1. fMOST — fluorescence Mirco-Optical Sectioning
Tomography
фМОСТ — флуоресцентная Микро-Оптическая
Секционная Томография
Получение полной структуры мозга мыши с одномикронным
разрешением и трассировка аксонов по всему мозгу.

2. Micro-Optical Sectioning Tomography to Obtain a
High-Resolution Atlas of the Mouse Brain
Anan Li, Hui Gong, Bin Zhang, Qingdi Wang, Cheng Yan
Development of a Plastic Embedding Method for
Large-Volume and Fluorescent-ProteinExpressing Tissues
Zhongqin Yang, Bihe Hu, Yuhui Zhang, Qingming Luo, Hui Gong
Continuously tracing brain-wide long-distance
axonal projections in mice at a one-micron voxel
resolution
Hui Gong, Shaoqun Zeng, Cheng Yan, Xiaohua Lv, Zhongqin Yang

3. MOST — разработка метода

5. Пробоподготовка
●
Крашение по
Гольжи-Коксу:
K2Cr2O7
●
К2CrO4
●
●
●
HgCl2
180 дней

6. Пробоподготовка
●
●
●
Дегитратация
Градиент ацетона и
спирта
Фиксация в
полимере
●
ERL-4221, DER763, NSA, DMAE

8. Процессинг изображений
●
Удаление периодического шума
●
Нормализация интенсивности
●
Калибровка

9. Статистика
●
36 млн. изображений (1390 x 1500 px x 8 bit)
●
15400 срезов
●
8 терабайт сырых данных
●
240 часов работы
●
3,6 мм3/час — скорость работы
●
●
После реконструкции структуры:
1 x 0,33 x 0,33 мкм — размер вокселя

12. fMOST — модификация MOST
●
●
●
●
Отказ от длительного
прокрашивания всего
мозга
●
Отказ от серийного
крашения срезов
Выбор селективного
флуоресцентного мечения
нейронов
Выбор трансгенных
мышей, селективно
экспрессирующих XFP
●
Отсутствие методик
фиксации
флуоресцентных
образцов большого
объѐма
Падение
интенсивности
флуоресценции при
фиксации
Объект — мыши с eYFP-H под контролем промотора Thy1.

13. Выбранные полимеры
GMA — 2-гидроксиметил-метакрилат
●
LR white — полигидрокибисфенол-Адиметакрилат
●
HPMA — гидроксипропил-метакрилат
●
Unicryl — метилметакрилат + стирен
Отрабатываемые параметры
●
Падение интенсивности флуоресценции
●
Время пропитки целого мозга
●

14. Оптимизация
●
Падение
флуоресценции
●
Полнота пропитки
25
200%
20
150%
15
100%
10
Дни
250%
50%
5
0%
0
HPMA
GMA
Unicryl
LR White
HPMA
GMA
GMA
Unicryl
LR White

15. Оптимизация GMA
●
●
Понижение
температуры
полимеризации с
60º до 55º
Коррекция pH 0,1%
V этаноламина.
●
Удаление
ингибитора 4метоксифенола
(тушитель)

17. fMOST – применение метода
Объекты:
Параметры и статистика:
 Мозг взрослой мыши
Thy1-GFP-M
o Ширина среза для GFP
и 14 дн. YFP 300 мкм
 Мозг взрослой мыши
Thy1-eYFP-H
o Воксель 0,5x0,5x2 мкм
 Мозг мыши 14 дн.
Thy1-eYFP-H
o Ширина для взрослой
YFP 150 мкм
o Воксель 1x0,8x2 мкм

19. Трассировка аксонов
Пересчѐт существующей
аннотаций мозга:
 FPMA взросл.
 MRI 14 дн.
 MRI взросл.
 fMOST 14 дн.