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Dynamique intracellulaire des
protéines en temps réel
Mourad FERHAT, Ph.D
Spécialiste analyse cellulaire et protéomique
Promega France
La révolution de la protéomique
Comprendre des mécanismes fondamentaux grâce à la
dynamique des protéines
The role of receptor diffusion in the organization of the postsynaptic membrane.
Daniel Choquet & Antoine Triller. Nature Reviews Neuroscience 4, 251-265 (April 2003)
Au programme
Que savons-nous des protéines ? Quelles sont leurs dynamiques ? Quelles méthodes d’étude ?
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Siwiak M, Zielenkiewicz P. Transimulation - protein biosynthesis web service. PloS ONE. 2013 Sep 05 8(9): e73943.
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Dmitriy M. Chudakov et al. Physiological Reviews Published 1 July 2010 Vol. 90 no. 3, 1103-1163
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LgBiTSmBiT
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suivi de l’AMPc
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Cyclase (FSK)
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. Propranolol (PRO): ADRB2 antagonist (cAMP ↓)
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0 2 0 4 0 6 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
0 .1
1
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1 0 0
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G lo S e n s o r c A M P 2 2 F
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Dynamique intracellulaire des protéines en temps réel

  • 1. Dynamique intracellulaire des protéines en temps réel Mourad FERHAT, Ph.D Spécialiste analyse cellulaire et protéomique Promega France
  • 2. La révolution de la protéomique
  • 3. Comprendre des mécanismes fondamentaux grâce à la dynamique des protéines The role of receptor diffusion in the organization of the postsynaptic membrane. Daniel Choquet & Antoine Triller. Nature Reviews Neuroscience 4, 251-265 (April 2003)
  • 4. Au programme Que savons-nous des protéines ? Quelles sont leurs dynamiques ? Quelles méthodes d’étude ?
  • 5. Que savons-nous des protéines ?
  • 6. A la source … les acides aminés
  • 7. Quatre niveaux de structure Structure primaire Séquence en aa Structure secondaire Feuillet β Helice α Structure quaternaire Structure tertiaire Interactions hydrophobe Liaisons ionique Pont disulfure
  • 8. Une diversité de localisation et de fonction Cellules HeLa 2000 µm3 2 X 109 Protéines* (E.coli : 2,36 X 106) Récepteurs < 100 molécules Enzymes (Signalisation) 1000 -10000 Protéines structurales 108 molécules Christopher E. Sims and Nancy L. Allbritton. Analysis of single mammalian cells on-chip, Lab Chip, 2007, 7, 423 – 440. Siwiak M, Zielenkiewicz P. Transimulation - protein biosynthesis web service. PloS ONE. 2013 Sep 05 8(9): e73943.
  • 9. Quelles sont leur dynamique ?
  • 10. Les protéines possèdent une dynamique interne Glycogène synthase (GS)
  • 11. Dynamique à l’échelle de la protéine Liaisons Hydrogènes Vibration Liaisons Hydrogènes - Ruptures - Réarrangements - Rotations Published in: Yao Xu; Martina Havenith; The Journal of Chemical Physics 2015, 143, Mouvements des chaines latérales Mouvements de la protéine Changements conformationnels
  • 12. Les molécules d’eau participent à cette dynamique Rotation Rotation Translation Mouvement des molécules d’eau à la surface des protéines Protéine inactive Protéine active
  • 13. Approcher la dynamique des protéines Méthodes d’étude
  • 14. Approcher la dynamique des protéines A l’échelle de la protéine A l’échelle de la cellule
  • 15. Méthodes d’approches à l’échelle de la protéine Normal Mode Analysis of Biomolecular Structures: Functional Mechanisms of Membrane Proteins Ivet Bahar, Timothy R. Lezon, Ahmet Bakan, and Indira H. Shrivastava Chemical Reviews 2010 110 (3), 1463-1497 Real-Time NMR Characterization of Structure and Dynamics in a Transiently Populated Protein Folding Intermediate. Enrico Rennella et al. †J. Am. Chem. Soc., 2012, Modélisation/Simulation Diffraction aux Rayon X Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
  • 16. Méthodes à l’échelle cellulaire  Gènes rapporteurs  Photoblanchiment (Photobleaching)  Mesure des interactions protéiques
  • 17. L’approche gènes rapporteurs  Fusion :  Transcriptionnelle : séquence régulatrice (promoteurs, élément de réponse …)  Traductionnelle : expression d’une protéine hybride
  • 18. Suivi de la translocation Cellules HeLa : Nluc (luciférase) – GR fusion Cytoplasme Noyau Translocation + dexamethasone (15 min) Engineered luciferase reporter from a deep Sea Shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1848−1857
  • 19. Flurophores pour l’imagerie : la GFP  GFP : Green Fluorescent Protein  Protéine de 27 kDa  Issue de la méduse Aequora victoria (1962)  Premier clonage en 1992  Structure : tonneau β (11 feuillets β/1 hélice α)  4variants initialement dérivés 238 aa, 27 kDa 3 nm 4 nm Chromophore : Tyrosine/Glycine/Serine
  • 20. Les protéines fluorescentes les plus courantes Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues Dmitriy M. Chudakov et al. Physiological Reviews Published 1 July 2010 Vol. 90 no. 3, 1103-1163 . BFP-H2B - GFP-actin - RFP-golgi
  • 22. FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching + Tunicamycine VSVG-GFP Mobilité Immobilité VSVG : Vesicular stomatitis virus G protein.
  • 23. FRAP : des données quantitatives Diminution de la constante D (Diffusion) :  Augmentation de la viscosité  Formation d’agrégats ou de complexes  Interaction Augmentation de la constante D :  Mouvement dirigé  Diminution de la viscosité Température Viscosité
  • 24. FLIP : Fluorescence Loss Induced by Photobleaching  Photobleaching toutes les 40 s  Disparition de la fluorescence au bout de 18 min  Continuité ER Diminution de fluorescence
  • 26. Les interactions protéiques  Signalisation cellulaire  Interaction Récepteur ligand  Assemblage de récepteurs 150 000 à 300 000 interactions Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy Andrei A. Ivanov et Fadlo R. Khuri. Trends Pharmacol Sci. 2013 Jul; 34(7): 393–400.
  • 27. Interactions protéiques : les approches Transfert d’énergie . FRET . BRET Complémentation fonctionnelle . Luciférase . Protéine fluorescente
  • 28. FRET : Fluorescence Resonnance Energy Transfer CFP : Cyan Fluorescent Protein YFP : Yellow Fluorescent Protein No FRET FRET Interaction protéique < 10 nm Pas d’interaction protéique > 10 nm
  • 29. BRET : Bioluminescence Resonance Energy Transfer Substrat : Ex : Coelenterazine RLuc
  • 30. PCA : Protein complementation Assay Fluorescent and Bioluminescent Protein-Fragment Complementation Assays in the Study of G Protein-Coupled Receptor Oligomerization and Signaling Pierre-Alexandre Vidi and Val J. Watts; Molecular Pharmacology April 2009, 75 (4) 733-739; Luciférase Protéine Fluorescente
  • 31. BiFc : Bimolecular Fluorescence complementation GFP 157-158 485/500 Ghosh et al., 2000 YFP, Citrine, Venus 154-155; 172-173 515/528 Hu et al., 2002; Shyu et al., 2006 CFP, Cerulean 154-155; 172-173 452/478 Hu et al., 2002; Shyu et al., 2006 Venus/Cerul ean 154-155; 172-173 504/513 Hu and Kerppola, 2003; Shyu et al., 2006 mRFP1- Q66T 154-155; 168-169 549/570 Jach et al., 2006 mCherry 159-160 587/610 Fan et al., 2008
  • 32. BiFc : dimérisation de récepteurs  Etude de GPCR : capacité à former des homo ou hétérodimères  Dimérisation de récepteurs Adénosine  Complémentation YFP  Etude live-cell
  • 33. BiLc : Bimolecular luminescence complementation RLuc 110-111 Ch/485 Stefan et al., 2007 GLuc 93-94 Ch/480 Remy and Michnick, 2006
  • 34. Interaction Récepteur ligand Leigh A Stoddart et al. (2015) Application of BRET to monitor ligand binding to GPCRs. Nature Methods 12, 661-3.  Récepteur β2 adrénergique β2AR tagué avec une nanoLuciférase (Nluc)  Ligand CA200645 (antagoniste) – fluorophore (BODIPY)  DPCPX : Antagoniste non marqué NLucCA200645 - BODIPY
  • 35. Etude de voies de signalisation : BRET Bioluminescent tools for the analysis of G-protein-coupled receptor and arrestin interactions Mitsuru Hattoria and Takeaki Ozawa*a RSC Adv., 2015,5, 12655-12663
  • 36. Suivi des changements conformationnels Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 6; 112(1): 148–153.. Closed conformation Autoinhibition Open conformation Conformation active (activité GEF)  Rabin 8 (activité GEF) régule Rab8 impliqué dans le traffic intracellulaire  BRET : Luciférase : NanoLuc Fluorophore couplé à un tag : HaloTag  Le passage à la conformation active (Open) est dépendante de la phosphorylation Kinase ERK2 active Constituvely Active (CA) Kinase ERK2 inactive Kinase Dead (KD)
  • 37. Combinaison des approches pour l’étude d’oligomères Combinaisons  BiLc : Dimère 1  BiFc : Dimère 2  BRET : Tétramère
  • 38. Suivi en temps réel
  • 39. Suivi en temps réel : de la molécule à la cellule FRET sur molécules uniques Single-molecule FRET Complémentation luciférase
  • 40. FRET sur molécule unique : ATPase ATP synthase : . Domaine F1 statique . Domaine F0 membranaire : Rotation  Détection d’une molécule  Accès à une dynamique sur une très courte échelle de temps (ms)  Détecteur ultrasensibles de photon  Excitation concentrée sur de petits volumes
  • 41. FRET sur molécule unique Marquages : . ʏ (rotation) : TMR . b (statique) : Cy5
  • 42. Luciférase pour le suivi en temps réel Luciférase  Luciférase de petite taille 19 kDa  Très brillante > Rluc > Fluc  Utilisable en complémentation réversible : Clivable en deux fragments : 11aa/156aa  Temps de ½ vie : > 2 h
  • 43. Application à l’étude d’une voie de signalisation ATP Agonist (ISO) LgBiTSmBiT CA R2A R2A R2A AMPc Récepteur β adrénergique (ADBR2) Inactive PKA CA R2A Active PKA Reversible if [cAMP]↓ Biosenseur pour le suivi de l’AMPc Complémentation luciférase pour le suivi de la PKA Antagonist (PRO) Activateur Adenylate Cyclase (FSK) . Isoproterenol (ISO): ADRB2 agonist (cAMP ↑) . Propranolol (PRO): ADRB2 antagonist (cAMP ↓) . Forskolin (FSK): activator of adenylate cyclase (cAMP ↑) Ligand domain : Site de laison à l’AMPc Sensor domain Domaines N et C Ter de la firefly luciférase Biosenseur : La liaison de l’AMPc induit un changement coformationnel, l’activation de la luciférase et l’émission d’un signal Luminescent
  • 44. Suivi dynamique : associations/dissociations PKA 0 2 0 4 0 6 0 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 0 .1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 T im e (m in ) NanoBiT (%signaldecrease) GloSensorcAMP22F (foldsignalincrease) N a n o B iT IS O P R O F S K G lo S e n s o r c A M P 2 2 F ↓[cAMP] ↑[cAMP]↑[cAMP] NBiT GS ATP Agoniste (ISO) ou Antagoniste (PRO) LgBiTSmBiT CA R2A R2A R2A cAMPInactive PKA CA R2A Active PKA Activateur Adenylate Cyclase (FSK) NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. Andrew S. Dixon et al. ACS Chem. Biol., 2016, 11 (2), pp 400–408 Complémentation luciférase AMPc : Biosenseur . Isoproterenol (ISO): ADRB2 agonist (cAMP ↑) . Propranolol (PRO): ADRB2 antagonist (cAMP ↓) . Forskolin (FSK): activator of adenylate cyclase (cAMP ↑)
  • 46. Les apports de l’exploration dynamique des protéines  Pas une mais plusieurs dynamiques : . Vibration, changement de conformation, translocation, interactions protéiques …  Les technologies développées permettent aujourd’hui d’apprécier non plus seulement la fonction d’une protéine mais sa dynamique propre et au sein de la cellule et d’un organisme (in vivo) Luminescent proteins
  • 47. Des application concrètes Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein–protein interaction challenge Duncan E. Scott, Andrew R. Bayly,Chris Abell & John Skidmore Nature Reviews Drug Discovery Volume:15,Pages:533–550 (2016)