1.
La culture de cellules animales,
quosse ça donne?
Alain Garnier, Université Laval

2.
Plan
• La culture de cellules animales:
– Qu’est-ce?
– Pourquoi?
– Comment?

3.
Qu’est-ce?
• Différentes sources
• Différents types
• techniques de transformation
• Caractéristiques générales

4.
Sources
• Insectes
• Poissons
• Mammifères
• Humains

5.
Formes/tissus
• Épithéliales/endothéliales (membranes)
• Fibroblastes (tissus connectifs)
• Myoblastes (muscles)
• Neurones (syst. nerveux)
• Hepatocytes (foie)
• Erythrocytes (sang)
• Lymphocytes (syst. immunitaire)

6.
Formes...

7.
Types
• Culture primaire: Culture initiale de cellules qui
viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée.
Généralement à attachement obligatoire (ADC).
• Culture secondaire: Propagation d’une culture
primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut
être cultivé en suspension. Peut être indifférencié.
Durée de vie limitée (30-50 divisions).
• Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire
transformée. Peut être cultivée en suspension.
Durée de vie illimitée.

8.
Transformations
• Naturelles
• Chimiques
• Virales
• Dirigées

9.
Différentes lignées
• MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons
humains, adhérentes, vaccins
• HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable,
adhérentes, recherche
• CHO: ovaire de hamster chinois, stable,
adhérente/suspension, versatile
• Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente,
versatile
• Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression
baculovirus
• 293: embryon de rein humain, transformée par fragment
d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la
suspension (293S)

10.
Exemple: l’historique de la mise
en culture des 293
Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977

11.
Caractéristiques générales
• Capable d’exocytose
• Ne sécrète pas d’enzymes
• Modifications post-traductionnelles
• Introns/épissage (splicing)
• Besoins nutritionnels complexes
• Grande taille (10-20 µm), pas de paroi
• Sensible au contraintes hydrodynamiques
• Temps de division lent (approx. 1 jour)
• Densité cellulaire faible

12.
Modification post-traductionnelle
• Clivage
• Pont S
• méthylation, phosphorylation, glycosylation
• conformation
• ajout de ligands spécifiques (lipid anchor)

13.
Glycosylation

14.
Introns/Exons, Epissage (splicing)

15.
Pourquoi?
• Pour l’étude
• Pour la production:
– Vaccins
– Protéines thérapeutiques
• anticorps
• agents immunologiques
• Hormones
– Tissus
– Vecteurs viraux
– Cellules souches

16.
34% des nouveaux médicaments sont produits
en culture de cellules de mammifères
34%
21% 22%
12% 12%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
%
Cell. Mam. Microbe Vaccins Extr/Synthèse Thérapie
génique
% de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)

17.
Les anticorps
Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec
un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de
polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa
(chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de
l’anticorps pour son antigène

18.
Production d’anticorps monoclonaux
MAb

19.
Anticorps monoclonaux - applications
• 37% des nouvelles molécules thérapeutiques
biologiques
• Identification/diagnostic
• Thérapeutique:
– Contre cancer, Crohn, Asthme, SIDA, etc.
– Dirigés contre une protéine spécifique, ils peuvent
bloquer une interaction récepteur-ligand ou déclencher
une réponse immunitaire.
– Ils peuvent aussi être liés à un agent
chemothérapeutique, radioactif ou autre pour
augmenter leur effet.

20.
Autres protéines
• Erythropoïétine (EPO, traitement de
l’anémie)
• Hormones de croissance:
– Transforming Growth Factor (TGF)
– Epidermal Growth Factor (EGF)
– Nerve Growth Factor (NGF)
• Anovulants
• Cytokines (Interleukine, interféron, etc)
• Agents coagulants (Facteur viii), anti-
coagulants, etc

21.
Interleukin 4

22.
Exemple: Agent anti-angiogénétique
(Laboratoires Aeterna)
Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux
vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la
tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce
processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron
de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes
responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans
des cellules animales.

23.
Influenza
Herpes Adenovirus
Production de vaccins

24.
Thérapie génique

25.
Maladies traitées

26.
Vecteurs utilisés
Adénovirus
Rétrovirus
La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel
génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche.

27.
Culture de tissus
• Cellules de peau (Hopital du Saint-
Sacrement, Laboratoire d'organogénèse
expérimentale)
• Reconstruction de la moëlle épinière
(Organogel inc.)
• Organes (foie, cœur, cerveau, etc)
• Cellules souches

28.
Comment?
Caractéristiques générales
– Capable d’exocytose
– Ne sécrète pas d’enzymes
– Modifications post-traductionnelles
– Introns/épissage (splicing)
– Besoins nutritionnels complexes
– Grande taille (10-20 µm), pas de paroi
– Sensible au contraintes hydrodynamiques
– Temps de division lent (approx. 1 jour)
– Densité cellulaire faible

29.
Exemple de milieu de culture:
Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM)
• Sels (mg/L)
– CaCl2 200.00
– Fe(NO3)3.9H2O 0.10
– KCl 400.00
– MgSO4 97.67
– NaCl 6400.00
– NaHCO3 3700.00
– NaH2PO4.H2O 125.00
• Acides aminés (mg/L)
– Arginine 84.00
– Cystine.2HCl 63.00
– Glutamine 584.00
– Glycine 30.00
– Histidine 42.00
– Isoleucine 105.00
– Leucine 105.00
– Lysine.HCl 146.00
– Méthionine 30.00
– Phenylalanine 66.00
– Sérine 42.00
• + mélange d'additifs non-définis
– Méthionine 30.00
– Phenylalanine 66.00
– Serine 42.00
– Thréonine 95.00
– Tryptophane 16.00
– Tyrosine.2Na.2H2O 104.00
– Valine 94.00
• Vitamines (mg/L)
– Ca.pantothénate 4.00
– Chlorure de choline 4.00
– Acide folique 4.00
– Inositol 7.20
– Niacinamide 4.00
– Riboflavine 0.40
– Thiamine.HCl 4.00
– Pyridoxine.HCl 4.00
• Autres (mg/L)
– Glucose 4500.00
– Rouge de phénol 15.00
– Na.Pyruvate 110.00

30.
Sensibilité aux contraintes
hydrodynamiques
= problème d’oxygénation ou d’agitation
•Pourtant les besoins en O2 des cellules animales ne sont pas si
élevés
X (densité
cellulaire)
QO2 (taux de
respiration
spécifique)
Oxygen
respiration rate
(OUR, mM/L)
Bactéries 5-50 gMS/L 0.01
mole/(gMS.h)
50-500
Cellules
animales
1-50 E6
cells/mL
10-20 E-14
mole/(cell.h)
0.1-10

31.
Les cellules animales ne supportent que de très petites
contraintes hydrodynamiques, ce qui fait en sorte que toutes
sorte d’indice de sévérité de l’agitation on été proposés:
ISF
D
D D
i
T i
=
•
−
Ω
D PE s= ( / ) /
ν3 1 4
U PE s= •( ) /
ν 1 4
Integrated Shear Factor (Sinskey)
Taille du plus petit tourbillon (Théorie de Kolmogoroff)
Vitesse du plus petit tourbillon
TCS: Turbulent collision severity (Cherry et Papoutsakis)
ICS: Impeller collision severity
C K PE s= •( ) /
ν
3 3 4
Concentration en plus petit tourbillon

32.
Plusieurs géométries de bioréacteurs ont été
proposées:
• différentes formes d’agitateur
– marine
– ruban hélicoïdal
– «voiles»
• gazosyphon
• lits fluidisés
• transfert de gaz par tube de silicone
• enrichissement en oxygène

33.
Agitateur «voiles» Lit fluidisé

34.
Division lente, faible densité
• Facilement contaminable
– une bactérie prendra facilement le dessus
– Nécessite des conditions d'asepsie très strictes
• Faible rendement en produit
– produit à haute valeur ajoutée
– produit qui ne peut être synthétisé dans d’autres
systèmes d ’expression
– Recherche de moyens pour augmenter la
densité cellulaire...

35.
Au niveau cellulaire: le mécanisme de débordement
-Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma)
GLUCOSE PYRUVATE
TCA cycle,
resp. chain
lactate
glucose pyruvate
GLUTAMINE
GLUTAMATE
OU
glutamine
NH3
NH3
glutamate

36.
Au niveau du procédé
• L’optimisation du milieu prend du temps,
mais permet de faire de grandes économies
• La cuvée alimentée peut permettre
d’augmenter la densité cellulaire dans le cas
d’un substrat inhibiteur ou d’un produit
inhibiteur dont la production dépend de la
concentration en substrat.
• Le chemostat ou la perfusion vont permettre
une augmentation de la densité cellulaire et
de la productivité, mais avec un coût plus
élevé en milieu de culture

37.
Au niveau du bioréacteur
– Microporteurs (poreux ou non)
– Micro-capsules
– Fibres creuses
– Rétention des cellules (perfusion):
• Spin-filters (intra ou extra bioréacteur)
• centrifugeuse en continu
• Sonosep

38.
Microporteurs

39.
Exemple: Un filtre rotatif intra- bioréacteur, combiné à un aérateur

40.
Fibres creuses

41.
Centrifugeuse en continu

42.
Sonosep: séparation acoustique
Entrée
Sortie
Vidange

43.
Conclusion
• La culture de cellules animales est coûteuse
et complexe.
• Elle ne doit être utilisée que pour produire
des molécules qui ne peuvent être obtenues
autrement.
• Elle permet alors de synthétiser des produits
à très haute valeur ajoutée