línea
disponible en:
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/doc/El
%20Cuaderno%2016.doc
 Castro María. Remoción de contaminantes en aguas artificialmente
contaminadas utilizando lacasa producida por Pleurotus ostreatus.
Documento en línea disponible en:
http://www.uaemex.mx/Red_Ambientales/docs/congresos/Ciudad
%20Obregon/TECNOLOGIA_Y_BIOTECNOLOGIA_AMBIENTAL/TB
A030.doc
 Efluentes líquidos. Documento en línea disponible en:
http://www.estrucplan.com.ar/contenidos-efluentes-liquidos-test.asp
 Mendoza Rosa. Caracterización parcial de Lacasa y Tirosinasa de
Ustilago maydis y su efecto sobre la actividad antioxidante de compuestos
fenólicos. Documento en línea disponible en:
http://64.233.183.104/search?
q=cache:mXko0Z_wYrYJ:www.pncta.com.mx/pages/pncta_investigacion
es_06i.asp%3Fpage
%3D06e4+tecnologia+con+la+enzima+la+lacasa&hl=es&ct=clnk&cd=1&
gl=ve
 Producción de enzimas: Aliadas productivas de la industria. Documento
en línea disponible en:
http://www.bioplanet.net/magazine/bio_sepoct_1999/bio_1999_sepoct_ind
ustria.htm
 P.Beyret. Diseñan la enzima lacasa Mutante R2, potencial base de nuevos
fármacos y biocombustibles. Documento en línea disponible en:
http://64.233.183.104/search?
q=cache:L7M97W3HLzAJ:www.biotecnologica.com/disenan-la-enzima-
lacasa-mutante-r2-potencial-base-de-nuevos-farmacos-y-biocombustibles/
+que+es+enzima+lacasa&hl=es&ct=clnk&cd=4&gl=ve. [10.10.07]
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL
“LISANDRO ALVARADO”
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13. DECANATO DE AGRONOMIA
PROGRAMA ING. AGROINDUSTRIAL
NÚCLEO OBELISCO
DEGRADACION DEL FENOL EMPLEANDO
LA LACASA
REALIZADO POR:
Azuaje, Víctor
Freitez, Ivanna
Herrera, Manuel
Luque, Williams
Molina, Maryam
Padron , Roberto
Suarez, Jhoseleine
Octubre, 2008
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