Polymerase Chain
Réaction

Terranti .N
Encadrée par: Dr.Sifi
Laboratoire de biologie moléculaire
Service de biochimie clin...
Plan
Introduction
I- Méthodes d’amplification genique
I-1-L’ amplification par PCR Classique.
1-1 PCR : Définition ,Histor...
I-3-6-Agents chimiques.
I-3-7- hot start PCR
I-3-8-touch down PCR.
I-3-9-Contrôles de la PCR : positif /negatif
1-4 -Limit...
1-7 : Les variantes de la PCR : Principes et applications :
Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allèl...
I-3-La quantification : PCR QUANTITATIVE
En point final: quantification relative
quantification absolut
standard Externe
s...
INTRODUCTION
• Biologie moléculaire : problème quantitatif .
• Techniques d’amplifications (progrès très
rapide dans le do...
AMPLIFICATION GENIQUE
Multiplication Exponentielle d’un
fragment d’ADN cible
grande quantité de fragments identiques
génér...
Amplification de cibles
PCR
- Amplification in vitro d’une petite quantité d’ ADN
cible
- le produit de l’amplification fe...
PCR : HISTORIQUE
• 1983: Dr. Kary Mullis a developer la
PCR
• 1985: premiere publication de la technologie PCR
par la Cetu...
Polymérase Chain Réaction
• Chef de fil des méthodes d’amplification
géniques
PCR CLASSIQUE
spécificité/sensibilité
rapidi...
PCR classique
• Basé sur la capacité de l’ADN polymérase à
synthétiser le brin complémentaire d’un ADN
servant de matrice ...
Milieux réactionnel :
• dNTP
• Magnésium
• ADN polymérase
• Deux types d’amorces
On ajoute en suite l’ ADN extrait du mili...
13
1-Dénaturation thermique a 95 °C: (95°C > TM de
l’ADN) : rupture des liaisons hydrogènes et
séparation des deux brins d’AD...
DENATURATION
93°C - 95°C
HYBRIDATION
50°C - 65°C

25-35 CYCLES

DENATURATION
93°C - 95°C

EXTENSION
72°C

15
16
Déroulement de la réaction:
Réaction d’amplification en
chaîne par polymérase
(PCR)
Les acteurs
Séquence cible:ADN à amplifier

Amorces

•Taq polymérase
Pol
Premier cycle
Étape 1: dénaturation
Température:95°
Température:95°c
durée: 1 min
Hybridation
Séquence cible:ADN à amplifier
Étape 3: Polymérisation
Température:72°
Température:72°c
durée: 1 min
Polymérisation

Pol

Pol
Résultat:2 copies dont 0 copie
cible
Deuxième cycle
Dénaturation
Hybridation
Polymérisation
P
P

P
P
Résultat:4 copies dont 0 copie cible
Troisième cycle
Dénaturation
Hybridation

Polymérisation
Copie
cible
Résultat :8 copies dont 2
copies cibles
Quatrième cycle
16 copies dont 8 copies cibles
A chaque fois ,la quantité d’ADN double dans le
tube.
Une PCR de n cycles : 2ⁿ copies
20 cycles : 220=1 048 576 copies
30c...
37
il est inutile d’augmenter le nombre de cycle, après 20
cycles l’amplification cesse d’être exponentielle et
atteint un pl...
Eppendorf Mastercycler gradient
thermocycleur

39
Thermocycleur: automate assurant la variation de
température rapide entre des plateaux programmés ,
le nombre de fois requ...
41
PCR Classique
• Il en ressort de cette technique que
la séquence à amplifier doit être
connue préalablement ( ou du
moins ...
PCR
OPTIMISATION
Composants de la réaction et leur influence sur
l’amplification :
l’enzyme: ADN
polymérase
thermostable

...
OPTIMISATION
l’enzyme: ADN polymérase thermostable
Actuellement on utilise la taq polymérase
« eubactéries » extraite de b...
OPTIMISATION
l’enzyme: ADN polymérase thermostable
• la fidélité de l’activité enzymatique dépend de trois
caractéristique...
Taq

Pwo

Pfu

Tth

5’3’ exo

+

-

-

+

3’5’ exo

-

+

+

-

Vitesse:nt/sec 50

20-30

60

50

Longueur: Kb 3

3

3

3
...
OPTIMISATION
Les amorces sens et anti sens
• Des logiciels permettent de définir rapidement des
amorces dans une séquence ...
OPTIMISATION
Les amorces sens et anti sens
• Composition en base; riche à 50 - 60% GC
les amorces devraient avoir des Tms ...
OPTIMISATION
Magnésium : MgCl2
valeur comprise entre 1.5 mM et 2 mM le Mg2+
influence l’activité de l’enzyme , augmente la...
OPTIMISATION
Température de fusion
• Le Tm des amorces doit être suffisamment
élevée ( min 55° si possible)
• Plus le Tm e...
Exemples d’Amorçages illégitimes

51
OPTIMISATION
Agents chimiques
• Le DMSO (2-10%) (sulfoxyde diméthylique) aide
souvent l'amplification de fragments de + de...
OPTIMISATION

hot start PCR

• En PCR classique : les composants sont ajoutés a T° ambiante
(possibilités d’hybridations n...
OPTIMISATION

hot start PCR
Taq polymérase encapsulé dans une bille de
paraffine. Ex :Taq Bed ™ Promega .

54
Taq polymérase active à72°C/inactive à T° ambiante
:le site actif de l’enzyme est bloqué par un anticorps anti
Taq polymér...
OPTIMISATION

hot start PCR
Spécificité et sensibilité augmentées

56
OPTIMISATION

Touch down PCR
• Au début : T° d’hybridation élevée : il n’ya que les
appariements très spécifiques qui peuv...
OPTIMISATION

Touch down PCR

Principe:
démarrer la PCR a une T° d’hybridation supérieur à celle
calculée (Tm-5°C).
Diminu...
Plus grande spécificité
No template control
-

-

( dilutions du contrôle positif)

Effect of touchdown PCR thermal cyclin...
OPTIMISATION

Touch down PCR
• Effect of touchdown PCR thermal cycling on
non-specific amplification :
Lane 1 : MW ladder....
contrôles
• Pour chaque série de PCR il convient d’utiliser 1 contrôle
positif et plusieurs contrôles négatifs .
• le cont...
Contrôles
le contrôle positif
.
Contrôle interne

échantillon

+

-

-

-

+

+

Vrai négatif
?
Vrai positif

62
contrôles
Contrôle négatif :
Un tube qui contient tout les
éléments réactionnels sauf
l’ADN : s’assurer qu’il n’ya pas
de ...
limites
A. La taille de la séquence a amplifié:

- elle ne doit pas être supérieur a 3Kb
B. le nombre de copie de la cible...
INCONVENIENTS
.
Derrière une très grande simplicité , à la fois dans
le principe et dans la réalisation , se cachent de
no...
INCONVENIENTS
• ?

LA
CONTAMINATION

La détection
d’inhibiteurs

Les amplifications
parasites

Manque de
fidélité de la Ta...
INCONVENIENTS
LA CONTAMINATION
Premier risque majeur permanent de la PCR
• La contamination d’un tube ne contenant pas
la ...
INCONVENIENTS
LA CONTAMINATION
•
•
•
•
•
-

Précautions :
Aliquoter tout les réactifs en petits volumes .
Jeter tout réact...
INCONVENIENTS
détection d’inhibiteurs
Second problème inhérent a la PCR .
• Risque de résultats faussement négatifs : en
p...
INCONVENIENTS
détection d’inhibiteurs
précautions :
1-Diluer l’échantillon (1/5) , (1/10) même plus
,dans de l’eau distill...
INCONVENIENTS
Manque de fidélité de la Taq Polymerase
- les erreurs de réplication ne peuvent pas être
surmontées ,
elles ...
INCONVENIENTS
Les amplifications parasites
- c’est la possibilité que les amorces s’hybride a
un segment autre que la cibl...
applications de la technologie PCR
Détection des mutations ponctuels :
se fait par hybridation des produits PCR
avec des s...
Variantes de la PCR
•
•
•
•

Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allèle spécifique PCR .

74
Reverse transcription- PCR .
• PCR : amplification de fragments d’ADN
ARN --- reverse transcription ----- ADN c ---- PCR
L...
Reverse transcription- PCR .

• 1- amorces oligo dt: desoxythymidine
seulement, utilisés pour la RT-PCR d’ARN m
(toujours ...
77
Reverse transcription- PCR
• 2-Amorces hexanucléotidiques randomisées :
Mélange d’amorces très courtes ( 6 nucléotides
) c...
79
Reverse transcription- PCR
• Enzyme : Tth polymérase : Thermus thermo
philus polymérase : ADN polymérase
thermostable avec...
Reverse transcription- PCR
• Avantage : Tth Polymérase : un seul mix , diminution
du risque de contamination .
• Limites :...
Variantes de la PCR

•
•
•
•

Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allele specific PCR .

82
Nested PCR .
• Principe: le produit issu d’une première PCR
est de nouveau amplifié a l’aide d’un second
couple d’amorces....
84
Nested PCR
• Sensibilité : considérablement augmentée
deux PCR successive sont réalisé.
Spécificité : accrue :
deux couple...
86
Variantes de la PCR
•
•
•
•

Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allèle specific PCR .

87
PCR Multiplex
• Principe: amplification simultanée de plusieurs
séquences cibles (deux au moins) dans un même
tube d’ampli...
PCR Multiplex
Primerplex 2.0 : software pour le design
des amorces de PCR multiplex.
Usages :
-Plusieurs cibles peuvent êt...
90
Variantes de la PCR
•
•
•
•

Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allele specific PCR .

91
Allèle spécifique PCR
• Technique intéressante pour distinguer deux
allèles ne différant que par un, ou quelques
nucléotid...
Allèle spécifique PCR

93
P1- compatible- allèle 1
P2-compatible- allele2
P1--- mésappariement---allele2
P2---mésappariement---allele1
En absence de...
Allèle specific PCR
• la PCR spécifique d’allèle a été Supplanté par
la PCR en temps réel qui est devenu la
méthode de réf...
PCR EN TEMPS REEL
Avant : la mise en évidence des mutations était
réalisé après la PCR classique .
Poste PCR : analyse des...
PCR EN TEMPS REEL
•
•
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•
•
•
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•

Principe
Avantages
Chimies de détections
Appareillage
SYBR™ Green
Sondes TaqMan ™
Son...
PCR EN TEMPS REEL
Principe
Détection et quantification d’un signal
fluorescent émis par un fluorophore dont
l’intensité d’...
PCR EN TEMPS REEL
Principe

99
PCR EN TEMPS REEL
Avantages
•
•
•
•

•
•
•
•

Grande sensibilité et spécificité .
Grande Capacité de multiplexage.
Rapidit...
PCR EN TEMPS REEL
Chimies de détections
• S’intercalent entre les deux hélices de l’ADN
double brin. SYBR™ Green
Agents
in...
PCR EN TEMPS REEL
Chimies de détections

102
PCR EN TEMPS REEL
Appareillage
• Différent par :
capacité d’échantillonnage.
durée des cycles.
capacité de détection des d...
PCR EN TEMPS REEL
Appareillage
À grande capacité

À débit moyen

Analyse a grande échelle.
Ne sont pas compatible avec
tou...
PCR EN TEMPS REEL
Appareillage

Light cycler 2.0® ( Roche diagnostics)
105
PCR EN TEMPS REEL
Appareillage

ABI Prism ® 7900
106
PCR EN TEMPS REEL

SYBR™ Green
• Agent intercalent, se lie a l’ADN double brin.
• Une fois liée , ↑ du signal fluorescent ...
PCR EN TEMPS REEL

SYBR™ Green
Principe: au cours de l’hybridation et l’extension:
le SYBR Green s’intercale et émet une
f...
PCR EN TEMPS REEL

SYBR™ Green
Avantages

inconvénients

-Moins toxique et plus sensible

-Ne différencie pas deux fragmen...
PCR EN TEMPS REEL

Sondes TaqMan ™
• Première chimie de PCR en temps réel , élaboré
par la société Perkin Elmer « Applied ...
PCR EN TEMPS REEL
REM

Sondes TaqMan ™
fluorophore

Etat initial

Onde
Electromagnétique
(ʎ: fonction du
ʎ
fulorophore- vi...
PCR EN TEMPS REEL

Sondes TaqMan ™
Sondes monobrin de 15 a 30
nucléotides , Complémentaire a la
partie centrale de la cibl...
PCR EN TEMPS REEL

Sondes TaqMan ™
• La quantité de lumière émise
quantité de sonde détruite quantité
de produit de PCR sy...
PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™

Aspect de la fluorescence après amplification par PCR en temps réel Sondes TaqMan
5 éch...
PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™
Avantages :
Sensibilité élevée
Grande spécificité ( SYBR Green)
Meilleur capacité de mul...
PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™-MGB
• Sondes de 12-20 bases.
• 3’: quencher auquel est accroché une MGB (peut
s’insérer ...
PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™-MGB
Avantages :
Sensibilité est augmenté (quenching ↑)
Meilleur efficacité de détection ...
PCR EN TEMPS REEL
Sondes FRET ™

118
PCR EN TEMPS REEL
Sondes FRET ™
• le système utilise un couple de sondes d’hybridation
très courtes portant chacune un flu...
PCR EN TEMPS REEL
Molécular Beacons

120
PCR EN TEMPS REEL
Molécular Beacons
-Une sonde BeaconTM est une sonde d’hybridation en épingle à cheveux
qui porte à son e...
PCR EN TEMPS REEL
Molécular Beacons
Avantages :grande spécificité
les balises moléculaires demeurent intactes apres
PCR
In...
PCR EN TEMPS REEL
Conclusion
• L’inconvénient des techniques basées sur le
FRET est qu’elles utilisent des Sondes difficil...
QUANTIFICATION
• Le developpement de la PCR à révolutionner
le domaine de la quantification des acides
nucléiques .
• Les ...
PCR quantitative
PCR quantitative

En point final

En temps réel
125
PCR quantitative
En point final
• Mise au point particulièrement complexe.
• Nombreuses stratégies décrites dans la
littér...
PCR quantitative
En point final
• Principe: exploitation de la cinétique de la
réaction PCR .
• Rendement :
n cycles : 2ⁿ ...
PCR quantitative
En point final

Quantité de produit formé
proportionnelle a la quantité d’ADN
de départ .

il n’ya plus d...
PCR quantitative
En point final
Quantification relative : compare 2

Quantification absolue

concentrations relatives d’ac...
PCR quantitative
En point final
Standard externe

-Solution titré d’ ADN de séquence identique à celle de la cible à quant...
PCR quantitative
En point final
Standard Externe

131
PCR quantitative
En point final
Standard interne / PCR compétitive : palie au inconvénients précédents

Méthode de choix p...
PCR quantitative
En point final
Standard Interne

133
PCR quantitative
En point final
• La PCR semi-quantitative est une PCR après laquelle (technique en
point final) la quanti...
Recherche de délétions par QMPSF (Quantitative
Multiplex PCR of Short Fragments)
• Amplifier /PCR plusieurs exons du gène ...
Recherche de délétions par QMPSF
(Quantitative Multiplex PCR of Short
Fragments)

136
MLPA (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification)
• La Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification (MLPA) est u...
MLPA (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification
• Principe: ce n’est pas la sequence cible qui est
amplifié, mais l...
MLPA (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification

139
PCR quantitative
En temps réel
• Les techniques en point final donnent des résultats
satisfaisants mais de mise en œuvre d...
PCR quantitative
En temps réel
• On fait une dilution en série d’un plasmide contenant
le gène cible .
• Le déplacement ho...
Cycle seuil
• Un seuil de fluorescence est établi par le
programme de la machine de PCR en temps réel.
Une fois que la qua...
143
PCR quantitative
En temps réel
• La quantification peut être :
Absolue .
Relative : le gène d’intérêt est exprimé par
rapp...
PCR quantitative
Applications
1-Microbiologie:
• Détection de plusieurs pathogènes dans un même tube
(multiplexage/différe...
PCR quantitative
Applications
• Domaine agro-alimentaire : détection des
germes : salmonelles, coliformes fécaux …..
• Onc...
CONCLUSION
• La PCR est probablement l'une des découvertes
scientifiques les plus importantes des dernieres
décennie. Grâc...
Documentation
• Principes de biologie moléculaire en biologie clinique
Marc Bogard, Jérôme Lamoril, Nedjma Ameziane

• Bio...
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PCR : Polymerase chain reaction : classique et en temps réel

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la PCR comme outil en biologie moléculaire .
PCR : Déroulement, optimisation, limites , inconvénients et variantes.
PCR en temps réel et chimies de détéction
PCR quantitative

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PCR : Polymerase chain reaction : classique et en temps réel

  1. 1. Polymerase Chain Réaction Terranti .N Encadrée par: Dr.Sifi Laboratoire de biologie moléculaire Service de biochimie clinique CHUC 1 Avril 2013
  2. 2. Plan Introduction I- Méthodes d’amplification genique I-1-L’ amplification par PCR Classique. 1-1 PCR : Définition ,Historique 1-2-Déroulement de la réaction. 1-3-Optimisation de la PCR 1-3-1-l’enzyme : polymerase thermostable. 1-3-2-Amorces : sens et anti sens 1-3-3 -Gamme de MgCl2 1-3-4-Température de fusion 1-3-5-Exemples d’amorçages illégitimes.
  3. 3. I-3-6-Agents chimiques. I-3-7- hot start PCR I-3-8-touch down PCR. I-3-9-Contrôles de la PCR : positif /negatif 1-4 -Limites de la PCR 1-5-Inconvénients : 1-5-1- la contamination 1-5-2-la détection d’inhibiteurs. 1-5-3-Manque de fidélité de la Taq Polymerase. 1-5-4- Amplifications parasites . 1-6-Applications de la PCR.
  4. 4. 1-7 : Les variantes de la PCR : Principes et applications : Reverse transcription PCR . Nested PCR . PCR Multiplex . Allèle spécifique PCR . I-2 –PCR en Temps Réel : Principe Avantages Chimies de détections Appareillage SYBR™ Green Sondes TaqMan ™ Sondes TaqMan MBG ™ Sondes FRET ™ Molecular Beacon
  5. 5. I-3-La quantification : PCR QUANTITATIVE En point final: quantification relative quantification absolut standard Externe standard interne (pcr compétitive) PCR semi quantitative: QMPSF MLPA En temps réel : Avantages cycle seuil Applications Conclusion. Documentation.
  6. 6. INTRODUCTION • Biologie moléculaire : problème quantitatif . • Techniques d’amplifications (progrès très rapide dans le domaine de la biologie moléculaire ces 20 dernières années) • Répétition de réplications IN VITRO • PCR : en moins de 3ans après sa description , tout les laboratoires de biologie moléculaire l’utilisait . 6
  7. 7. AMPLIFICATION GENIQUE Multiplication Exponentielle d’un fragment d’ADN cible grande quantité de fragments identiques générés : aisément détectées +++ (sonde) • pour obtenir un signal amplifié (faible quantité de séquence d’ADN cible) on peut : Amplifier l’ADN cible par PCR : 10⁹ copies Nombreuses techniques de diagnostique reposent sur cette amplification Amplification de la sonde 7
  8. 8. Amplification de cibles PCR - Amplification in vitro d’une petite quantité d’ ADN cible - le produit de l’amplification fera l’objet de tests ultérieurs. (Post PCR) - Méthode simple, rapide, sensible ,nécéssitant des ingrédients simples et quelques heures de travail. - Outil de base à différentes techniques de biologie moleculaire. 8
  9. 9. PCR : HISTORIQUE • 1983: Dr. Kary Mullis a developer la PCR • 1985: premiere publication de la technologie PCR par la Cetus Corporation . • 1993: Dr. Kary Mullis , Prix Nobel de chimie pour avoir conçu la technologie PCR . 9
  10. 10. Polymérase Chain Réaction • Chef de fil des méthodes d’amplification géniques PCR CLASSIQUE spécificité/sensibilité rapidité/possibilité de quantification REAL TIME PCR« EN TEMPS » 10
  11. 11. PCR classique • Basé sur la capacité de l’ADN polymérase à synthétiser le brin complémentaire d’un ADN servant de matrice . • C’est est une succession de cycles, chaque cycle contenant 3etapes : 1-Dénaturation 3-Elongation 2-Hybridation 11
  12. 12. Milieux réactionnel : • dNTP • Magnésium • ADN polymérase • Deux types d’amorces On ajoute en suite l’ ADN extrait du milieu biologique à étudier au mix : 12
  13. 13. 13
  14. 14. 1-Dénaturation thermique a 95 °C: (95°C > TM de l’ADN) : rupture des liaisons hydrogènes et séparation des deux brins d’ADN pour donner deux ADN simple brins matrices . 2- l’hybridation des amorces : annealing : la température du milieu est amené a une T° de (50 –65°) < Tm des amorces 3- Elongation : extension des amorces par la TAqpolymerase à 72° , T° optimal pour l’extension . 14
  15. 15. DENATURATION 93°C - 95°C HYBRIDATION 50°C - 65°C 25-35 CYCLES DENATURATION 93°C - 95°C EXTENSION 72°C 15
  16. 16. 16
  17. 17. Déroulement de la réaction:
  18. 18. Réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR)
  19. 19. Les acteurs Séquence cible:ADN à amplifier Amorces •Taq polymérase Pol
  20. 20. Premier cycle Étape 1: dénaturation Température:95° Température:95°c durée: 1 min
  21. 21. Hybridation Séquence cible:ADN à amplifier
  22. 22. Étape 3: Polymérisation Température:72° Température:72°c durée: 1 min
  23. 23. Polymérisation Pol Pol
  24. 24. Résultat:2 copies dont 0 copie cible
  25. 25. Deuxième cycle
  26. 26. Dénaturation
  27. 27. Hybridation
  28. 28. Polymérisation P P P P
  29. 29. Résultat:4 copies dont 0 copie cible
  30. 30. Troisième cycle
  31. 31. Dénaturation
  32. 32. Hybridation Polymérisation
  33. 33. Copie cible
  34. 34. Résultat :8 copies dont 2 copies cibles
  35. 35. Quatrième cycle 16 copies dont 8 copies cibles
  36. 36. A chaque fois ,la quantité d’ADN double dans le tube. Une PCR de n cycles : 2ⁿ copies 20 cycles : 220=1 048 576 copies 30cycles : 230=1 073 741 824 copies • Les brins long continuent leurs accumulation de façon linéaire (ils ne sont générés qu’a partir de l’extension des amorces sur l’ADN initial). • Les brins court s’accumulent de façon exponentielle (il seront très largement majoritaire en fin de la PCR ). 36
  37. 37. 37
  38. 38. il est inutile d’augmenter le nombre de cycle, après 20 cycles l’amplification cesse d’être exponentielle et atteint un plateau: Dimerisation des amorces. l’apparition des sous produits de réaction ayant un pouvoir d’ inhibition (pyrophosphate) L’épuisement et la dénaturation des composants de la réaction et la compétition entre les amorces et les fragments d’ADN amplifié qui peuvent s’hybrider entre eux plutôt qu’avec les amorces. 38
  39. 39. Eppendorf Mastercycler gradient thermocycleur 39
  40. 40. Thermocycleur: automate assurant la variation de température rapide entre des plateaux programmés , le nombre de fois requis . EXEMPLE DE PROGRAMMATION DES CYCLES Dénaturation initiale 5 min à 94˚C Dénaturation; 93°C - 95°C 30 secs – 1min Hybridation; 50°C - 65°C 30 secs – 1min Extension; 70°-75°C 1min X 25-35 cycles Extension finale 2-10 min 40
  41. 41. 41
  42. 42. PCR Classique • Il en ressort de cette technique que la séquence à amplifier doit être connue préalablement ( ou du moins au minimum les séquences d’hybridation des amorces ) 42
  43. 43. PCR OPTIMISATION Composants de la réaction et leur influence sur l’amplification : l’enzyme: ADN polymérase thermostable Température de fusion Agents chimiques Les amorces sens et anti sens Magnésium : MgCl2 43
  44. 44. OPTIMISATION l’enzyme: ADN polymérase thermostable Actuellement on utilise la taq polymérase « eubactéries » extraite de bactérie (Thermus aquiticus) vivant dans les sources chaudes. T° optimale =72° (70-75°) Capable de résister a de fortes T° ce qui a permis l’automatisation de la procédure. La quantité l’enzyme: 0,2-0,5… 1U (risque de bandes parasites , si la quantité est importante ) Pas d’activité exonucléasique 3’ – 5’. 44
  45. 45. OPTIMISATION l’enzyme: ADN polymérase thermostable • la fidélité de l’activité enzymatique dépend de trois caractéristiques spécifiques: : - la faculté de sélection des nucléotides. - la discrimination entre les amorces correctement ou incorrectement appariées. - La présence d’une activité exonucléasique 3’-5’ associée , qui lui confère la capacité d’exciser un nucléotide incorrectement apparié en 3’ d’une amorce. 45
  46. 46. Taq Pwo Pfu Tth 5’3’ exo + - - + 3’5’ exo - + + - Vitesse:nt/sec 50 20-30 60 50 Longueur: Kb 3 3 3 3 Erreur: 106 26 32 Production naturelle recombinant naturelle Source Thermus Pyrococcus aquatus archaebactériu Pyrococcus Thermus furiosus thermophilus 30 recombinant m Demi vie 40 mn 120 mn 20 mn M molaire 94 kDa 90 kDa 92 kDa 94 kDa 46
  47. 47. OPTIMISATION Les amorces sens et anti sens • Des logiciels permettent de définir rapidement des amorces dans une séquence donné : Primer 3’ ( logiciel libre disponible sur internet ) • http://simgene.com/Primer3 • Taille : 20 a 30 nucléotides • Amorces : séquences exactement complémentaires du fragment a amplifier . • les séquences des deux amorces du même couple doivent présenter le maximum de divergences et plus particulièrement à l’extrémité 3’ , afin d’éviter leur hybridation. • Eviter la présence d’autocomplementarité : hybridation de l’amorce sur elle-même . 47
  48. 48. OPTIMISATION Les amorces sens et anti sens • Composition en base; riche à 50 - 60% GC les amorces devraient avoir des Tms équivalents (1°) Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C ) x 4 °C] Formule aproximative , valable pour des amorces inferieurs a 25 nucléotides. - Evitez un T en 3’ ( mieux G ou C). 48
  49. 49. OPTIMISATION Magnésium : MgCl2 valeur comprise entre 1.5 mM et 2 mM le Mg2+ influence l’activité de l’enzyme , augmente la stabilisation du double brin et élève le Tm. Pour optimiser une PCR il est nécessaire de faire une gamme de MgCl2. 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 mM 49
  50. 50. OPTIMISATION Température de fusion • Le Tm des amorces doit être suffisamment élevée ( min 55° si possible) • Plus le Tm est élevée , moins le risque d’hybridation non spécifique des amorces est important . • Différence entre les Tm des deux amorces doit être inferieur 5° 50
  51. 51. Exemples d’Amorçages illégitimes 51
  52. 52. OPTIMISATION Agents chimiques • Le DMSO (2-10%) (sulfoxyde diméthylique) aide souvent l'amplification de fragments de + de 1kb. • La formamide (1-5%) peut apparamment améliorer la spécificité de la PCR , diminue les amplifications parasites . • Le glycérol (2-10%), améliore l'amplification des échantillons (G+C) élevés et protège la Taq contre la dégradation par la chaleur. • Le polyéthylène glycol 6000 (5-15%) peut être un additif utile quand la concentration de l’échantillon d'ADN est très basse , ameliore l’efficacité d’amplification. 52
  53. 53. OPTIMISATION hot start PCR • En PCR classique : les composants sont ajoutés a T° ambiante (possibilités d’hybridations non spécifiques ) • spécificité et sensibilité altérés . • En hot start PCR : par omission de réactif : • un des composants du mix (MgCl2) n’est pas ajouté, une fois la température est amenée a 80°C, ce dernier est ajouté . paraffine solide qui se liquéfie a 70°C : éviter la réouverture du tube (contamination +++) . 53
  54. 54. OPTIMISATION hot start PCR Taq polymérase encapsulé dans une bille de paraffine. Ex :Taq Bed ™ Promega . 54
  55. 55. Taq polymérase active à72°C/inactive à T° ambiante :le site actif de l’enzyme est bloqué par un anticorps anti Taq polymérase . Elle ne devient active qu’après la première étape de dénaturation . Ex : Fast Start Roche 55
  56. 56. OPTIMISATION hot start PCR Spécificité et sensibilité augmentées 56
  57. 57. OPTIMISATION Touch down PCR • Au début : T° d’hybridation élevée : il n’ya que les appariements très spécifiques qui peuvent se produirent . ( toute hybridation non spécifique au début s’accroit de façon exponentielle ) • Avantages :- spécificité accrue +++ - permet de détourner les processus d’optimisation compliqués de détermination des T° d’hybridation optimales. Intert : PCR d’un gene dont on ne connait pas la sequence , mais dont le gene d’une espece proche a deja ete etudié ( cible mal caractérisé) 57
  58. 58. OPTIMISATION Touch down PCR Principe: démarrer la PCR a une T° d’hybridation supérieur à celle calculée (Tm-5°C). Diminution séquentielle pendant un certain nombre de cycles , jusqu’à ce qu’on arrive a une température inferieur au Tm des amorces . EX: 94°C --------------- dénaturation .5 mn 94°C --------------- dénaturation 20 s 67°C --------------- hybridation 30s : 6 cycles (baisse de 2 ° /cycle) 55°C 72°C ----------------- extension 60 s 94°C --------------- dénaturation 20 s 55°C ---------------- hybridation 30 cycles 72°C ----------------- extension 60 s 58 72°C ----------------- extension 10 mn
  59. 59. Plus grande spécificité No template control - - ( dilutions du contrôle positif) Effect of touchdown PCR thermal cycling on non-specific amplification 59
  60. 60. OPTIMISATION Touch down PCR • Effect of touchdown PCR thermal cycling on non-specific amplification : Lane 1 : MW ladder.(echelle de taille ) Lanes 2–3 :negative control. Lane 4 : no template control. Lanes 5–12 : positive control dilutions. The touchdown thermal cycling eliminates the non-specific products in the negative control reactions. 60
  61. 61. contrôles • Pour chaque série de PCR il convient d’utiliser 1 contrôle positif et plusieurs contrôles négatifs . • le contrôle positif : -ADN témoin connu . - le nombre de copies (raisonnablement faible) : contrôler la sensibilité de la méthode . Ex: En infectiologie : une amplification négative( suspicion d’ une inhibition de l’enzyme ) le contrôle interne : fragment d’ADN identique a la cible( diffère par une partie de la séquence 20 Pb) les mêmes amorces sont utilisées ( cible /contrôle interne) le produit d’amplification sera analysé de manière différentielle ( sondes spécifiques : extrait /contrôle interne ) 61
  62. 62. Contrôles le contrôle positif . Contrôle interne échantillon + - - - + + Vrai négatif ? Vrai positif 62
  63. 63. contrôles Contrôle négatif : Un tube qui contient tout les éléments réactionnels sauf l’ADN : s’assurer qu’il n’ya pas de contamination un tube contenant le mix réactionnel + ADN témoin non amplifiable par les amorces choisis Vérifier la spécificité de la réaction L’évolution des techniques , l’apparition de la PCR en temps réel et une certaine automatisation ont eu pour effet de rendre ces mesures de contrôle moins drastiques . 63
  64. 64. limites A. La taille de la séquence a amplifié: - elle ne doit pas être supérieur a 3Kb B. le nombre de copie de la cible : - des amplification à partir d’une seule copie est réalisable mais très difficilement. - lorsque le nombre de copie de départ est faible , effectuer deux PCR successives plutôt que de multiplier le nombre de cycle C-La PCR devient inefficace après 40-50 cycles (la quantité du DNA ne change pas et atteint un plateau. 64
  65. 65. INCONVENIENTS . Derrière une très grande simplicité , à la fois dans le principe et dans la réalisation , se cachent de nombreux pièges susceptibles d’entacher la valeur des résultats obtenus. L’utilisation de la PCR impose: Une organisation particulière des laboratoires. Une connaissance de tous les écueils. Une grande expérience. Chaque résultat doit être validé !!!! 65
  66. 66. INCONVENIENTS • ? LA CONTAMINATION La détection d’inhibiteurs Les amplifications parasites Manque de fidélité de la Taq Polymérase 66
  67. 67. INCONVENIENTS LA CONTAMINATION Premier risque majeur permanent de la PCR • La contamination d’un tube ne contenant pas la cible ( ADN/ARN) = résultats faussement positifs . - la source majeure est l’ADN amplifié au cours des manipulation précédente surtout lors de l’ouverture des tubes. (projection dans l’atmosphère « aérosol » =contamination du matériel). 67
  68. 68. INCONVENIENTS LA CONTAMINATION • • • • • - Précautions : Aliquoter tout les réactifs en petits volumes . Jeter tout réactif suspect . Stériliser les tampons, les pointes de pipettes Décontaminer le matériel par de l’eau de javel Irradier aux UV la zone de travail pendant 15 minutes Réaliser les incubations dans un laboratoire différent de celui ou sera analyser le produit. Ne pas recycler l'air de la post-PCR vers la pré-PCR . (ADN amplifié en suspension dans l'air). 68
  69. 69. INCONVENIENTS détection d’inhibiteurs Second problème inhérent a la PCR . • Risque de résultats faussement négatifs : en particulier recherche qualitative de ( virus /germes) • Agents : -l’hème. -DMSO (> 10 ℅) - l’héparine . -certains milieux biologiques : urines /LCR : ( inhibiteurs de nature inconnus) 69
  70. 70. INCONVENIENTS détection d’inhibiteurs précautions : 1-Diluer l’échantillon (1/5) , (1/10) même plus ,dans de l’eau distillé stérile . 2-Chauffer l’échantillon 10 mn à 95°c 3-purifier l’ADN a nouveau .( risque accrue de contamination lors d’extraction rapide ) 4-Changer d’ADN polymérase : certaines sont plus résistantes que la Taq polymérase : ex :Tth polymerase . 70
  71. 71. INCONVENIENTS Manque de fidélité de la Taq Polymerase - les erreurs de réplication ne peuvent pas être surmontées , elles peuvent engendrer des résultat erronés lors de l’analyse des mutations sous clonage . - pour minimiser : on détermine directement les séquences avant clonage. 71
  72. 72. INCONVENIENTS Les amplifications parasites - c’est la possibilité que les amorces s’hybride a un segment autre que la cible. Par ↑ T°: progressivement jusqu’à ce que les bandes contaminantes disparaissent. Le formamide a faible concentration (il augmente la spécifié) 72
  73. 73. applications de la technologie PCR Détection des mutations ponctuels : se fait par hybridation des produits PCR avec des sondes oligo-nucléotidiques (technique du “DOT-BLOT“) Maladies infectieuses : détection d’ADN ou d’ARN viral Neisseria gonorrhea Chlamydia trachomatis HIV-1 Introduction du produit PCR dans un vecteur: clonage du produit PCR Etude de l’expression des gènes séquençage direct du produit PCR Contamination de l’eau DNA fingerprinting Diagnostique de preinplantation : fertilisation in vitro Cancérologie : lorsque sous traitement ; les cellules cancéreuses ne sont plus détectables par les outils usuels . La PCR détecte les mutation distinctes présentes des ces cellules cancéreuses 73
  74. 74. Variantes de la PCR • • • • Reverse transcription PCR . Nested PCR . PCR Multiplex . Allèle spécifique PCR . 74
  75. 75. Reverse transcription- PCR . • PCR : amplification de fragments d’ADN ARN --- reverse transcription ----- ADN c ---- PCR L’ensemble des deux réaction : RT- PCR Principe : une transcriptase inverse (ADN polymérase ARN directed) transforme l’ARN messager , viral, ribosomal en ADN. Celui-ci pourra être amplifié par PCR. La reverse transcriptase nécessite également la présence d’amorces hybridés a la cible . 75
  76. 76. Reverse transcription- PCR . • 1- amorces oligo dt: desoxythymidine seulement, utilisés pour la RT-PCR d’ARN m (toujours polyadenylé en 3’) 76
  77. 77. 77
  78. 78. Reverse transcription- PCR • 2-Amorces hexanucléotidiques randomisées : Mélange d’amorces très courtes ( 6 nucléotides ) comprenant toutes les séquences possibles pouvant composer un hexanucléotides : 4⁶ = 4096 possibilités . - grande certitude que des oligonucléotides s’hybrideront a l’ARN pour servir d’amorce . 3- Amorces spécifiques . 78
  79. 79. 79
  80. 80. Reverse transcription- PCR • Enzyme : Tth polymérase : Thermus thermo philus polymérase : ADN polymérase thermostable avec une activité reverse transcriptase intrinsèque : (ARN 1kb ) Activité ADN polymérase Activité exonucléasique 5’-3’ Pas d’activité 3’-5’ , Mg Température optimale : 70 °C Activité ADN polymérase ARN directed , Mn( MnSo4) Température optimale : 60 °C * *60°C : déstabilisation de la structure secondaire des ARN ; meilleur rendement et hybridation plus spécifique . 80
  81. 81. Reverse transcription- PCR • Avantage : Tth Polymérase : un seul mix , diminution du risque de contamination . • Limites :lors de la contamination par de l’ADN génomique ( une amplification préférentielle de l’ADN est possible ) • Traiter l’ARN avec une Dnase. • Emploie: -détermination qualitative de l’expression d’un gène ARNm. -étude des rétrovirus ( HIV ) -suivie de cancer (RNA m unique) 81
  82. 82. Variantes de la PCR • • • • Reverse transcription PCR . Nested PCR . PCR Multiplex . Allele specific PCR . 82
  83. 83. Nested PCR . • Principe: le produit issu d’une première PCR est de nouveau amplifié a l’aide d’un second couple d’amorces. • Ce couple s’hybrident a une partie interne (nested /nichée) de la séquence amplifiée . 83
  84. 84. 84
  85. 85. Nested PCR • Sensibilité : considérablement augmentée deux PCR successive sont réalisé. Spécificité : accrue : deux couples d’amorces sont utilisés . limites : risque de contamination considérable ( ouvrir le tube afin d’ajouter le deuxième couple d’amorces) 85
  86. 86. 86
  87. 87. Variantes de la PCR • • • • Reverse transcription PCR . Nested PCR . PCR Multiplex . Allèle specific PCR . 87
  88. 88. PCR Multiplex • Principe: amplification simultanée de plusieurs séquences cibles (deux au moins) dans un même tube d’amplification . • Chaque amplification doit être indépendante: ( séquences cibles différentes / couples d’amorces différents) Les cibles doivent avoir une taille : peu différentes (pour obtenir a peu prés la même efficacité) mais suffisamment différentes (pour qu’on puisse les distinguer sur un gel d’agarose ,sauf si on réalise en post PCR une hybridation avec des sondes spécifiques) 88
  89. 89. PCR Multiplex Primerplex 2.0 : software pour le design des amorces de PCR multiplex. Usages : -Plusieurs cibles peuvent être détectées en même temps dans un seul tube : trousse de détection de C.trachomatis /N.gonorrhoeae -Analyse des gènes de grande taille : gène de la dystrophine2000Kb : 9 couples d’amorces pour chercher des délétions . Mise au point difficile . 89
  90. 90. 90
  91. 91. Variantes de la PCR • • • • Reverse transcription PCR . Nested PCR . PCR Multiplex . Allele specific PCR . 91
  92. 92. Allèle spécifique PCR • Technique intéressante pour distinguer deux allèles ne différant que par un, ou quelques nucléotides: -Etude d’un polymorphisme bi-allelique -recherche d’une mutation. • Principe: un mésappariement en 3’ du complexe ADN cible et amorce ralentie considérablement l’extension du duplex. Cette propriété est mise a profit dans cette technique. 92
  93. 93. Allèle spécifique PCR 93
  94. 94. P1- compatible- allèle 1 P2-compatible- allele2 P1--- mésappariement---allele2 P2---mésappariement---allele1 En absence de mésappariement l’allèle cible sera amplifié. En pratique: PCR sur 2 tubes : (P1/P3) et (P2/P3) Sujet homozygote A/A Sujet homozygote G/G Sujet hétérozygote A/G Tube P1/P3 : positif Tube P2/P3 : négatif Tube P1/P3 : négatif Tube P2/P3 : positif Tube P1/P3 : positif Tube P2/P3 : positif 94
  95. 95. Allèle specific PCR • la PCR spécifique d’allèle a été Supplanté par la PCR en temps réel qui est devenu la méthode de référence pour la discrimination d’allèles et pour l’étude du polymorphisme . 95
  96. 96. PCR EN TEMPS REEL Avant : la mise en évidence des mutations était réalisé après la PCR classique . Poste PCR : analyse des produits amplifiés (électrophorèse, chromatographie….) La PCR en temps réel permet de combiner : PCR + analyse de produit amplifié En une seule étape !!!! 96
  97. 97. PCR EN TEMPS REEL • • • • • • • • • Principe Avantages Chimies de détections Appareillage SYBR™ Green Sondes TaqMan ™ Sondes TaqMan MBG ™ Sondes FRET ™ Molecular Beacon 97
  98. 98. PCR EN TEMPS REEL Principe Détection et quantification d’un signal fluorescent émis par un fluorophore dont l’intensité d’émission est proportionnelle a la quantité de produit amplifié pendant la PCR. PCR + Analyse ----- en une seule étape . Permet le suivie en temps réel de toutes les étapes de PCR . 98
  99. 99. PCR EN TEMPS REEL Principe 99
  100. 100. PCR EN TEMPS REEL Avantages • • • • • • • • Grande sensibilité et spécificité . Grande Capacité de multiplexage. Rapidité d’amplification: 30 -60 mn (25-30cycles) . Absence de manipulation en post PCR : risque de contamination réduit (les tubes sont évacués et détruits sans jamais avoir été ouverts: automates a system fermé ) Permet l’analyse qualitative et quantitative . Analyse a haut débit . Contrôle rapide des T°, excellente homogénéité de T° dans et entre chaque tube. Cout : > PCR classique ( gain de temps et de main-d'œuvre considérable) ex : 2€ /3€ RT-PCR (dépend de la chimie) 100
  101. 101. PCR EN TEMPS REEL Chimies de détections • S’intercalent entre les deux hélices de l’ADN double brin. SYBR™ Green Agents intercalant Sondes d’hybridation • 1seule sonde linéaire marqué en 5’,3’ ou les deux. Sondes TaqMan ™ • 2 sondes linéaires (1-5 pb) marqués: 5’,3’ ou les deux Sondes FRET ™ • Structure tige boucle : balises moléculaires . 101
  102. 102. PCR EN TEMPS REEL Chimies de détections 102
  103. 103. PCR EN TEMPS REEL Appareillage • Différent par : capacité d’échantillonnage. durée des cycles. capacité de détection des différentes chimies . thermocycleur Compartiment de détection de la fluorescence Traitement du signal 103
  104. 104. PCR EN TEMPS REEL Appareillage À grande capacité À débit moyen Analyse a grande échelle. Ne sont pas compatible avec toutes les chimies de détections disponibles . Capacité moyenne (32-96 échantillon par essai) Flexibilité exceptionnelle Light cycler 2.0® ( Roche diagnostics) ABI Prism ® 7000,7700,7900 iCycler Iq ® ( BioRad) Mx 4OOO®( Stratagene) Certains Permettent la détection de toutes les chimies actuellement disponibles: RotorGene® (Corbett Research) Smart Cycler® (eurogentec) 104
  105. 105. PCR EN TEMPS REEL Appareillage Light cycler 2.0® ( Roche diagnostics) 105
  106. 106. PCR EN TEMPS REEL Appareillage ABI Prism ® 7900 106
  107. 107. PCR EN TEMPS REEL SYBR™ Green • Agent intercalent, se lie a l’ADN double brin. • Une fois liée , ↑ du signal fluorescent . 107
  108. 108. PCR EN TEMPS REEL SYBR™ Green Principe: au cours de l’hybridation et l’extension: le SYBR Green s’intercale et émet une fluorescence. La fluorescence chute après la dénaturation du cycle suivant Acquisition de fluorescence une fois /cycle (7090°C) . La quantité du signal suivie en PCR en temps réel augmente proportionnellement au produit amplifié formé (effet quantitatif) 108
  109. 109. PCR EN TEMPS REEL SYBR™ Green Avantages inconvénients -Moins toxique et plus sensible -Ne différencie pas deux fragments de même que le BET. -Spectre de fluorescence compatible avec les instruments de détections utilisés. -Economique / (sondes) -Facilité de mise au point et d’utilisation taille (allèles-multiplex) Possibilité de multiplexage reduite. -Insensible a la présence de mismatch dans le produit d’amplification : s’intercale sur les produit d’amplification spécifiques , non spécifiques et même sur les dimères d’amorces = absence total de spécificité . -Suppression de fluorescence non spécifique en: *réalisant l’acquisition du signal a une T° supérieur au Tm des produits parasites . *Optimiser le dessin d’amorces *Faire une hot start 109
  110. 110. PCR EN TEMPS REEL Sondes TaqMan ™ • Première chimie de PCR en temps réel , élaboré par la société Perkin Elmer « Applied Biosystem » pionnier dans le domaine de la PCR en temps réel . • Chimie basé sur : transfert d’énergie par résonance : FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfert) • Sondes très fréquemment utilisés. 110
  111. 111. PCR EN TEMPS REEL REM Sondes TaqMan ™ fluorophore Etat initial Onde Electromagnétique (ʎ: fonction du ʎ fulorophore- visible) Si une substance est susceptible d’absorber la lumière émise par un fluorophore est suffisamment proche ( quencher=extincteur) le REM émis est absorbé par le quencher et aucune lumière n’est émise . FRET : Fluorescence Résonance Energy Transfert 111
  112. 112. PCR EN TEMPS REEL Sondes TaqMan ™ Sondes monobrin de 15 a 30 nucléotides , Complémentaire a la partie centrale de la cible. Tm> Tm amorces. principe : activité 5’-3’ exo nucléase de la Taq Polymérase . Lors de l’élongation la Taq Pol rencontre la sonde et la détruit ( nom Taq Man /analogie jeux PacMan) Fluorophore et quencher ne sont plus a des distances ou le Transfert d’énergie est possible . Fluorophore excité--- émettre une lumière ---- photomultiplicateur . 112
  113. 113. PCR EN TEMPS REEL Sondes TaqMan ™ • La quantité de lumière émise quantité de sonde détruite quantité de produit de PCR synthétisé 113
  114. 114. PCR EN TEMPS REEL Sondes TaqMan ™ Aspect de la fluorescence après amplification par PCR en temps réel Sondes TaqMan 5 échantillons , chacun représenté par une couleur distincte 114
  115. 115. PCR EN TEMPS REEL Sondes TaqMan ™ Avantages : Sensibilité élevée Grande spécificité ( SYBR Green) Meilleur capacité de multiplexage ( cibles de mêmes taille « allèles » : fluorophore différents Rapidité Inconvénients: Difficulté de détection de certaines mutations localisées dans des régions de séquences répétés (sondes a longues séquences ) Applications: Mutations ponctuels Polymorphisme biallelique QUANTIFICATION : les plus utilisées apres SYBR Green pour la quantification de gènes et d’agents pathogènes. 115
  116. 116. PCR EN TEMPS REEL Sondes TaqMan ™-MGB • Sondes de 12-20 bases. • 3’: quencher auquel est accroché une MGB (peut s’insérer dans les petits sillons de la double hélice formé par la sonde et la cible , stabilité+++ ͠ ↑ Tm malgres des séquences plus courtes) • Contraintes du design des sondes moins strictes. 116
  117. 117. PCR EN TEMPS REEL Sondes TaqMan ™-MGB Avantages : Sensibilité est augmenté (quenching ↑) Meilleur efficacité de détection des mutations dans les régions a séquences répétés. Applications: Mutations ponctuelles Polymorphisme bialleliques Agents pathogènes ( bactéries , virus et parasites ….) Quantification d’acides nucléiques ou d’ agents pathogènes 117 Cout extrêmement élevée , disponibilité Réduite .
  118. 118. PCR EN TEMPS REEL Sondes FRET ™ 118
  119. 119. PCR EN TEMPS REEL Sondes FRET ™ • le système utilise un couple de sondes d’hybridation très courtes portant chacune un fluorophore . La particularité de ce système réside dans le fait que le processus de transfert d’énergie par FRET s’effectue entre deux fluorophores séparés par moins de cinq nucléotides. • Le transfert d’énergie est alors direct et hautement efficace : une fois les deux sondes appariées à leur séquence cible tout en restant adjacentes l’une envers l’autre, l’énergie libérée par le fluorophore donneur de haute énergie est directement captée par le fluorophore accepteur de moindre énergie qui ainsi excité émet à son tour un signal fluorescent mesurable. 119
  120. 120. PCR EN TEMPS REEL Molécular Beacons 120
  121. 121. PCR EN TEMPS REEL Molécular Beacons -Une sonde BeaconTM est une sonde d’hybridation en épingle à cheveux qui porte à son extrémité 5’ un groupement fluorophore et à celle 3’ un groupement fluorophore quencher . Elle possède une structure particulière de type tige boucle dans laquelle les bras de la tige résultent de l’appariement de ses extrémités complémentaires ; la boucle est spécifique et complémentaire de la séquence cible à détecter. Dans ce type de sonde, la proximité des deux groupements fluorophores est imposée par la structure secondaire en épingle à cheveux de la sonde, ainsi dénommée sonde phare. En présence de la séquence cible complémentaire, la sonde s’apparie de façon spontanée à cette cible et subit un changement de conformation au cours duquel le quencher s’éloigne du fluorophore emetteur alors capable d’émettre une fluorescence mesurable 121
  122. 122. PCR EN TEMPS REEL Molécular Beacons Avantages :grande spécificité les balises moléculaires demeurent intactes apres PCR Inconvénients: cout très élevée difficulté du dessin optimal de la partie double brin de l’amorce. Applications : 1- détection des mutations ponctuels ou de polymorphisme bi-allelique a grande échelle. 2-Quantification d’Acides nucléique et d’agents pathogènes 122
  123. 123. PCR EN TEMPS REEL Conclusion • L’inconvénient des techniques basées sur le FRET est qu’elles utilisent des Sondes difficile à synthétiser . cout élevé +++ . • Une autre possibilité plus économique est le SYBR Green , celle-ci s’accompagne néanmoins d’une perte de spécificité a laquelle on peut remédier dans certaines limites . 123
  124. 124. QUANTIFICATION • Le developpement de la PCR à révolutionner le domaine de la quantification des acides nucléiques . • Les techniques de quantification sont appliqués a la biologie clinique ( étude de l’expression d’un gène) mais surtout en virologie ( détermination de la charge virale en routine) 124
  125. 125. PCR quantitative PCR quantitative En point final En temps réel 125
  126. 126. PCR quantitative En point final • Mise au point particulièrement complexe. • Nombreuses stratégies décrites dans la littératures ce qui reflète la difficulté d’obtenir des résultats de quantification fiable par PCR malgré une attrayante possibilité théorique !! • L’évolution Exponentielle ( petite variation dans le rendement/cycle →modification considérable du nombre de copies obtenues en fin de réaction .) 126
  127. 127. PCR quantitative En point final • Principe: exploitation de la cinétique de la réaction PCR . • Rendement : n cycles : 2ⁿ copies exacte si le rendement était de 100℅ En pratique: X n = X˳ ( 1+ r ) , 0 ˳ R ˳ 1 . • Une différence de 5℅ par cycle modifie d’un facteur 3 le nombre de copies âpres 30 cycles. • Effet plateau : due a la diminution du rendement 127
  128. 128. PCR quantitative En point final Quantité de produit formé proportionnelle a la quantité d’ADN de départ . il n’ya plus de proportionnalité . 128
  129. 129. PCR quantitative En point final Quantification relative : compare 2 Quantification absolue concentrations relatives d’acide nucléiques . ADN: des PCR multiplex permettent d’effectuer des dosages de gènes et mettre en évidence un individu porteur de délétion : sujet N: locus N/ locus Analysé 2:2 sujet hétérozygote : 2:1 délété au niveau du locus étudié. ARN: analyse de l’expression des gènes . ARN m nécessite d’un standard interne endogène ou exogène. Détermination d’un titre exacte d’un acide nucléique cible dans un échantillon . Nécessite un standard titré. Difficulté particulière de mise en œuvre pour les ARN a cause des rendement faibles et très variables des étapes de transcription inverse . 129
  130. 130. PCR quantitative En point final Standard externe -Solution titré d’ ADN de séquence identique à celle de la cible à quantifier -Série de dilutions de raison 10 (4-5points) = gamme étalon . -Déterminer le nombre de cycles idéale : amplification efficace tout en restant en phase exponentielle . -Chaque dilution ainsi que l’échantillon sont soumis a une PCR. -Post PCR: quantification des produits formés par mesure de fluorescence. (BET) ou colorimétrie. -Avantages : rapide. plusieurs échantillons en même temps Inconvénients: différence de rendement de PCR d’un tube a l’autre . Nécessite un thermocycleur de qualité . Possibilité de présence dun inhibiteur de la taqPoly dans le tube patient . ( reproductibilité +- aléatoire) Risque de variation du rendement d’un tube a l’autre 130
  131. 131. PCR quantitative En point final Standard Externe 131
  132. 132. PCR quantitative En point final Standard interne / PCR compétitive : palie au inconvénients précédents Méthode de choix pour la quantification d’acides nucléiques par PCR . Coamplification a l’aide des mêmes amorces dans le même tube de l’échantillon à quantifier (ADN/ARN) et du standard Le standard et la cible ne diffère que de quelques bases , pour que les produits formés puissent être détectés ( électrophorèse) et quantifiés séparément . Dans ces conditions les facteurs susceptibles d’influencer la réaction affectent d’une manière très similaire standard et cible . Faire une dilution sérielle du standard. X n = X˳ ( 1+ r ) Xn Y˳= X ˳ Yn Y n = y˳ ( 1+ r ) Applications: Détermination de la charge virale (VIH –HCV) : élément 132 prédictif voir facteur de décision thérapeutique .
  133. 133. PCR quantitative En point final Standard Interne 133
  134. 134. PCR quantitative En point final • La PCR semi-quantitative est une PCR après laquelle (technique en point final) la quantité de produit est quantifiée sur gel. En parallèle, est effectué un témoin positif (standard) d’amplification dont la quantité est inchangée dans les différentes conditions comparées. • En pratique: Réaliser un nombre limitant de cycles de PCR de façon à se situer -au dernier cycle- dans la partie exponentielle de la courbe d'amplification. C'est souvent la méthode utilisée pour détecter des aneuploidies ou des délétions. • Cette méthode est parfois appelée PCR semi-quantitative car elle ne permet pas de quantifier précisément un nombre de copies initial d'ADN; cependant c'est une méthode très efficace pour détecter un excès (duplication, trisomie) ou un défaut (délétion, monosomie) de matériel génétique. 134
  135. 135. Recherche de délétions par QMPSF (Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments) • Amplifier /PCR plusieurs exons du gène a tester (1seul tube en multiplex) • Chaque exon/couple d’amorces spécifiques et l’une d’entre elles est marqué. • Les conditions de la PCR sont quantitatives (cycle limitant). • Dans un premier tube : ADN du patient a tester . • Dans un deuxième : ADN témoin qui ne porte pas de délétion . • On superpose les signaux de fluorescence: témoin/patient • Permet de détecter les grandes deletions a l’etat hétérozygote . 135
  136. 136. Recherche de délétions par QMPSF (Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments) 136
  137. 137. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) • La Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) est une technique robuste de quantification génique basée sur la ligation et l’amplification d’oligonucléotides. • Sa fiabilité et son efficacité ont été largement éprouvées et ne sont aujourd’hui plus à démontrer. • Permet le détection de la variation du nombre de copies d’un LOCUS ( trisomie 21 ) 137
  138. 138. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification • Principe: ce n’est pas la sequence cible qui est amplifié, mais la sonde MLPA hybridé à la cible. • 1 seule paire d’amorces est utilisé. • Les produits d’amplifications sont analysé par électrophorèse et comparé avec un temoin. • Elle permet de savoir quelle séquence présente un nombre aberrant de copies 138
  139. 139. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification 139
  140. 140. PCR quantitative En temps réel • Les techniques en point final donnent des résultats satisfaisants mais de mise en œuvre difficile. • La quantification en temps réel présente de nombreux avantages : -sensibilité ,reproductibilité , grande souplesse, rapidité -Quantification cinétique . En temps réel . -Applicable à Analyse a grande échelle -Automatisable ( analyse en routine) -Excellente linéarité 10 à 10⁸ copies . -Réalisation en tube fermé. 140
  141. 141. PCR quantitative En temps réel • On fait une dilution en série d’un plasmide contenant le gène cible . • Le déplacement horizontal : plus il ya de cibles amplifiées , plus l’amplification se fait précocement . • La quantité de cible est déduite de son cycle seuil (threshhol cycle : temps necessaire pour que la fluorescence atteigne une valeure seuil) en se rapportant sur la courbe d’étalonnage. • Les calculs sont habituellement réalisés par des logiciels de quantification intégrés dans les appareils de PCR en temps réel. 141
  142. 142. Cycle seuil • Un seuil de fluorescence est établi par le programme de la machine de PCR en temps réel. Une fois que la quantité d'ADN permet aux sondes fluorescentes de dépasser ce seuil alors on obtient un numéro de cycle PCR appelé "Ct"pour "Cycle Threshold" ou cycle seuil. • C'est cette valeur qui est à la base des calculs pour quantifier l'ADN de façon absolue ou relative 142
  143. 143. 143
  144. 144. PCR quantitative En temps réel • La quantification peut être : Absolue . Relative : le gène d’intérêt est exprimé par rapport à un gène référence ou Housekeeping gène ( std interne) • les gènes de références les plus utilisés : gène de la GA3PD gène de la B actine gène de la B2 microglobuline. gène de l’albumine 144
  145. 145. PCR quantitative Applications 1-Microbiologie: • Détection de plusieurs pathogènes dans un même tube (multiplexage/différentes chimies de détections) • Bacteriologie:domaine ou la PCR en temps réel trouve la meilleur indication : -MEV des bactéries a culture lentes (Mycobacterium tuberculosis,Bordetella pertusis, Legionelles Mycoplqsme…..) -germes non cultivables -recherche de meningite ( nécessité de détection rapide) • Virologie: HBV,HCV,CMV,VIH détection des mutation de résistances aux antiviraux 145
  146. 146. PCR quantitative Applications • Domaine agro-alimentaire : détection des germes : salmonelles, coliformes fécaux ….. • Oncologie • Immunologie • …… 146
  147. 147. CONCLUSION • La PCR est probablement l'une des découvertes scientifiques les plus importantes des dernieres décennie. Grâce à cette technique, la biologie moléculaire a accompli en 10 ans des progrès sans précédents. • D’autres techniques d’amplification on été proposés , leur mise au point est complexe et leur utilisation reste limité a des kits de diagnostic commerciaux . • Leur motivation est plus de contourner le brevet de la PCR que d’augmenter les performances . 147
  148. 148. Documentation • Principes de biologie moléculaire en biologie clinique Marc Bogard, Jérôme Lamoril, Nedjma Ameziane • Biologie moléculaire et médecine Jean-Claude Kaplan, Marc Delpech • Schouten JP et al. (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification Nucleic Acids Res 30, e57. • Aretz, S. et al. (2007). High proportion of large genomic deletions and a genotype phenotype update in 80 unrelated families with juvenile polyposis syndrome J Med Genet. 44, 702-709. • Redeker, E.J., et al. (2008). Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) enhances the molecular diagnosis of aniridia and related disorders Mol Vis 14, 836-840. • Laboratoire de Génétique Moléculaire Humaine et laboratoire SESEP Equipe de l'EA2493, UFR de médecine Paris Ile de France Ouest http://www.sesep.uvsq.fr/formation/methodes.html 148

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