Tesis actividad bactericida

EVALUACIÓN DEL MÉTODO DILUCIÓN NEUTRALIZACIÓN APLICADO A UN
DESINFECTANTE SEGÚN LA NORMA TÉCNICA
COLOMBIANA 5473 DE 2007
JUAN CARLOS MARÍN DIAZ
NATALIA FERNANDA NAVARRO PEÑA
NATALIA SANTOS ARÉVALO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el titulo de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTÁ, D.C.
2008

NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

NATHALIA FERNANDA NAVARRO PEÑA
APROBADO
__________________________________ _______________________________
Libardo Hernández, Químico Farmacéutico Janeth del Carmen Arias, Bacterióloga
Director Asesor
Cindy Fernandez, Microbióloga Industrial Joel Guarín, Químico Farmacéutico
Jurado Jurado

NATHALIA FERNANDA NAVARRO PEÑA
APROBADO
_______________________ _______________________
Dra. Angela Umaña, MPhil. Janeth Arias, Bacterióloga.
Decano Académico Director de Carrera

DEDICATORIA
Dedico este trabajo a la razón de mi vida, Marianita, mi hija; a mis padres por su apoyo
incondicional y a Dios por las grandes oportunidades que me ha puesto en el camino.
Nathalia Fernanda Navarro.
A mis padres por su esfuerzo, dedicación y por el inmenso amor que cada día están
dispuestos a ofrecerme. A William por enseñarme a amar sin condición y por impulsarme a
ser cada vez mejor. Y sobre todo, a Dios, por permitirme crecer y lograr mis metas, por
ayudarme a ser lo que soy en este momento.
Natalia Santos Arévalo.
Dedico este trabajo al señor Lobo y a mi negra por hacer posible día a día la realización de
mis metas, a Karen por su apoyo, a Adriana, Martha y Marcela por su valiosa amistad y
especialmente a Dorita quien estaría muy orgullosa de mi….
Juan Carlos Marín Díaz

vi 
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al Laboratorio VICAR S.A. por hacer posible la realización de este proyecto,
especialmente al Profesor Libardo Hernández por su asesoría y su ayuda y a las
microbiologas Nubia Castro y Viviana Peña por su paciencia, interés y apoyo.
Agradecemos a nuestra Profesora Janeth Arias, por su compañía y constantes palabras de
aliento.

vii 
TABLA DE CONTENIDO
Pag.
1. INTRODUCCION 3
2. MARCO TEORICO
2.1. El proceso de desinfección 5
2.2. Características de un desinfectante ideal 6
2.3. Modo de acción de los desinfectantes 7
2.4. Factores que influyen en la acción química de los desinfectantes 7
2.4.1. Limpieza adecuada 7
2.4.2. Carga orgánica 7
2.4.3. Tipo y porcentaje de microorganismo 7
2.4.4. Tiempo y temperatura 7
2.4.5. Ph 7
2.4.6. Nivel de dureza del agua 8
2.5. Importancia de la evaluación de desinfectantes
2.6. Evaluaciones de neutralización como experimentos de
control para los test de eficacia antimicrobiana. 9
2.6.1 Métodos De Evaluación De Desinfectantes 9
2.6.2 Neutralización por inhibición química 9
2.6.3. Neutralización por dilución 10
2.7. Factores que afectan la neutralización de los antimicrobianos 10
2.7.1. Eficacia del Neutralizante 10
2.7.2. Toxicidad del Neutralizante 11
2.7.3. Diseños Para Evaluación De Neutralizantes 11
2.7.3.1. Recuperación en medio sólido 11
2.7.3.2. Recuperación en medio líquido 11
2.7.3.3. Recuperación por Filtración por Membrana 11
2.8. Normativa mundial sobre evaluacion de desinfectantes 12
2.8.1. Normas AFNOR 12
2.8.2. Normativa Europea 13
2.8.3. Normativa estadounidense 14
2.8.4. Normativa Colombiana. 15
3. JUSTIFICACIÓN 16
4. OBJETIVOS. 17
5. MATERIALES Y MÉTODOS. 18
5.1 Diseño de la investigación 18
5.1.1 Población de estudio y muestra 18
5.1.2 Variables del estudio 18
5.2. Métodos 18
5.2.1. Materiales 18
5.2.2. Medios de cultivo 18
5.2.3. Reactivos 19
5.2.4. Equipos 19
5.3. Metodología 19
5.3.1. Establecimiento de las condiciones experimentales para
el método de ensayo dilución-neutralización 19
5.3.2. Implementación del método de ensayo dilución-neutralización
según la norma técnica colombiana 5473 del 2007 21

viii 
5.3.2.3. Determinación de las concentraciones bactericidas 21
5.3.2.4. Verificación de la ausencia de cualquier efecto letal en las
condiciones del ensayo (parámetro A de la condición experimental) 22
5.3.2.5. Verificación de la ausencia de toxicidad del neutralizante
(parámetro B de control del neutralizante) 22
5.3.2.6. Parámetro de estandarización del método 22
5.3.2.7. Incubación y recuento de la mezcla de ensayo y de las mezclas de control y
estandarización 23
5.3.3. Verificación de la metodología 37
5.4. Recolección de la información 37
5.5. Análisis de información 38
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Establecimiento de las condiciones experimentales para el
método de ensayo dilución-neutralización. 41
6.2. Implementación y Verificación del método de ensayo
dilución-neutralización según la norma técnica colombiana 5473 del 2007. 41
6.2.1. Preparación de la Suspensión de Ensayo y Validación 41
6.2.2. Evaluación de las condiciones experimentales - Control A. 43
6.2.3. Verificación de la ausencia de toxicidad del neutralizante – Control B 44
6.2.4. Validación del método Dilución Neutralización – Control C 45
6.2.5. Ensayo NA – Método Dilución Neutralización 47
7. CONCLUSIONES 51
8. RECOMENDACIONES 52
9. REFERENCIAS 53
10. ANEXOS 55

RESUMEN
En el ámbito médico, la desinfección constituye un procedimiento esencial para enfrentar
la cadena de transmisión de infecciones. El objetivo de este estudio fue evaluar el método de
dilución neutralización propuesto en la Norma Técnica Colombiana 5473 de 2007, mediante
la utilización de un desinfectante en gel a base de alcohol. El ensayo se efectuó utilizando
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus
hirae ATCC 10541, como microorganismos de ensayo. Las temperaturas bajo las cuales se
realizó el estudio fueron 20±1°C como temperatura obligatoria y 36±1°C y se emplearon
cuatro tiempos de contacto entre el desinfectante y los microorganismos evaluados (0,2,5,10
minutos). El método fue realizado bajo condiciones limpias (0.3 g/l de albumina de suero
bovino) y sucias (3g/l de albumina de suero bovino y 3g/l de eritrocitos de oveja). La
implementación del método arrojó resultados precisos en cada una de las seis repeticiones
realizadas en el ensayo. Los resultados obtenidos demostraron una reducción logarítmica
superior a cinco, evidenciando la actividad bactericida ejercida por el desinfectante frente a
los microorganismos control. El establecimiento de las condiciones experimentales y de la
metodología demostró no incidir negativamente en el crecimiento de cada una de las cepas.
Igualmente, el neutralizante utilizado no inhibió el desarrollo de los organismos de ensayo.
El método fue verificado mediante el cumplimiento de los límites básicos establecidos por la
norma. Los resultados sugieren que el método evaluado mediante la implementación del
protocolo establecido en la Norma Técnica Colombiana 5473 de 2007, permite evaluar la
eficacia de un desinfectante bajo condiciones experimentales escogidas y controladas.

ABSTRACT
In the medical area, disinfection constitutes an essential procedure in order to face the chain
of transition of infections. The aim of this study was to evaluate the dilution-neutralization
method proposed in the Colombian Technical Norm 5473/07, by using a gel alcohol-based
disinfectant. This study was made using Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442,
Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Enterococcus hirae ATCC 10541 taken as essay
microorganisms. The study was realized to 20±1°C as obligatory temperature and
additionally to 36±1°C. Four times of contact between microorganism and disinfectant were
evaluated (0, 2, 5 and 10 minutes). The essay was realized both under clean conditions (0.3
g/l of albumen of bovine serum), and dirty conditions (3 g/l of albumen of bovine serum and
3g/l of sheep erythrocytes). The implementation of this method got precise results in each of
six repetitions realized during the essay. The obtained results demonstrated a logarithmic
reduction up to five, demonstrating the bactericidal activity exercised by the disinfectant to
face the control microorganisms. The established experimental conditions and methodology
demonstrated not to affect negatively the growth of each one of microorganisms. Similarly,
the used neutralizant did not disable the development of the microorganisms of the essay.
The method was checked by means of the fulfillment of the basic limits established by the
norm. The obtained results suggest that the method evaluated by means of implementation
of the protocol established in the Colombian Technical Norm 5473/07, allows evaluating the
efficiency of a disinfectant under selected and controlled experimental conditions.

3 
 
1. INTRODUCCIÓN
El control microbiano en el área de la salud, constituye actualmente, uno de los pilares para
la implementación de procesos que garanticen la seguridad a pacientes y personal que
labora en el área. Por ello, la limpieza y la desinfección son el mecanismo principal al cual se
debe acudir si se quiere mantener un ambiente libre de microorganismos que pueden llegar
a alterar la salud de pacientes y personal médico.
El proceso de desinfección juega un papel importante en la disminución de la carga
microbiana presente tanto en el instrumental, como en las instalaciones de los centros
médicos.
Los mecanismos de desinfección empleados, deben asegurar la reducción de la carga
microbiana presente en equipos o ambientes hasta niveles aceptables. Si bien la
desinfección no garantiza una total destrucción de los microorganismos, permite ejercer un
control sobre las poblaciones microbianas presentes, impidiendo que estas puedan poner en
peligro un proceso productivo.
En el campo de la salud, así como en la industria alimenticia, cosmética y farmacéutica, la
desinfección permite elaborar productos inocuos, destinados al beneficio del ser humano.
Por esta razón, es necesario asegurar la ausencia de microorganismos viables tanto en el
sector salud como en cualquiera de las industrias anteriormente mencionadas. Este es por
ende el objetivo de todo proceso de desinfección.
Para la implementación de un plan de desinfección, es necesario realizar una valoración
preliminar acerca del tipo de desinfectante a emplear, de acuerdo con la naturaleza del
objeto que se desea poner en contacto con la sustancia desinfectante. De igual forma, es
necesario determinar el comportamiento del desinfectante ante diversas situaciones
ambientales que pueden alterar su efectividad en determinado proceso. Dentro de estas
condiciones, se puede evaluar el efecto de la temperatura, el tiempo de contacto entre el
desinfectante y la flora microbiana presente, así como la presencia de sustancias
interferentes.
Las determinaciones anteriormente nombradas, permiten conocer el espectro de acción del
desinfectante frente a cualquier tipo de carga microbiana, lo cual se puede lograr conociendo
la concentración bactericida del desinfectante empleado.

4 
 
Considerando la importancia de determinar la concentración bactericida de un desinfectante,
este trabajo tiene como finalidad evaluar experimentalmente el protocolo descrito por la
Norma Técnica Colombiana 5473. De esta manera, este proyecto está orientado a
establecer, implementar y verificar los procedimientos documentados en esta norma, para
servir como base a nuevos estudios realizados por entidades, que quieran evaluar la
capacidad bactericida de cualquier desinfectante que deseen emplear en sus procedimientos
de rutina.
Igualmente, este trabajo pretende suministrar información necesaria y contundente, que
sirva como base para asegurar, que cualquier empresa que desee implementar los métodos
evaluados en este proyecto, sea capaz de determinar cuál tipo de desinfectante utilizar para
controlar la contaminación presente en un proceso y asegurar la obtención de productos
seguros que beneficien a la comunidad.
Así mismo, se espera que este trabajo demuestre la efectividad de los métodos reportados
por la Norma Técnica Colombiana 5473, y permita asegurar la aplicación de estos
procedimientos de evaluación en cualquier tipo de desinfectante utilizado en el sector salud,
objetivo de los ensayos reportados por la norma.
Finalmente, el deseo de esta investigación es demostrar la importancia del proceso de
desinfección en el ámbito médico, y la efectividad de los métodos empleados para la
determinación de la concentración bactericida de cualquier desinfectante químico.

5 
 
2. MARCO TEÓRICO
2.1.EL PROCESO DE DESINFECCION.
La Desinfección pretende eliminar o reducir el nivel de microorganismo vegetativos y otros
organismos indeseables de equipos medico y superficies. El propósito es minimizar la
infección o la colonización bacteriana y convertir los instrumentos en materiales seguros
para su uso en pacientes. Esto puede se logrado gracias a la combinación de la limpieza,
desinfección y la esterilización. Los requerimientos para una desinfección exitosa incluyen:
• El monitoreo de los sistemas de control,
• Equipos aptos para este propósito: Calibrados, monitoreados y validados.
• Personal apropiadamente supervisado y entrenado. (Hoh, 2005).
El método usado para la desinfección debe también tener en cuenta:
• La contaminación presente,
• La tolerancia de los objetos al calor, la presión, la humedad y los químicos,
• La disponibilidad del equipo del procesamientos,
• Riesgos asociados con el método escogido. (Hoh, 2005).
La desinfección efectiva requiere control y monitoreo de todas la etapas del proceso. Los
procesos de limpieza, desinfección y esterilización tienen como propósito remover o destruir
microorganismos. La selección del método de limpieza y desinfección depende del riesgo de
infección asociado con el uso del objeto a desinfectar. Esto también depende de la
disponibilidad de método, del tiempo necesario para el proceso y de la naturaleza del objeto,
por ejemplo su tolerancia al calor, a la humedad y a los agente químicos. El costo y la
seguridad también deben ser considerados. (Steer, 2002).
Los desinfectantes son agentes que matan microorganismos pero no necesariamente sus
esporas y no deben aplicarse sobre tejidos sino sobre objetos inanimados como mesas,
pisos, utensilios; son ejemplo de estos el cloro, hipoclorito, compuestos clorados, soda,
sulfato de cobre, compuestos de amonio cuaternario (Jaime, 2002).

6 
 
Los antisépticos son agentes microbicidas que pueden aplicarse sobre la piel y mucosas
pero no pueden ser utilizados internamente, son ejemplos de ellos: los agentes mercuriales,
nitrato de plata, solución de yodo, alcoholes, detergentes (Jaime, 2002)
2.2 CARACTERÍSTICAS DE UN DESINFECTANTE IDEAL.
- Actividad antimicrobiana. Debe ser capaz de matar a los microorganismos. A baja
concentración debe tener un amplio espectro de actividad antimicrobiana inactiva
bacterias (Gram positivas, Gram negativas, micobacterias), virus, hongos,
esporas,…
- Solubilidad. Debe ser soluble en agua u otros solventes, en la proporción necesaria,
para su uso efectivo.
- Estabilidad. Durante el almacenamiento los cambios en sus propiedades deben ser
mínimos y no deben causar una pérdida significativa de su acción germicida.
- No debe ser tóxico para el hombre ni los animales.
- Homogeneidad. La preparación debe ser uniforme en composición, de manera que
los ingredientes activos estén presentes en cada aplicación.
- No se debe combinar con materiales orgánicos extraños.
- Debe ser tóxico para los microorganismos a la temperatura ambiente, para que al
usar el agente no sea necesario elevar la temperatura más allá de la que se
encuentra normalmente en el lugar donde se va a utilizar.
- Capacidad para penetrar. Esto no es necesario si se requiere sólo una acción
superficial.
- No debe ser corrosivo, ni teñir el material que se trate.
- Capacidad desodorante. Desodorizar mientras desinfecta es una propiedad
deseable. Idealmente el desinfectante debe ser inodoro o tener un olor agradable.
- Capacidad detergente. Un desinfectante que sea a la vez detergente cumple 2
objetivos: limpieza y desinfección: la acción limpiadora mejora la efectividad del
desinfectante (www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/tema14.pdf -)
- Tensión superficial baja
- Con efecto residual
- Económico (buena relación coste/eficacia)
- No dañino para el medio ambiente
- No inducir ni desarrollar resistencia
(www.academia.cat/societats/famcl/libre/higiene/332.pdf)

7 
 
No existe en el mercado un desinfectante que cumpla todas estas características. Se escoge
uno u otro en función del tipo de microorganismos que queremos eliminar, del material sobre
el que se apliquen, la temperatura y el pH de trabajo, el tiempo de actuación, la presencia de
materia orgánica sobre el material a desinfectar.
(www.academia.cat/societats/farmcl/llibre/higiene/332.pdf)
2.3 MODO DE ACCIÓN DE LOS DESINFECTANTES
Los desinfectantes químicos actúan sobre las células microbianas de diferentes maneras, de
acuerdo con el grupo químico al cual pertenecen y a las características fisicoquímicas de
cada uno de ellos. Los principales mecanismos de acción son los siguientes:
• Daño de la pared celular.
• Alteración de la permeabilidad de la membrana y la pared celular.
• Alteración de las moléculas de proteínas y ácidos nucleicos.
• Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos.
• Inhibición enzimática (www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/tema14.pdf -)
2.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACCIÓN QUÍMICA DE LOS DESINFECTANTES
2.4.1. Limpieza adecuada: Se debe remover la suciedad antes en cada artículo para lograr
una desinfección de manera eficaz. (Ninemeier, 2000).
2.4.2. Carga orgánica: La actividad desinfectante puede reducirse debido a la restricción
que representan las fuertes cargas orgánicas en los ingredientes activos del desinfectante.
Lo recomendable es que un desinfectante haya sido probado con una carga orgánica del
5%. (Ninemeier, 2000).
2.4.3. Tipo y porcentaje de microorganismo: Algunos microorganismos son mas
resistentes a desinfectantes líquidos que otros como por ejemplo el bacilo de la tuberculosis.
(Ninemeier, 2000).
2.6.4. Tiempo y temperatura: El tiempo indicado para destruir a los microorganismos debe
especificarse en la etiqueta de los desinfectantes. Este es el tiempo durante el cual el
desinfectante debe permanecer en contacto con el microorganismo para eliminarlo.
(Ninemeier, 2000).
2.4.5. pH: Los desinfectantes se formulan dentro de un amplio rango de valores de pH para
que sean mas efectivos. Algunos desinfectantes actúan mejor con un pH alcalino mayor que
7 mientras que otros lo hacen en condiciones acidas menor que 7. (Ninemeier, 2000).

8 
 
2.4.6. Nivel de dureza del agua: los minerales como calcio y magnesio también pueden
afectar la eficacia de un desinfectante interfiriendo con los ingredientes activos de la misma.
(Ninemeier, 2000).
Son muchos los desinfectantes químicos que se utilizan para controlar los agentes
infecciosos. Existen en el mercado una gran variedad de marcas y fabricantes, pero en
general los desinfectantes químicos pertenecen a alguna de las siguientes categorías:
• Ácidos o álcalis
• Clorados
• Glutaraldehído
• Mercuriales
• Cuaternarios
• Alcoholes
• Formaldehído
• Yodados
• Fenoles .(www.academia.cat/societats/farmcl/llibre/higiene/332.pdf)
Cuando se deba efectuar una desinfección utilizando desinfectantes químicos, deberá
tenerse en cuenta que la resistencia relativa de los agentes a los desinfectantes depende de
diversos factores entre los cuales se citan los siguientes:
• El tiempo de contacto.
• La concentración.
• La presencia de material orgánico y suciedad.
• La temperatura.
• La humedad.
• El tipo y número de microorganismos.
• La condición y naturaleza de las superficies a descontaminar.
• Los errores humanos.
Dependiendo de cómo se manipulen los factores mencionados, el éxito logrado con los
desinfectantes químicos variará desde una inactivación mínima del microorganismo a tratar,
hasta una condición de esterilidad.
(www.academia.cat/societats/farmcl/llibre/higiene/332.pdf).
2.5 IMPORTANCIA DE LA EVALUACIÓN DE DESINFECTANTES.

9 
 
La política de adquisición y uso apropiado de desinfectantes es un elemento importante en la
lucha contra las infecciones hospitalarias ya que, a causa del aumento de procedimientos de
diagnóstico y terapéuticos, aumentan también las oportunidades de introducir gérmenes en
cavidades corporales de las que habitualmente están ausentes. Existen métodos físicos y
físico - químicos capaces de lograr una esterilización completa pero no siempre pueden ser
utilizados en los dispositivos electrónicos u ópticos actuales, de alto costo y con gran presión
de uso. Por lo tanto, la desinfección química (los desinfectantes) tiene un importante papel
en el tratamiento del medio ambiente sanitario (Tabares, 2002).
2.6. EVALUACIONES DE NEUTRALIZACIÓN COMO EXPERIMENTOS DE CONTROL
PARA LOS TEST DE EFICACIA ANTIMICROBIANA.
Un test biocida mide la eficacia de un agente antimicrobial a partir del crecimiento aparente
en el numero de microorganismos viable. El objetivo principal de un ensayo de eficacia
antimicrobial es la determinación exacta de las células sobrevivientes en relación con el
tiempo. Este requiere una neutralización efectiva del agente biocida en tiempos de muestreo
específicos. Un test biocida cuidadosamente diseñado mide la eliminación de
microorganismos a partir del numero de organismos capaces de crecer después de la
exposición al agente antimicrobial. Para esto es necesario demostrar la adecuada
neutralización del agente biocida para establecer la compatibilidad de los datos obtenidos
(Ascenzi, 1996).
2.6.1 Métodos De Evaluación De Desinfectantes:
Tres métodos han sido recientemente publicados detallando protocolos de evaluación de los
neutralizantes:
2.6.2 Neutralización por inhibición química: Muchos biocidas pueden ser químicamente
inactivados. Varios neutralizantes y medios de cultivo de dilución han sido formulados para
este fin. Dentro de los más conocidos se encuentra el caldo Letheen y Thioglicolato para
inactivar el desinfectante. La eficacia de los neutralizante fue originalmente demostrada con
Staphylococcus aureus y posteriormente con una variedad de microorganismos. El caldo
Letheen es efectivo en la recuperación de bacterias expuestas a compuestos de amonio
cuaternario y biguanidas. El medio Thioglicolato es efectivo contra agentes mercuriales. Sin
embargo la inactivación química de biocidas puede ser por si misma para algunas de las
bacterias de interés. A pesar de la toxicidad de los neutralizantes, su uso puede ser
conveniente debido a que los neutralizantes son de acción rápida (Ascenzi, 1996).

10 
 
2.6.3. Neutralización por dilución: La concentración de un desinfectante ejerce un amplio
efecto en su potencia. La relación entre la concentración y el efecto antimicrobial difiere
entre los agentes biocidas pero es relativamente constante para un biocida particular. Esta
relación es exponencial en la naturaleza (Ascenzi, 1996)
2.6.4 Neutralización por filtración: La dilución de un biocida por filtración es otro medio
para neutralizar una solución desinfectante. Este procedimiento se basa en la filtración para
separar los microorganismos en suspensión de la solución desinfectante. La membrana es
luego removida, y ubicada en la superficie de un agar para luego ser incubada. Los
nutrientes pasan a través de la membrana, y se puede posteriormente apreciar el
crecimiento de colonias en la superficie de la membrana permitiendo la cuantificación de los
microorganismos sobrevivientes. (Ascenzi, 1996).
La inhibición del crecimiento puede ocurrir debido a la adherencia del persevante residual a
la membrana. La filtración a través de materiales como el difloruro de polivinilo ayuda a
disminuir esta adherencia. Adicionalmente, el preservante puede ser diluido o desprendido
del filtro mediante enjuague con fluidos como peptona al 0.1%. La filtración por si sola no
puede ser asumida como efectiva para la neutralización. La recuperación eficaz de
microorganismos sobrevivientes por este procedimiento requiere una demostración de la
eficacia de la neutralización mediante uno o varios ensayos. (Ascenzi, 1996).
2.7. FACTORES QUE AFECTAN LA NEUTRALIZACIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS
Existen cuatro criterios que deben ser tenidos en cuenta en el diseño de un estudio de
neutralización:
1. El neutralizante debe inhibir efectivamente la acción de la solución biocida.
2. El neutralizante no debe ser por si mismo toxico para los microorganismos de ensayo.
3. El neutralizante y el agente activo no se deben combinar para formar un compuesto
toxico.
4. Estos criterios deben ser demostrados bajo condiciones similares a las condiciones
normales para el empleo del desinfectante. (Ascenzi, 1996).
Estos criterios pueden ser considerados por los siguientes factores:
2.7.1. Eficacia del Neutralizante: La eficacia del neutralizante usado en los experimentos
de evaluación de bactericidas puede variar tanto con el organismo de estudio como con el
biocida. Además, la sensibilidad del organismo al biocida y la concentración del mismo
pueden tener un efecto importante en la eficacia del tratamiento de neutralización. Es

11 
 
importante comparar la recuperación de los microorganismos del neutralizador en presencia
y ausencia del biocida. Este agente biocida. (Ascenzi, 1996).
2.7.2. Toxicidad del Neutralizante: Diversos inhibidores químicos de antimicrobianos son
tóxicos por sí mismos. Este factor puede ser estimado como una comparación en la
recuperación entre dos poblaciones una expuesta al bactericida y otra respuesta a buffer
fosfato. Los resultados finales deben mostrar microorganismos sobrevivientes en cantidades
similares. (Ascenzi, 1996).
2.7.3. Diseños Para Evaluación De Neutralizantes
2.7.3.1. Recuperación en medio sólido: Los ensayos de suspensión para evaluar la
eficacia antimicrobial usualmente cuantifican microorganismos sobrevivientes en medio
sólido. Los organismos de ensayo son físicamente suspendidos en la solución de ensayo, y
se toman alícuotas en intervalos de tiempo para determinar el número de microorganismos
sobrevivientes sobre placas de agar. El procedimiento general para estos ensayos involucra
la preparación de una suspensión del organismo de ensayo, usualmente a una
concentración de 10
6
UFC/ml. Las muestras son luego diluidas en un neutralizante y en un
caldo de dilución. Estos pasos incluyen la neutralización del biocida, la dilución de los
microorganismos sobrevivientes a niveles contables y la siembra en placas de agar para su
recuperación. (Ascenzi, 1996).
2.7.3.2. Recuperación en medio líquido: Involucra la inoculación de un portador y el
ensayo del portador para detectar microorganismos viables después de la desinfección en
medio liquido. La inferencia hecha en estos ensayos es que el medio de recuperación
permite el crecimiento de todos los microorganismos sobrevivientes al finalizar el periodo de
desinfección. La determinación final de la eficacia es basada en la ausencia de crecimiento
en el medio de cultivo líquido. Además este caldo debe servir tanto para neutralizar el
desinfectante como para soportar el crecimiento de todos los microorganismos. (Ascenzi,
1996)
2.7.3.3. Recuperación por Filtración por Membrana: En este sistema se debe tener en
cuenta el tipo de membrana empleado, el equipo de filtración, el medio, el diluyente de
neutralización y la solución a ser evaluada. La filtración puede reducir la recuperación de
los microorganismos debido a la muerte o adherencia de las células a las paredes de los
embudos de filtración. Esta pérdida específica de la técnica puede estimarse comparando la
población recuperada en el fluido diluyente con el conteo de células viables. La filtración por
membrana permite incorporar un neutralizante especifico en el diluyente para superar el
efecto del agente antimicrobial. (Ascenzi, 1996).

12 
 
2.8. NORMATIVA MUNDIAL SOBRE EVALUACION DE DESINFECTANTES
Hasta 1997 no existían normas europeas de evaluación de desinfectantes. Los diversos
productos desinfectantes se evaluaban según normas oficiales en algunos países, siendo las
más habituales las normas francesas AFNOR (Association Française de Normalisation), las
alemanas DGHM (Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie) y las
estadounidenses EPA y AOAC (Association of Official Analytical Chemists) (Tabares, 2002).
2.8.1. Normas AFNOR (Association Française de NORmalisation)
Las normas AFNOR NFT 72 existen desde hace más de 25 años
NF T72-170 (noviembre 1988). Antisépticos y desinfectantes utilizados en el estado líquido,
miscibles al agua y neutralizables - Determinación de la actividad bactericida en presencia
de sustancias interferentes de referencia - Método por dilución - neutralización.
NF T72-171 (noviembre 1988). Antisépticos y desinfectantes utilizados en el estado líquido,
miscibles al agua - Determinación de la actividad bactericida en presencia de sustancias
interferentes de referencia - Método por filtración sobre membranas.
NF T72-190 (1988). Desinfectantes de contacto utilizados en el estado líquido, miscibles al
agua - Determinación de la actividad bactericida y fungicida y esporicida.
NF T72-230 (1988). Antisépticos y desinfectantes utilizados en el estado líquido, miscibles al
agua y neutralizables - Determinación de la actividad esporicida - Método por dilución-
neutralización.
NF T72-231 (1988). Antisépticos y desinfectantes utilizados en el estado líquido, miscibles al
agua - Determinación de la actividad esporicida - Método por filtración sobre membranas.
NF T72-281 (septiembre 1986). Procedimientos de desinfección de las superficies por vía
aérea - Determinación de la actividad bactericida y fungicida y esporicida
T72-300 (noviembre 1989). Antisépticos y desinfectantes utilizados en el estado líquido,
miscibles al agua - Prueba(Ensayo) de suspensión por dilución-neutralización -
Determinación de la eficacia de los productos sobre microorganismos diversos en las
condiciones prácticas de empleo.
T72-301 (noviembre 1989). Antisépticos y desinfectantes utilizados en el estado líquido,
miscibles al agua - Prueba(Ensayo) de suspensión por filtración sobre membranas -
Determinación de la eficacia de los productos sobre microorganismos diversos en las
condiciones prácticas de empleo
2.8.2. Normativa Europea
Los proyectos europeos definidos por el Comité CEN/TC 216 se elaboran en tres fases:

13 
 
• Fase 1: normas básicas de suspensión en agua destilada. Estas normas demuestran la
existencia de alguna actividad en condiciones favorables. Sirven para calificar el producto de
bactericida, fungicida ó esporicida.
• Fase 2: normas de aplicación. En cada uso, las normas reproducen condiciones similares a
los usos esperados del producto, en los campos agro-alimentario, industrial, médico y
veterinario.
Fase 2 – etapa 1: ensayos de suspensión con sustancias interferentes.
Fase 2 – etapa 2: ensayos sobre superficies, como los portagérmenes de acero
(desinfectantes) o las manos (antisépticos).
• Fase 3: ensayos en el sitio. Por el momento, no existe ninguna norma de fase 3
(ICONTEC, 2006. NTC 5446)
UNE-EN 1040:2006. Antisépticos y desinfectantes químicos. Ensayo cuantitativo de
suspensión para la evaluación de la actividad bactericida básica de los antisépticos y
desinfectantes químicos. Método de ensayo y requisitos (fase 1)
suspensión para la evaluación de la actividad fungicida o levuricida básica de los
antisépticos y desinfectantes químicos. Método de ensayo y requisitos (fase 1).
suspensión para la evaluación de la actividad bactericida de los antisépticos y desinfectantes
químicos utilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividad.
Método de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1).
UNE-EN 13610:2003. Desinfectantes químicos. Ensayo cuantitativo de suspensión para la
evaluación de la actividad viricida frente a bacteriófagos de los desinfectantes químicos
utilizados en el ámbito agroalimentario y en la industria. Método de ensayo y requisitos (fase
2, etapa 1).
suspensión para la evaluación de la actividad fungicida de los desinfectantes químicos para
instrumental utilizado en medicina. Método de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1).
superficie no porosa para la evaluación de la actividad bactericida y/o fungicida de los
desinfectantes químicos utilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en
colectividad. Método de ensayo sin acción mecánica y requisitos (fase 2/etapa 2).
UNE-EN 13697:2002 ERRATUM:2007. Antisépticos y desinfectantes químicos. Ensayo
cuantitativo de superficie no porosa para la evaluación de la actividad bactericida y/o

14 
 
fungicida de los desinfectantes químicos utilizados en productos alimenticios, en la industria,
en el hogar y en colectividad. Método de ensayo sin acción mecánica y requisitos (fase
2/etapa 2).
UNE-EN 13704:2002. Desinfectantes químicos. Ensayo cuantitativo de suspensión para la
evaluación de la actividad esporicida de los desinfectantes químicos utilizados en productos
alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividades. Método de ensayo y requisitos
(fase 2, etapa 1).
suspensión para la evaluación de la actividad bactericida de los desinfectantes químicos
para instrumental utilizado en medicina. Método de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1).
suspensión para la evaluación de la actividad micobactericida de los antisépticos y
desinfectantes químicos utilizados en veterinaria. Método de ensayo y requisitos (fase 2,
etapa 1). (www.aenor.es/desarrollo/normalizacion/normas/buscadornormas.asp?pag=p -
122k -)
2.8.3. Normativa estadounidense.
ASTM: Sociedad American Section of the International Association for Testing
Materials (organismo de normalización de los Estados Unidos de América)
ASTM E-2197-02. Standard Quantitative Disk carrier test method for determining the
bactericidal, virucidal, fungicidal, mycobactericidal and sporicidal activities of liquid chemical
germicides. ASTM International. Pa. USA. (Prueba de disco portador para actividades
bactericida, virucida, fungicida, micobactericida y esporicida de germicidas químicos
líquidos).
ASTM E-2197-02. Standard Quantitative Disk carrier test method for determining the
bactericidal, virucidal, fungicidal, mycobactericidal and sporicidal activities of liquid chemical
germicides. ASTM International. Pa. USA. (Prueba de disco portador para actividades
bactericida, virucida, fungicida, micobactericida y esporicida de germicidas químicos
líquidos).( www.ivami.com/ - 10k)
2.8.4. Normativa Colombiana.
NTC 4672 (primer actualización de 287/04 desinfectantes para uso hospitalario. Requisitos
microbiológicos.

15 
 
NTC 5408 2006-02-22. Método cuantitativo en suspensión para determinar la actividad
tuberculicida de un desinfectante de alto nivel soluble en agua para uso hospitalario.
NTC 5473 2007-03-21 desinfectantes químicos. Ensayo cuantitativo de suspensión para la
evaluación de la actividad bactericida de los desinfectantes químicos para instrumental
utilizado en el sector salud. Método de ensayo y requisitos (fase 2 etapa 1)

16 
 
3. JUSTIFICACIÓN.
La limpieza y la desinfección son aspectos primordiales que deben ser tenidos en cuenta a
la hora de evaluar si un proceso es o no satisfactorio. La presencia de microorganismos
contaminantes o ajenos al proceso es en muchos casos inevitable, pero depende de un
correcto y adecuado proceso de desinfección.
Es importante no solo escoger el desinfectante adecuado, sino determinar que la
concentración a la cual se emplea es la más eficaz y la más rentable para quien lo utiliza.
Por ello, la importancia de este proyecto de investigación consiste en demostrar
experimentalmente, la eficacia del método dilución neutralización.
Es por esto que este proyecto surge en respuesta a la necesidad de encontrar mecanismos
estandarizados que aseguren la correcta determinación de la concentración bactericida de
un desinfectante, útil al momento de emplear una sustancia química que disminuya la carga
microbiana del instrumental empleado en el sector salud.
La importancia de esta investigación radica en la posibilidad de economizar tiempo, producto
desinfectante y dinero, a la vez de obtener seguridad en el proceso de desinfección, a través
de una metodología estandarizada y normatizada por el Instituto de Normas Técnicas y
Certificación ICONTEC.
La precisión de esta metodología determinada por medio de la repetibilidad de los ensayos
evaluados en esta investigación, permite demostrar la veracidad del procedimiento
empleado y la seguridad de obtener en posteriores ensayos, resultados similares,
verificables y con seguridad, contundentes.
Finalmente, la relevancia de esta investigación radica en que constituye una manera útil de
verificar la utilidad de la técnica dilución neutralización para la evaluación de desinfectantes
en cualquier ámbito, con el fin de establecerla en caso de encontrarse un procedimiento de
desinfección inadecuado.

17 
 
4. OBJETIVOS.
4.1.OBJETIVO GENERAL.
Evaluar el método dilución neutralización aplicado a un desinfectante en gel a base de
alcohol, según la Norma Técnica Colombiana 5473 de 2007.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Establecer las condiciones experimentales para la implementación del método de
ensayo dilución-neutralización.
• Implementar el método de ensayo dilución-neutralización, utilizando un desinfectante
en gel a base de alcohol, según la norma técnica colombiana 5473 del 2007.
• Verificar la efectividad del método de ensayo dilución-neutralización, para la
evaluación de un desinfectante en gel a base de alcohol.
• Reportar los resultados obtenidos por medio de la elaboración de un informe del
ensayo y un artículo científico, estableciendo un protocolo de esta metodología para
ser aplicado en VICAR FARMACÉUTICA S.A.

18 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS.
5.1 Diseño de la investigación (experimental o de investigación): El diseño de la
investigación es de tipo experimental ya que se busca estandarizar, implementar y verificar
el protocolo de dilución neutralización de la NTC 5473. Para ello se evaluaron variables
como tiempo de contacto, temperatura de exposición, concentración de desinfectante,
sustancias interferentes y cepas microbianas
5.1.1 Población de estudio y muestra:
El objeto de estudio fue un desinfectante a base de alcohol 70%, empleado en el sector
salud para la higiene de las manos. El producto fue sometido a las diferentes condiciones
experimentales, a su concentración de uso.
5.1.2 Variables del estudio:
Las variables del estudio fueron el desinfectante a evaluar, las cepas de referencia
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Enterococcus hirae; el tiempo de
contacto entre el desinfectante y cada uno de los microorganismos empleados, la
temperatura y las sustancias interferentes.
5.2 Métodos:
5.2.1. Materiales:
Tubos de ensayo.
Frascos Schott de 500ml y 1000ml.
Pipetas graduadas de 10 ml.
Micropipeta de 100 a 1000µl.
Cajas de petri de tamaño 90 mm a 100 mm.
Asas desechables estériles.
5.2.2. Medios de cultivo:
TSA agar tripticasa soya
5.2.3. Reactivos:
Solución de cloruro de sodio triptona.

19 
 
Solución de cloruro de sodio.
Neutralizante: caldo Letheen
Agua destilada estéril.
Solución de albúmina de suero bovino
Solución de albúmina de suero bovino y eritrocitos de oveja.
5.2.4. Equipos:
Autoclave.
Baño de agua.
Incubadora.
Cronómetro.
Estufa.
Horno de secado.
Vortex.
Centrífuga.
Cámara de flujo laminar.
5.3. Metodología:
5.3.1. Establecimiento de las condiciones experimentales para el método de ensayo
dilución-neutralización.
Para la ejecución de la metodología, se tuvieron en cuenta las condiciones estipuladas por la
norma. En cuanto a la temperatura, se consideró la temperatura obligatoria de 20º+/-1ºC y
como temperatura adicional se empleó 36º +/- 1ºC. Para determinar el tiempo de contacto
entre el desinfectante y los microorganismos de prueba, se llevó a cabo un ensayo
preliminar utilizando el tiempo obligatorio de 60 minutos y cinco tiempos adicionales (0, 5,
10, 15 y 30 minutos). A partir de este ensayo se establecieron las condiciones particulares
de este ensayo. Tabla 1.
Las sustancias interferentes manejadas en el ensayo fueron solución de albúmina de suero
bovino 0.3g/L en condiciones limpias y una mezcla de eritrocitos de oveja 3ml/L con solución
de albúmina de suero bovino 3g/L para simular condiciones sucias. Para la preparación de la
solución de albúmina de suero bovino se tomaron 48 microlitros de albúmina para preparar
160ml de solución. Para la solución que contenía eritrocitos (Condiciones sucias), se

20 
 
tomaron 8ml de sangre de oveja desfibrinada estéril y se centrifugaron cuatro veces durante
10 minutos. Luego de desechar el sobrenadante se suspendió el precipitado en 8ml de
diluyente para centrifugar de nuevo, hasta que el sobrenadante era amarillo claro o incoloro.
Finalmente se tomaron 480 microlitros de eritrocitos en 160 ml de diluyente y 480 microlitros
de albúmina de suero bovino.
Los organismos de ensayo utilizados fueron los estipulados por la norma: Pseudomonas
aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus hirae ATCC
10541.

21 
 
5.3.2. Implementación del método de ensayo dilución-neutralización según la norma
técnica colombiana 5473 del 2007.
5.3.2.1. Preparación de las suspensiones de los microorganismos de ensayo.
Se prepararon dos suspensiones diferentes de cada microorganismo de ensayo: la
suspensión de ensayo para efectuar el ensayo y la suspensión de validación para efectuar la
validación de los controles y el método. Para preparar el cultivo de trabajo de los organismos
de ensayo se realizo un cultivo de primera generación mediante siembra sobre medio TSA,
incubando 24h a 37 °C. a partir de este cultivo se preparo un segundo subcultivo de la
misma forma incubando durante un tiempo de 24h. a partir de este segundo subcultivo de
preparo un tercer pase mediante el cual se realizo la suspensión de ensayo. Para esto se
transfirieron asas de células al diluyente, ajustando el numero de células a un valor
comprendido entre 1.5 x 10
8
ufc/ml y 5.0 x 10
8
ufc/ml, mediante medición de absorbancia
utilizando un espectrofotómetro. Para el recuento se prepararon diluciones 10
-6
y 10
-7
y se
tomo una muestra de 1 ml de cada dilución por duplicado, inoculando utilizando la técnica de
vertido en placa en medio TSA. Las cajas se incubaron durante 24h a 37°C.
5.3.2.2. Preparación de las suspensiones del organismo de validación.
Se diluyo la suspensión de ensayo una cuarta parte de la dilución 10
-5
para obtener una
concentración comprendida entre 3 x 10
2
ufc/ml y 1.6 x 10
3
ufc/ml. Para el recuento se
preparo una dilución 10
-1
y se tomo una muestra de 1 ml por duplicado utilizando la técnica
de vertido en cajas en agar TSA. Las cajas se incubaron durante 24 h a 37°C.
5.3.2.3. Determinación de la actividad bactericida.
Se pipeteó 1,0 ml de la sustancia interferente en un tubo. Se añadió 1,0 ml de la suspensión
de ensayo. Se activó inmediatamente un cronómetro, se mezcló y se colocó el tubo en un
baño de agua controlado a cada una de las temperaturas del ensayo. Transcurrido el tiempo,
se añadió 8,0 ml del producto a evaluar. Se activó de nuevo el cronómetro al comienzo de la
adición, se mezcló y se colocó el tubo en un baño de agua controlado a cada una de las
temperaturas seleccionadas para cada uno de los tiempos de contacto seleccionados. Antes
del final de cada uno de los tiempos, se mezcló de nuevo.
Al terminar cada uno de los tiempos seleccionados, se tomó una muestra de 1,0 ml de la
mezcla del ensayo Na y se transfirió a un tubo con 8,0 ml del neutralizante y 1,0 ml de agua.
Se mezcló y se colocó en un baño de agua controlado a 20°C. Después de un tiempo de

22 
 
neutralización de 5 min, se tomó inmediatamente una muestra de 1,0 ml de la mezcla del
ensayo neutralizada Na por duplicado y se inoculó utilizando la técnica de vertido en placa,
se incubó y se realizó recuento.
5.3.2.4. Verificación de la ausencia de cualquier efecto letal en las condiciones del ensayo
(parámetro A de la condición experimental): Se pipeteó 1,0 ml de la sustancia interferente
utilizada en un tubo. Se añadió 1,0 ml de la suspensión de validación, se activó
inmediatamente el cronometro, se mezcló y se colocó el tubo en el baño de agua controlado
a cada una de las temperaturas del ensayo durante 2 min. Transcurrido este tiempo, se
añadió 8,0 ml de agua dura. Se activó de nuevo el cronómetro al comienzo de la adición, se
mezcló y se colocó el tubo en el baño de agua controlado a cada una de las temperaturas
del ensayo y durante cada uno de los tiempos seleccionados. Antes del final del tiempo, se
mezcló de nuevo; transcurrido el tiempo seleccionado, se tomó una muestra de 1,0 ml de la
mezcla de ensayo A por duplicado e se inoculó utilizando la técnica de vertido en cajas; se
incubó y se realizó recuento.
5.3.2.5. Verificación de la ausencia de toxicidad del neutralizante (parámetro B de control del
neutralizante): Se pipetearon 8,0 ml del neutralizante y 1,0 ml de agua en un tubo. Se añadió
1,0 ml de la suspensión de validación. Se activó el cronómetro al comienzo de la adición, se
mezcló y se colocó el tubo en un baño de agua controlado a 20°C durante 5 min. Antes de
concluir este tiempo, se mezcló transcurrido este tiempo, se tomó una muestra de 1,0 ml de
esta mezcla B por duplicado y se inoculó utilizando la técnica de vertido en cajas; se incubó
y se contaron las colonias.
5.3.2.6. Parámetro de estandarización del método: Se pipeteó 1,0 ml de la sustancia
interferente en un tubo. Se añadió 1,0 ml de diluyente y se activó el cronómetro, se
añadieron 8,0 ml del producto. Se mezcló y se colocó el tubo en un baño de agua controlado
a cada una de las temperaturas del ensayo durante cada uno de los tiempos del ensayo;
antes de concluir este tiempo, se mezcló de nuevo; transcurrido cada uno de los tiempos del
ensayo, se transfirió 1,0 ml de la mezcla a un tubo con 8,0 ml de neutralizante. Se activó de
nuevo el cronómetro al comienzo de la adición. Se mezcló y se colocó el tubo en un baño de
agua controlado a 20°C durante 5 min.
Se añadió 1,0 ml de la suspensión de validación. Se activó un cronómetro al comienzo de la
adición y se mezcló. Se colocó el tubo en un baño de agua controlado durante 30 min. Antes

23 
 
de concluir el tiempo, se mezcló de nuevo; transcurrido este tiempo, se tomó una muestra de
1,0 ml de la mezcla C por duplicado y se inoculó utilizando la técnica de vertido en cajas; se
incubó y se contaron las colonias.
5.3.2.7. Incubación y recuento de la mezcla de ensayo y de las mezclas de control y
estandarización: Se incubaron las cajas durante 24 h. Se realizó el recuento de las cajas y
se determinó el número de unidades formadoras de colonias (ufc) en cada caja. Se anotó
para cada placa el número exacto de colonias, se registró mayor a 330 para cualquier
recuento mayor a 330 respectivamente, y se determinaron los valores Vc. Se calculó la
cantidad de ufc/ml en la mezcla de ensayo Na y en las mezclas de verificación A, B y C.
Figura 2. PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES DEL ORGANISMO DEL ENSAYO
Cultivo de primera
generación
Subcultivar en medio
TSA
 
Incubar entre 18h – 24h
Crecimiento masivo
y puro del
microorganismo de
ensayo 
NO

24 
 
TSA
(segundo subcultivo) 
SI
Crecimiento masivo
y puro del
microorganismo de
ensayo 
SI
NO
TSA
(tercer subcultivo) 
Cultivo de
trabajo

25 
 
Crecimiento masivo
y puro del
microorganismo de
ensayo 
SI
NO
Agitar en vortex
Frasco schott de 500ml
con 300 ml de solución
salina
Transferir asadas
Cultivo de
trabajo

26 
 
Transferir 10 ml de esta
muestra a un tubo
Leer absorbancia en el
espectrofotómetro
Lectura de abs.: 0.198
correspondiente al valor
teórico del patrón 1 de
Mac Farland 
SI
NO
Lectura mayor
a 0.198
Lectura menor
a 0.198
Adicionar
solución salina
Preparar diluciones 10
-6
y
10
-7
con solución salina
Sembrar cada una de las
diluciones por duplicado en
medio TSA
Incubar entre 24h a 37°C.

27 
 
Recuento entre 1.5
x 10
8
ufc/ml y 5.0 x
10
8
ufc/ml
Suspensión
de ensayo
SI
Diluir esta suspensión con
solución salina, aprox. Una
cuarta parte la dilución 10
-5
Preparar dilución 10
-1
y sembrar
en medio TSA
Incubar 24h a 37°C.
Recuento entre 3.0
x 10
2
ufc/ml y 1.6x
10
3
ufc/ml
NO

28 
 
Ensayo NA (determinación de la ac4vidad bactericida) 
Sustancia interferente 
Pipetear 1,0 ml  
Tubo de ensayo 
Suspensión de ensayo 
Pipetear 1,0 ml  
Mezclar con vortex 10s 
Colocar tubo en baño de 
agua controlado a 
temperatura de ensayo 
SI
Suspensión
de validación

29 
 
T1=    20 (±1) °C  T2= 36  (±1)°C 
AcNvar cronómetro 
durante 2 min 
Solución de ensayo 
del desinfectante   
 
8,0 ml 
agua controlado a 
temperatura 
Tomar 1,0 ml de la 
mezcla de ensayo Na 
Tubo con 8,0 ml de 
neutralizante y 1,0 
ml de agua 
t A=0 min 
Mezclar con vortex 10s. 
agua controlado a 20 ±1°C 
T1=    20 (±1) °C 
°C 
  T2= 36 (±1) °C 
t B=2 min  t C=5 min  t D=10 min

30 
 
Tomar muestra de 1,0 
ml de esta mezcla por 
duplicado 
Dejar neutralizar 
durante 5 min 
Incubar a 37°C, 24h 
Sembrar por la técnica 
de verNdo en cajas. 
Recuento N0
entre 1.5x10
7
ufc/ml y 5x10
7
ufc/ml
SI NO
Ensayo valido.
(cumple
especificacion
NTC)
Ensayo no 
valido
RepeNr ensayo

31 
 
Parámetro A de control de la condición experimental
Sustancia 
interferente 
Suspensión de
validación
Pipetear 1,0 ml 
en un tubo 
Tomar  1,0 ml 
AcNvar 
cronómetro, 2min. 
Mezclar en Vortex, 
10s. 
agua controlado 
temperatura T1, T2,  
Agua destilada
esteril
8,0 ml 
Mezclar en Vortex, 
10s. 
 
Colocar tubo en baño de agua 
controlado a las temperaturas del 
ensayo T1,  T2,  durante los Nempos 
del ensayo tA, tB, tC, t D

32 
 
Sembrar por la técnica 
de de verNdo en cajas. 
Incubar a 37°C, 24h 
Tomar una muestra de 1,0 ml de la 
mezcla de ensayo A por duplicado 
SI NO
Ensayo valido.
(Cumple
especificación
NTC)
Ensayo no 
valido
RepeNr ensayo
Recuento igual o
superior a
0.5xNvo

33 
 
Parámetro B de control del neutralizante
(Verificación de la ausencia de toxicidad del neutralizante)
Neutralizante 
en un tubo 
Agua 
AcNvar 
cronómetro 
Añadir 1,0 ml 
Suspensión de
validación
Colocar tubo en baño de agua 
controlado  a 20 (±1)°C, 5 min 
Mezclar  en Vortex 
10s 
Tomar muestra de 1,0 
ml de esta mezcla B 
por duplicado 
Inocular uNlizando la técnica 
de verNdo en cajas 
Incubar a 37°C, 24 
h.

34 
 
Parámetro C. Estandarización del método.
Sustancia interferente 
Diluyente  
1,0 ml  
Desinfectante  
8,0 ml  
Colocar tubo en baño de agua T1  T2 
durante tA. tB. tC. tD. 
SI NO
Ensayo valido.
(cumple
especificacion
NTC)
Ensayo no 
valido
RepeNr ensayo
Recuento igual o
superior a
0.5xNvo

35 
 
Mezclar  en Vortex 
10s 
Transferir 1,0 ml de 
la mezcla  
Tubo con 8,0 ml de 
neutralizante 
AcNvar cronómetro, 
5min. 
Colocar el tubo en un baño de 
agua controlado a 20(±1)°C 
Suspensión de 
validación  
1,0 ml  
AcNvar cronómetro, 
30 min. 
Mezclar en vortex 
10s 
Colocar el tubo en un baño de 
agua controlado a 20 (±1)°C

36 
 
SI NO
Ensayo valido.
(cumple
especificacion
NTC)
Ensayo no 
valido
RepeNr ensayo
Recuento igual o
superior a
0.5xNvo

37 
 
5.3.3. Verificación de la metodología
Se llevó a cabo de acuerdo con los numerales 5.7 y 5.8 de la NTC 5473 del ICONTEC,
mediante la comparación de la media aritmética de las replicas de los resultados obtenidos
con los límites básicos (tabla 2) establecidos por la norma (Anexo 3).
Tabla 2. Límites básicos establecidos por la NTC 5473 del ICONTEC.
N 1.5 * 10
8
ufc/mL y 5 * 10
8
ufc/mL
8.17 = LOG N = 8.70
No 1.5 * 10
7
ufc/mL y 5 * 10
7
ufc/mL
7.17 = LOG No =
7.70
Nvo 30 ufc/mL y 160 ufc/mL
Nv
Está comprendido entre
300 ufc/mL y 1600 ufc/mL
A,B,C Son iguales o superiores a 0.5 (Nvo)
Al menos una concentración debe demostrar un LOG R ≥ 5 y al menos una concentración
debe demostrar un LOG R < 5
En el control de los recuentos de los valores medios ponderados el cociente no es inferior a
5 ni superior a 15
5.4. Recolección de la información.
Para recolectar la información se emplearon los parámetros establecidos por la norma
técnica colombiana 5473 a partir de la cual se tuvo en cuenta los procedimientos
experimentales para la determinación de la actividad bactericida del desinfectante empleado.
Además se obtuvo información partir de consulta bibliográfica con el fin de determinar los
mecanismos de acción del proceso de desinfección y su aplicación en instrumental médico.
Para la recopilación de los datos experimentales se empleó una matriz en la cual se
registraron los resultados obtenidos en cada una de las replicas a las condiciones de

38 
 
tiempo, temperatura, tipo de microorganismo, interferente y concentración del desinfectante
evaluados.
Por otra parte se emplearon tablas en la cual se registraron los resultados obtenidos a partir
del conteo de células/ ml en cada uno de los ensayos y en los controles realizados.
5.5. Análisis de información
Inicialmente se hizo una determinación de los valores Vc, que son los valores
experimentales que se obtuvieron en el método de dilución-neutralización. Estos valores
incluyen los valores de ensayo y los controles.
En el método de dilución-neutralización se tuvo en cuenta valores Vc entre un limite entre 14
y 130 colonias. Para el calculo del numero de células/ ml de la suspensión de ensayo se
calculó la media aritmética ponderada de los recuentos de dos diluciones escogidas de esta
suspensión. Para esto se utilizara la siguiente formula:
N= c
(n1 + 0.1 n2 ) 10
-6
En donde:
C es la suma de los valores Vc tenidos en cuenta;
N1 es el numero de los valores Vc tenidos en cuenta en la dilución inferior, es decir (10
-6
);
n2 es el numero de valores Vc tenidos en cuenta en la segunda dilución, es decir (10
-7
);
10
-6
es el factor de dilución correspondiente a la dilución inferior.
Para determinar el numero de células/ml en la mezcla de ensayo al comienzo del tiempo de
contacto (No) es decir, al tiempo cero, se obtuvo la decima parte de la media aritmética
ponderada de N (numero de células/ml en la suspensión de ensayo) debido a que por la
adición del producto y de la sustancia interferente se obtiene una dilución a la decima parte.
Para la determinación del número de microorganismos supervivientes/ml en la mezcla de
ensayo al final del tiempo de contacto y antes de la neutralización (Na), se empleó la
siguiente formula:
Na= c x 10
n

39 
 
en donde:
c es la suma de los valores Vc tenidos en cuenta;
n es el número de valores Vc tenidos en cuenta.
Para calcular el número de células/ en la suspensión de validación Nv y el número de
células/ml en las mezclas A, B, C al comienzo del tiempo de contacto (Nvo),se empleó la
siguiente formula:
Nv = c x 10
n
Nvo= c
n
en donde:
n es el número de valores Vc tenidos en cuenta.
Para calcular el numero de sobrevivientes en el control de las condiciones experimentales
(tiempo, temperatura, sustancia interferente), control del neutralizante y estandarización del
método al final del tiempo de contacto, se empleó las siguiente formula:
A, B, C = c
n

40 
 
donde :
n es el número de valores Vc tenidos en cuenta
La tabulación de los datos se hizo teniendo en cuenta la matriz de resultados relacionando lo
obtenido en cada uno de los ensayo con las condiciones experimentales trabajadas.
(Anexo3).

41 
 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Establecimiento de las condiciones experimentales para el método de ensayo
dilución-neutralización.
Las condiciones experimentales establecidas por la norma no presentaron modificaciones, a
excepción del tiempo de contacto de 60 min, el cual fue omitido ya que las especificaciones
del producto sugieren un tiempo de contacto corto para ejercer su acción bactericida. Se
establecieron los tiempos de contacto 2, 5 y 10 minutos, luego de un ensayo preliminar que
demostró que el producto ejercía acción bactericida en el menor tiempo de contacto (5
minutos). Las condiciones experimentales obligatorias y adicionales aplicadas en el ensayo
se consignan en la tabla 1.
6.2. Implementación y Verificación del método de ensayo dilución-neutralización
según la norma técnica colombiana 5473 del 2007.
6.2.1. Preparación de la Suspensión de Ensayo y Validación
Para implementar el procedimiento de preparación de las suspensiones de Ensayo y
Validación se trabajó inicialmente con la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 6538. Para
esto se tomó como referencia el tubo Nº 1 del patrón de McFarland cuya concentración
celular es equivalente a 3x10
8
UFC/ml, para cumplir con las exigencias de la norma que
determina que el recuento en esta suspensión debe ser entre 1.5x10
8
UFC/ml y 5.0x10
8
UFC/ml. La absorbancia reflejada por el patrón de McFarland fue 0.225 así que la
suspensión fue calibrada hasta alcanzar una absorbancia de 0.2. Sin embargo, al realizar el
recuento este fue de 4x10
9
por lo cual fue necesario preparar una suspensión nueva. Se
realizaron de nuevo los tres pases necesarios de la cepa y se ajustó la absorbancia tanto del
patrón como de la suspensión. De forma similar el recuento no cumplía con las
especificaciones de la norma.
De acuerdo con lo anterior, se sugirió trabajar la suspensión utilizando solución salina como
diluyente omitiendo la adición de triptona, ya que se tenía como hipótesis que esto podría
estar interfiriendo con la absorbancia propia de la suspensión. Esto debido a que la triptona,
posee una coloración amarilla que podría estar afectando los resultados emitidos por el
colorímetro. Para comprobar este planteamiento se prepararon dos suspensiones, una
empleando únicamente solución salina como diluyente y la otra utilizando el diluyente

42 
 
especificado en la norma, es decir, solución salina más triptona. La absorbancia de ambas
suspensiones fue similar al patrón de McFarland (0.199). Los resultados de los recuentos
reflejaron que efectivamente, la suspensión elaborada solo con solución salina cumplía con
las especificaciones de la norma Tabla 3, mientras que el recuento de la suspensión
elaborada con triptona excedía los requerimientos de la norma.
A partir de la Suspensión de Ensayo, se preparó la suspensión de validación, siguiendo las
especificaciones de la norma, es decir a partir de una cuarta parte de la dilución 10
-5
de la
Suspensión de ensayo. Igualmente se utilizó como diluyente solución salina y el recuento fue
adecuado para llevar a cabo el procedimiento. Tabla 3.
Para preparar la suspensión de Pseudomonas aeruginosa cepa ATCC 15442, se siguió el
procedimiento descrito para la suspensión de Staphylococcus aureus, es decir, a partir del
patrón de McFarland. Sin embargo al realizar el recuento este era muy alto (10
9
). Se pudo
notar, que la turbidez que proporcionaba una colonia de P. aeruginosa era mayor comparada
con una colonia de S. aureus. Por esta razón, se ajustó la absorbancia a un valor medio
(0.16). Esta absorbancia emitió un recuento que permitió trabajar con esta suspensión y
elaborar a partir de ella, la suspensión de validación. Tabla 3.
Se ha reportado que Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo formador de
biopeliculas. Este tipo de microorganismos son capaces de producir polisacáridos y
glicoproteinas para formar agregados entre si (Wirtanen. G, 2001). Este factor puede influir
en la notoria turbidez generada por este microorganismo. Por esta razón no es
recomendable emplear el patrón de McFarland para ajustar suspensiones de Pseudomonas
aeruginosa. Para ello es posible elaborar una suspensión de alta concentración a partir de la
cual se generen diluciones seriadas en base diez. Cada una de las diluciones se siembra
por duplicado en agar TSA y se mide la absorbancia. Luego se genera una curva de UFC/ml
vs. Absorbancia y por interpolación es posible realizar una aproximación que permita
determinar a qué absorbancia se debe ajustar la suspensión para lograr el recuento
deseado.
En otros estudios como el realizado por Espigares. E, et.al., 2003; se recomienda ajustar
espectofotométricamente la densidad de las suspensiones bacterianas a 620 nm de longitud
de onda, para obtener una absorbancia de 0.2 a 0.3 para bacilos Gramnegativos y de 0.3 a
0.4 para cocos Grampositivos, lo cual puede ser útil al momento de preparar una suspensión
con un recuento comprendido entre 1 y 3x10
8
UFC/ml.

43 
 
Por otra parte, para preparar la suspensión de la cepa de Enterococcus hirae, se utilizó
como referencia la absorbancia emitida por la suspensión de S.aureus (0.19) al tratarse de
microorganismos Grampositivos con morfología microscópicamente similar. La absorbancia
final de la suspensión fue 0.18. El recuento establecido fue el adecuado para trabajar con
esta suspensión. Tabla 3.
Finalmente, se consideró como punto crítico de la evaluación del método, la preparación de
las suspensiones, debido a que es la parte esencial que determina el éxito de los resultados
y del procedimiento.
Tabla 3. UFC/mL en las suspensiones bacterianas de Ensayo (N) y validación (NV)
Microorganismo N NV
LIMPIO SUCIO LIMPIO SUCIO
P aeruginosa 1,6 * 10
8
1,9 * 10
8
3,8*10
2
4,4*10
2
S. aureus 1,8*10
8
1,5*10
8
4,2*10
2
3,9*10
2
E. hirae 4.6 * 10
8
1.5 * 10
8
1.1 * 10
3
3 * 10
2
6.2.2. Evaluación de las condiciones experimentales - Control A.
De acuerdo con la norma, los resultados de los recuentos obtenidos los parámetros de
control no deben se menores a la mitad del recuento obtenido en cada parámetro al final del
tiempo cero de contacto. Esta condición se dio satisfactoriamente en este parámetro, tal
como se refleja en los resultados experimentales consignados en la tabla 4. Esto permitió
determinar que ni las temperaturas trabajadas (20ºC y 36ºC), ni los interferentes, ni los
tiempos de exposición incidieron de forma negativa en el crecimiento de los
microorganismos. Anexo 3.
Cabe aclarar que el diluyente empleado para el ensayo y los controles siguió siendo el
especificado por la norma, excepto en la preparación de las suspensiones en las cuales se
utilizó solamente solución salina, y esto no afectó de ninguna manera los resultados
obtenidos.
Los resultados fueron similares para los dos interferentes.

44 
 
Tabla 4. Parámetro A: Control de las condiciones experimentales seleccionadas
(Promedio valores Vc UFC).
CONTROL A
LIMPIO SUCIO
Microorganismo
0min/
20°C
0 min/
36°C
2min/
20°C
2 min/
36°C
5 min/
20°C
5 min/
36°C
10
min/
20°C
10
min/
36°C
0min/
20°C
0min/
36°C
2min/
20°C
2min/
36°C
5min/
20°C
5min/
36°C
10min/
20°C
10min/
36°C
32 36 30 28 27 19 16 16 37 39 22 28 24 25 20,5 26
34 32 28 30 28 21 19 21 35,5 36,5 25 27,5 21 22,5 26 26
30 30 32 35 32 18 19 15 34 30 27 20,5 27 26 19 22
36 31 32 34 30 16 16 21 32 33 21 23 19 28 25 24,5
38 38 30 30 32 24 14 24 33,5 32,5 20 22,5 24 28 22 28
P.aeruginosa
36 34 28 33 27 21 21 23 35 30 23,5 38,5 22,5 24,5 24,5 24,5
34,5 28,5 37 24,5 21,5 25 28,5 25 34 32 30,5 37 35,5 41,5 31,5 40,5
33 34 33 23 18 22,5 23 26 36 32,5 35 33 37,5 34 35 34
37 36 37 24,5 28,5 21,5 18 30 32 32 39 31,5 36,5 38 34 31,5
38,5 36 33,5 22,5 24 24,5 23 24 31 38 32 35 34,5 35,5 39 30,5
38 32,5 39 21,5 29 25,5 18 24 34,5 39 33 35 34,5 30 35 32
S.aureus
32 37 30 23,5 20 22,5 23 23 30,5 30 33 38 40 31 34,5 35
116 102 96 106.5 121 98 113.5 123 23 29.5 24.5 28.5 24 26 23 31
101 128 100 118 116 114 115 111.5 24 28.5 24.5 27.5 25 27 25 27.5
100 112.5 113 118 108.5 116.6 110 105 27 24 24.5 28 23 26.5 22.5 25.5
114 106 125 109 112 127 131 96 26 25 25 27.5 26 28 22.5 25.5
110 105.5 125 121 115 120.5 111 114 27 26.5 23 30 22 28 25 30
Ehirae
104 110 114.5 103.5 122.5 111 106 102 26.5 29.5 25.5 31.5 24 29 24 28
6.2.3. Verificación de la ausencia de toxicidad del neutralizante – Control B.
El método de dilución neutralización implica el enfrentamiento de una suspensión bacteriana
y un desinfectante bajo condiciones estándar, y la terminación de la reacción mediante la
exposición a un neutralizante. En este estudio se utilizó caldo Letheen que es un medio
altamente nutritivo compuesto por lecitina y tween 80, capaz de neutralizar o inhibir la acción

45 
 
de los componentes activos de los desinfectantes. En este caso, el componente activo del
desinfectante evaluado fue alcohol.
Los datos recopilados en la Tabla 5, muestran que el neutralizante permitió ampliamente el
crecimiento de los microorganismos evaluados, y no presentó efectos negativos que llegaran
a ocasionar inhibición en los mismos. Ver anexo 3.
Tabla 5. Parámetro B: Control del neutralizante (verificación de la ausencia de
toxicidad del neutralizante Promedio valores Vc UFC).
Microorganismo CONTROL B
33
36
34,5
32
34
P. aeruginosa
37
39
38
39
37
36
S. aureus
40
111
93.5
106.5
117
118
E. hirae
120
6.2.4. Validación del método Dilución Neutralización – Control C
De igual manera que en los demás controles, el recuento de todas las replicas en los
diferentes tiempos y temperaturas evaluados (Tabla 6), fue superior a la mitad del recuento
obtenido en el parámetro al final del tiempo de contacto cero, para los tres microorganismos
y las dos condiciones de limpieza simuladas. Ver anexo 3.
Debido a que se trata de un procedimiento dispendioso, lo recomendable es que a la hora de
aplicar la metodología de la norma se inicie con este control.

46 
 
Este parámetro de control permitió determinar que el método esta diseñado para conocer la
acción bactericida de cualquier desinfectante sin generar por si mismo efectos negativos
sobre el microorganismo control.
Tabla 6. Parámetro C: Validación del método de dilución neutralización (Promedio
valores Vc UFC).
CONTROL C
LIMPIO SUCIO
Microorganismo
0 min/
20°C
0 min/
36°C
2min/
20°C
2 min/
36°C
5 min/
20°C
5 min/
36°C
10
min/
20°C
10
min/
36°C
0
min/
20°C
0
min/
36°C
2
min/
20°C
2
min/
36°C
5
min/
20°C
5
min/
36°C
10
min/
20°C
10
min/
36°C
38 37 36,5 28,5 32 34,5 34 37,5 31,5 33,5 30,5 31,5 34,5 35 38,5 33,5
32 36,5 32,5 31 28,5 37,5 40,5 36 33,5 38 38 37 32 39 30 36
35,5 40 39 29 34 32 36 38 34 33,5 40,5 38,5 34,5 39 30 35
37 33 4 32 36,5 34,5 37 33,5 30,5 32 38 36 31 37 34 30,5
31,5 31,5 33,5 39 40 33 31,5 31,5 37 38 37,5 37,5 31,5 37 30 32,5
p.aeruginosa
30 34 31,5 37,5 33,5 30 33 36 33 35 35,5 34 30 38 30 33
48,5 32 42,5 35 40,5 32 47,5 35,5 40,5 34,5 33,5 36,5 33 34,5 38,5 38,5
43,5 35,5 37,5 41,5 49 39,5 39 37 35,5 33,5 33,5 36,5 37 37,5 38,5 40,5
40 32 43 35,5 55 34,5 42 34 36 36,5 35,5 31,5 35,5 35 38 35
37 32,5 39 41,5 42,5 30,5 54 43,5 35,5 42 32,5 40,5 36 34 38,5 38
40,5 36 38 34,5 44,5 37 46 39 37,5 34 37 38,5 33 33,5 34,5 32,5
S.aureus
39,5 35,5 34,5 32,5 49 34 48,5 38,5 34 39 36,5 34,5 41 37,5 36 30
93.5 115.5 95 114 111.5 95.5 95 105.5 28 28.5 32.5 24 26.5 30.5 26 27
96.5 117 95.5 114.5 107 98 95.5 109 23.5 24.5 25.5 27.5 26 25.5 25 26.5
99 108.5 128.5 100.5 108.5 109.5 128.5 95 33.5 27.5 26 25.5 23.5 24 23.5 24.5
119.5 101 105 94 125 98.5 105 102 25.5 28 29.5 29 27 27.5 25.5 24
122 99.5 115.5 113.5 119 102 115.5 100.5 24 24.5 29 25.5 26 25 27 27
E.hirae
126.5 112 127 95.5 127.5 105.5 127 97.5 25 28.5 25.5 25.5 23.5 26 24 25.5

47 
 
6.2.5. Ensayo NA – Método Dilución Neutralización
Para llevar a cabo el método se utilizaron las suspensiones de Ensayo de cada uno de los
microorganismos control propuestos en la norma. Se utilizó un desinfectante para manos en
gel para estandarizar el procedimiento a una concentración de 80%.
El principio activo del desinfectante es alcohol etílico y contiene además glicerina como
emoliente y algunos conservantes. Sin embargo, además de permitir la estandarización del
método, los desinfectantes de este tipo tienen una amplia utilización en el ámbito medico
quirúrgico. Estudios como el realizado por Rochon-Edouard.S., et.al., 2003., establecen la
importancia de los desinfectantes de manos basados en alcohol, para la prevención en la
transmisión de enfermedades por manos del personal hospitalario.
Igualmente, Gaonkar. T.A., et. Al., 2005, manifestaron que los productos basados en alcohol
que contienen emolientes, permiten preservar la integridad de la piel a la vez que
constituyen una alternativa viable de desinfección rápida. Kampf.G., et.al., 2003,
reconocieron que la desinfección de manos con productos que contienen alcohol es
considerada la vía mas efectiva para frenar la cadena de transmisión asociada a infección en
el sector salud.
En el ensayo se trabajaron las seis replicas de cada tiempo y cada temperatura a la vez con
el fin de obtener bajo las mismas circunstancias de ensayo resultados precisos. Por razones
de tiempo y comodidad se trabajo un interferente con las dos temperaturas seleccionadas
(20ºC y 36ºC), con los seis tiempos iniciales (0 min, 5, 10, 15, 30 y 60 min) y las seis replicas
para cada control y para el ensayo. Sin embargo los primeros resultados demostraron que
para Staphylococcus aureus, luego de los 5 minutos de contacto no había crecimiento, es
decir, que en los tiempos 15, 30 y 60 minutos el desinfectante eliminaba los
microorganismos presentes y que en situaciones reales no se trabajan en procesos de
desinfección en ámbito hospitalario donde se debe asegurar una desinfección rápida. Por
esta razón los tiempos de contacto se cambiaron a tiempo 0, 2 minutos, 5 minutos y 10
minutos.
En cuanto a la suspensión de ensayo, la norma exige que sea empleada antes de 2 horas
luego de su preparación. Por la duración de cada uno de los procedimientos (ensayo y
controles) esto no fue posible ya que por día se realizó un solo interferente. Lo que se
procedió a realizar, fue conservar la suspensión en refrigeración a 2ºC aproximadamente,
para ser empleada con el otro interferente. Sin embargo, se notó una disminución en el
recuento tanto de la suspensión de ensayo como en la de validación. Por esta razón fue

48 
 
necesario preparar una suspensión nueva para cada interferente. Los resultados de cada
recuento fueron consignados en la Tabla 3.
El comportamiento de cada cepa evaluada fue diferente. La cepa de S. aureus solo presentó
crecimiento en el tiempo 0, el cual fue mayor a 330 que fue el límite máximo establecido por
la norma (Tabla7). Esto debido a que en este tiempo, el desinfectante es neutralizado
inmediatamente después de la adición del microorganismo, impidiendo que haya un tiempo
de contacto suficiente entre el desinfectante y la suspensión.
Tabla 7. Ensayo NA: Determinación de la actividad bactericida del producto (Promedio
valores Vc UFC).
ENSAYO
LIMPIO SUCIO
Microorganismo
0 min/
20°C
0 min/
36°C
2min/
20°C
2 min/
36°C
5 min/
20°C
5 min/
36°C
10
min/
20°C
10
min/
36°C
0 min/
20°C
0 min/
36°C
2 min/
20°C
2 min/
36°C
5 min/
20°C
5 min/
36°C
10
min/
20°C
10
min/
36°C
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
P.aeruginosa
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
S.aureus
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
E.hirae
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14

49 
 
Tabla 8. Numero de supervivientes por ml (UFC/ml), en las mezclas de ensayo al final
del tiempo de contacto t antes de la neutralización
NA
LIMPIO SUCIOMicroorganismo
2 MIN
20C
2 MIN
36C
5 MIN
20C
5 MIN
36C
10 MIN
20C
10 MIN
36C
2 MIN
20C
2 MIN
36C
5 MIN
20 C
5 MIN
36C
10 MIN
20C
10 MIN
36 C
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
P. aeruginosa
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
S. aureus
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
E. hirae
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
En los demás tiempos evaluados no se presentó crecimiento del microorganismo, con lo cual
se comprueba que el desinfectante es capaz de actuar desde 2 minutos de contacto (tabla
8). Estos resultados están de acuerdo con los resultados establecidos en estudios anteriores
como en el realizado por Chatterjee. I., et.al., 2006, en el cual concentraciones mínimas de
etanol causan ruptura celular y cambios irregulares en la apariencia de las mismas, así como
afección en la función de la membrana celular, interferencia en la división celular, afección

50 
 
en el crecimiento, variación en la composición de los ácidos grasos y en la síntesis de
proteínas e inhibición en el transporte de nutrientes a la célula.
Por otra parte, P. aeruginosa mostró crecimiento leve en todos los tiempos excepto en el
tiempo 0 en el que el recuento en todas la replicas fue mayor a 330 (Tabla 7). Debido a que
en las replicas de los tiempos 2, 5 y 10 los recuentos oscilaron entre10 y 15 colonias, se
tomaron como menores a catorce por especificación de la norma, lo que permitió obtener
valores Na menores a 140 (Tabla 8 ).
La resistencia de P. aeruginosa es atribuida a varios factores que han sido consignados en
diversos estudios. Russel. A.D., 1998, estableció que las bacterias Gramnegativas poseen
reducida sensibilidad hacia los desinfectantes comparadas con los estafilococos debido a los
lipopolisacaridos de su membrana externa que impiden el flujo de los desinfectantes al
interior de la célula. Por otra parte, Gorisch. H, 2003, estableció que P. aeruginosa es capaz
de crecer en etanol e inducir enzimas capaces de oxidarlo y metabolizarlo a acetato.
En cuanto al comportamiento de E. hirae, se esperaba que fuera similar al de la cepa de S.
aureus por la similitud morfológica y tintorial que existe entre estos dos microorganismos. Sin
embargo, E. hirae a diferencia de S. aureus presentó crecimiento en los tiempos 2, 5 y 10 de
ambos interferentes. Los resultados obtenidos con este microorganismo fueron similares a
los de P. aeruginosa, es decir, aunque se presentó crecimiento, el número de colonias fue
menor a 12 por lo cual se consideró la especificación de la norma y se reportó el resultado
como menor a 140 (Tabla 8).
Según el estudio realizado por Sakagami. Et al., 2002, los Enterococos son importantes
patógenos nosocomiales cuyo factor de virulencia importante es su resistencia intrínseca y
adquirida a muchos agentes antimicrobianos; esto podría explicar el crecimiento de la cepa
de E. hirae, en los tiempos de contacto 2, 5 y 10min.
En síntesis, el empleo de desinfectantes en gel cuyo principio activo es alcohol, pueden
constituir un mecanismo importante de desinfección de manos en el ámbito hospitalario, y
para que su efecto sea notorio en bacterias Gramnegativas y otros microorganismos de
difícil eliminación se puede aumentar la concentración de alcohol al tiempo que se manejen
emolientes que eviten el daño a la piel pero no interfieran en la acción bactericida del
desinfectante.

51 
 
7. CONCLUSIONES
Se determinó que las condiciones experimentales del ensayo deben establecerse teniendo
en cuenta las condiciones reales a las que se verá sometido el desinfectante a evaluar; para
este fin, deben tenerse en cuenta las especificaciones del fabricante, el principio activo del
desinfectante, su presentación e incluso el lugar donde se va a utilizar.
Los resultados obtenidos en este estudio elucidan que el método dilución neutralización de
la NTC 5473, resulta confiable para evaluar la actividad bactericida de un desinfectante. De
este modo, la norma garantiza a quien emplee su método dilución neutralización, la
consecución de resultados confiables y el control de los parámetros que pudieran tener un
efecto letal sobre los microorganismos de la prueba.
Mediante el análisis de los resultados obtenidos en el ensayo y en los parámetros de control
se determinó que no se generan inhibiciones del crecimiento bacteriano por motivos
diferentes a la acción del producto a evaluar, tal como la metodología, las condiciones
experimentales y la sustancia neutralizante.
La elaboración del informe del ensayo permitió reportar y verificar los resultados obtenidos,
comparándolos con los límites exigidos por la norma en pro de determinar su validez.

52 
 
8. RECOMENDACIONES.
Utilizar solución salina y no el diluyente citado en la norma, para la preparación de las
suspensiones de ensayo y validación, ya que este puede interferir con la lectura de la
absorbancia.
Si la suspensión de ensayo cumple con la absorbancia teórica del patrón número 1 de Mc
Farland, al utilizar la cuarta parte de la dilución 10
-5
de la suspensión de ensayo, el recuento
de la suspensión de validación cumple con el rango de especificación de la norma.
Para la preparación de la suspensión de ensayo de P. aeruginosa y E. hirae, ajustar la
suspensión a una concentración alta (abs: 0.2) y realizar el recuento, el cual servirá para
preparar las suspensiones por el método de dilución.

53 
 
9. REFERENCIAS
Ascenzi, L. 1996. Handbook of disinfectants and antiseptics. New York. Marcel Kekker.
Chatterjee.I., Somerville.G.A., Heilmann.C., Sahl.H., Maurer.H.H., and Herrmann.M. 2006.
Very low etanol concentrations affect the viability and growth recovery in post-stationary-
phase Staphylococcus aureus populations.Applied an Environmental Microbiology. Vol.72,
Nº4. 2627-2636p.
Gaonkar.T.A., Geraldo.I., Caraos.L., Modak.S.M. 2005. An alcohol hand rub containing a
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Gorisch. H. 2003. The etanol oxidation system and its regulation in Pseudomonas
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Hoh, C.S., y Berry, D.P. 2005. Decontamination and Sterilization. Infection in Surgery. The
Medicine Publishing Company.. 282-284p
ICONTEC, 2006. NTC 5446. Antisépticos y desinfectantes químicos. Ensayo cuantitativo de
suspensión viricida de los antisépticos y desinfectantes químicos. Método de ensayo y
requisitos (fase 2 etapa1). 37pp.
IRM Institut de Recherché Microbiologique. NORMES FRANCAISES. Rue Newton – ZI Mitry-
Compans 77290 MITRY MORY. www.irm.fr/espagnol/normes.htm - 14k
Jaime Rodríguez, Carolina. 2002. Validación de desinfectantes usados en las áreas de
producción de una industria farmacéutica en Bogotá. Microbiología Industrial. Pontificia
Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogota D.C. 75 pp.
Kampf.G., Meyer.B., Goroncy.P. 2003. Comparison of two test methods for the determination
of sufficient antimicrobial activity of three commonly used alcohol-based hand rubs for
hygienic hand disinfection. Journal of Hospital Infection. 55 (220-225).

54 
 
Ninemeier, J.D. 2000.Principios de desinfección: esterilización y reprocesamiento de
instrumental medico y de laboratorio. Grupo editorial Iberoamérica. Quinta edición. México D.
F. 341 p.
Organización Panamericana de la Salud. 2002. Cabinas de seguridad biológica: uso,
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Rochon-Edouard.S., Pons.J:L., Veber.B., Larkin.M., Vassal.S., Lemeland.J.F. 2003.
comparative in vitro and in vivo study of nine alcohol-based handrubs. Association for
Professionals in Infection Control and Epidemiology. Vol.32, Nº4.
Romero Tabares, Antonio. Actualización 2002. Informe sobre el desinfectante New Ger....
(N-Duopropenida). Consejería de Salud. Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias
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Rodríguez Pérez, Abilio Ubaldo. 2006. Evaluación de la actividad bactericida in vitro de
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Steer, J.2002. Decontamination. Infection. The Medicine Publishing Company. 197-200p.
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www.academia.cat/societats/farmcl/llibre/higiene/332.pdf
www.aenor.es/desarrollo/normalizacion/normas/buscadornormas.asp?pag=p - 122k –
www.gastroenlared.com.ar/template.php?pagina=./Articulos/AsistenciaEnEndoscopia/Asisten
ciaGE.htm - 32k -
www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/tema14.pdf -

55 
 
ANEXO 1. METODOLOGIA I

56 
 
ANEXO 2. METODOLOGIA II

57 
 
ANEXO 3
INFORME DEL ENSAYO
Identificación de la muestra de desinfectante:
 
Nombre del producto:      CLEAN HANDS 
Número de lote:      CL0G0072 
Fabricante:        ROPIN para VICAR FARMACÉUTICA S.A. 
Condiciones de almacenamiento:  Temperatura inferior a 30 ºC 
Sustancia acNva:      Alcohol eelico 70%. 
Periodo del análisis:      NOV/24/2007 hasta ENE/11/2007 
Resultados:        Véanse Tablas 9 a 20 
 
 
Conclusión:
De acuerdo con la NTC 5473 del ICONTEC, el lote CL0G0072 del producto CLEAN HANDS,
cuando se utiliza como indica el productor (sin diluir), posee actividad bactericida a partir de
los dos minutos de contacto a 20 ºC y a 36 ºC tanto en condiciones limpias (0.3 g/L albúmina
de suero bovino) como en condiciones sucias (3 g/L albúmina de suero bovino y 3 g/L
eritrocitos de oveja); frente a las cepas mencionadas de Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus y Enterococcus hirae. La media aritmética de la reducción de seis
réplicas fue mayor a 1.0 x 10
5
frente a los microorganismos mencionados en todos los casos
y bajo la influencia de las variables propuestas.
Bogotá Colombia, 2008-01-13
MARÍN DÍAZ JUAN CARLOS
1
NAVARRO PEÑA NATHALIA FERNANDA
2
SANTOS ARÉVALO NATALIA
3
1,2,3, Estudiantes de Microbiología Industrial PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

58 
 
RESULTADOS DEL ENSAYO, VALIDACIÓN Y CONTROLES 
Explicaciones: 
VC: recuentos por ml 
X: media aritméNca 
R: reducción 
Tabla 9. INTERFERENTE LIMPIO 20 C Pseudomonas aeruginosa
  INTERFERENTE LIMPIO 20 C Pseudomonas aeruginosa   
  NV0  CONTROL A   
    control A  control B 
Control 
 C    2 min  5 min  10 min   
  X VC  34,33 34,42  34,00  X VC  30,00  29,33  17,50   
  30 ≤ X VC de NVO ≤ 160?  SI  SI  SI  X VC de A ≥ 0.5 NVO de A?  SI  SI  SI   
            CONTROL C   
              2 min  5 min  10 min   
            X VC  29.5  34.08  35.33   
            X VC de C ≥ 0.5 NVO de C?  SI  SI  SI   
            CONTROL B       
            X VC  34,42       
            X VC de B ≥ 0.5 NVO de B?  SI       
                           
   XNA  R (LOG(N0/ NA))   
 
N  N0  LOG N  LOG N0  7.17 ≤ LOG N0 ≤ 7.70? 
2 min  5 min  10 min  2 min  5 min  10 min   
  1,6 * 10
8
  1,6 * 10
7
  8.2  7.2  SI  <140  <140  <140  5,058  5,058  5,058   
              R ≥ 5?  SI  SI  SI

59 
 
Tabla 10. INTERFERENTE LIMPIO 36 C Pseudomonas aeruginosa
  INTERFERENTE LIMPIO 36 C Pseudomonas aeruginosa   
Control 
 C    2 min  5 min  10 min   
  X VC  33,5 34,42  35,33 X VC  31,66 19,83 19,83  
            CONTROL C   
              2 min  5 min  10 min   
            X VC  32,83 33,58 35,41  
            CONTROL B       
            X VC  34,42       
            X VC de B ≥ 0.5 NVO de B?  SI       
                           
   XNA  R (LOG(N0/ NA))   
 
N  N0  LOG N  LOG N0  7.17 ≤ LOG N0 ≤ 7.70? 
  1.6 * 10
8
  1.6 * 10
7
  8.2  7.2  SI  <140  <140  <140  5,058 5,058  5,058   
              R ≥ 5?  SI  SI  SI

60 
 
Tabla 11. INTERFERENTE SUCIO 20 C Pseudomonas aeruginosa
  INTERFERENTE SUCIO 20 C Pseudomonas aeruginosa   
Control 
 C    2 min  5 min  10 min   
  X VC  34,5 34,42 33,25 X VC  23,08 22,91 22,83  
 
30 ≤ X VC de NVO ≤ 
160?  SI  SI  SI  X VC de A ≥ 0.5 NVO de A?  SI  SI  SI   
            CONTROL C   
              2 min  5 min  10 min   
            X VC  36,66 32,25 32,08333  
            CONTROL B       
            X VC  34,42       
            X VC de B ≥ 0.5 NVO de B?  SI       
                           
   XNA  R (LOG(N0/ NA))   
 
N  N0  LOG N  LOG N0 
7.17 ≤ LOG N0 ≤ 
7.70? 
   1.9 * 10
8
  1.9 * 10
7
  8.27  7.27  SI  <140  <140  <140  5,13 5,13  5,13   
              R ≥ 5?  SI  SI  SI

61 
 
Tabla 12. INTERFERENTE SUCIO 36 C Pseudomonas aeruginosa
  INTERFERENTE SUCIO 36 C Pseudomonas aeruginosa   
control  
C    2 min  5 min  10 min   
  X VC  33,5 34,42 35 X VC  26,66 25,66 25,16  
            CONTROL C   
              2 min  5 min  10 min   
            X VC  35,75 37,5 33,42  
            CONTROL B       
            X VC  34,42       
            X VC de B ≥ 0.5 NVO de B?  SI       
                           
   XNA  R (LOG(N0/ NA))   
 
N  N0  LOG N  LOG N0  7.17 ≤ LOG N0 ≤ 7.70? 
   1.9 * 10
8
  1.9 * 10
7
  8.27  7.27  SI  <140  <140  <140  5,13 5,13  5,13   
              R ≥ 5?  SI  SI  SI

62 
 
 
Tabla 13. INTERFERENTE LIMPIO 20 C Staphylococcus aureus
  INTERFERENTE LIMPIO 20 C Staphylococcus aureus   
    control A  Control B 
Control 
 C    2 min  5 min  10 min   
  X VC  35,5 38,17 41,5 X VC  34,91 23,5 22,25  
            CONTROL C   
              2 min  5 min  10 min   
            X VC  39,08 46,75 46,16  
            CONTROL B       
            X VC  38,17      
            X VC de B ≥ 0.5 NVO de B?  SI       
                           
   XNA  R (LOG(N0/ NA))   
 
N  N0  LOG N  LOG N0  7.17 ≤ LOG N0 ≤ 7.70? 
   1.8 * 10
8
  1.8 * 10
7
  8.25  7.25  SI  <140  <140  <140  5,11 5,11  5,11   
              R ≥ 5?  SI  SI  SI

63 
 
 
Tabla 14. INTERFERENTE LIMPIO 36 C Staphylococcus aureus
  INTERFERENTE LIMPIO 36 C Staphylococcus aureus   
    control A  Control B 
control  
C    2 min  5 min  10 min   
  X VC  34 38,17 33,92 X VC  23,25 23,58 25,16  
            CONTROL C   
              2 min  5 min  10 min   
            X VC  36,75 34,58 37,91  
            CONTROL B       
            X VC  38,17       
            X VC de B ≥ 0.5 NVO de B?  SI       
                           
   XNA  R (LOG(N0/ NA))   
 
N  N0  LOG N  LOG N0  7.17 ≤ LOG N0 ≤ 7.70? 
    1.8 * 10
8
  1.8 * 10
7
  8.25  8.25  SI  <140  <140  <140  5,11 5,11  5,11   
              R ≥ 5?  SI  SI  SI

64 
 
Tabla 15. INTERFERENTE SUCIO 20 C Staphylococcus aureus
  INTERFERENTE SUCIO 20 C Staphylococcus aureus   
Control 
 C    2 min  5 min  10 min   
  X VC  33 38,17 36,5 X VC  33,75 36,42 34,83  
            CONTROL C   
              2 min  5 min  10 min   
            X VC  34,75 35,91 37,33  
            CONTROL B       
            X VC  38,17       
            X VC de B ≥ 0.5 NVO de B?  SI       
                           
   XNA  R (LOG(N0/ NA))   
 
N  N0  LOG N  LOG N0  7.17 ≤ LOG N0 ≤ 7.70? 
    1.5 * 10
8
  1.5 * 10
7
  8.17  7.17  SI  <140  <140  <140  5.03 5.03  5.03   
              R ≥ 5?  SI  SI  SI

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