MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE
I- MICROBIOLOGIE QUANTITATIVEMicroorganismes =           - combien? Quel taux?           - distribution?           - diver...
1- Echantillonnage                                    Eau                    SédimentAccès                  direct, éloign...
Filet à plancton                      (algues et protozoaires)Bouteille de Niskin
Pelle à sédimentCarottier
2. Activité enzymatique               enzyme    Substrat               produit   Disparition du substrat   Apparition du p...
2.1- Dynamique                                               AUTOCLAVED                                              150  ...
2.2- Traceurs et marqueurs Ajout de substrat             devenir?        - chromogène ou fluorogène        - marquage isot...
Substrat chromogène ou fluorogèneColorimétrie                                     Microplaque Biolog                      ...
Marquage isotopique      Même élément = différentes masses    Carbon-12                Carbon-13          Carbon-14       ...
Isotopes radioactifs3H    [3H]-CH3                   Oxydation du méthane14C   [14C]-CaCO3                photosynthèse35S...
Isotopes stables                    Fractionnement    Soufre             32S, 33S, 34S, 35S                           Isot...
Spectromètre de masse + GC    Séparation et identification      Rapport masse/charge    des isotopes•    13C/12C = 0.01122...
3- Biomasse   Densité = nb de cellule par volume ou par surface   Biomasse = mg de C par volume ou par surface            ...
2 Stratégies:                            Comptage direct                 DIRECT                            BiomarqueursQua...
2.1. CULTURE EN MILIEU SOLIDE             COMPTAGE des UFC
2.2. CULTURE LIQUIDE           Estimation statistique Nombre le plus probable (NPP)                    1 ml dans 9 ml     ...
2.3. COMPTAGE DIRECTHémocytomètre    Microscope         Eucaryotes                 photoniqueElectrolyte       Compteur de...
Hémocytomètre                Algues,                champignons,                protozoaires
Microscope à épifluorescence                  Occulaire                                   Filtre                          ...
Hybridation                    FISH  Populations, groupes taxonomiques
Cytomètre de flux                                 SSC = granularité Flux            Détecteur de d’échantillon   lumière  ...
2.4. BIOMARQUEURS      ADN, ATP, chla, lipides, acide muramique….DNA          1.6-5.7 fg / bactérieATP          1 fg / bac...
LIPIDES         Membranes cytoplasmiques                       Acides gras                       phospholipidiques        ...
Groupes fonctionnels               Champignons18:2w6                                   Bactéries 18:1w7c                  ...
ACIDES NUCLEIQUES                   - ARNm =                                                          ADN gènes fonctionne...
PCR = Polymerase Chain Reaction                                       Température ºC                               dénatur...
PCR en temps réel                          Sonde TaqMan        mesurer à chaque cycle d’amplification la quantité        d...
4- Diversité génétique       = Acides nucléiques         ARNm = diversité phénotypique         ADN = diversité génotypique...
Quel gène amplifier?- ARN ribosomal              genres et espèces        16S        ITS                23S- Eléments répé...
Séparation par la TAILLEFragments de taille variable                         ITS, éléments répétés, microsatellites       ...
Fragments de même taille   ARNr 16S, gènes fonctionnels   Couper avec une enzyme de restriction         POPULATION        ...
COMMUNAUTE             Trop de bandes                                              *                                      ...
Séparation par la COMPOSITION % bases G+C              DENATURATIONÉlectrophorèse sur gel d’acrylamide            GC clamp...
CONFORMATION = SSCP Single strand conformation polymorphism                  Électrophorèse d’acrylamide                  ...
Analyse du profil = Diversité et structure                      Richesse: nombre de phylotypes                      chaque...
Identification = séquençage                        Analyse phylogénétiqueÉlectrophorèseou dHPLC                 Séquençage...
Séparer sans électrophorèse= clonagerestriction                           Plasmides   2 kb              β-galactosidase   ...
Maxima cloaca (genoscope- Evry)
séquençage         ATGGCCTTAAAAGC                   ATGGCCTTAAAAGC                   ATGGCCTTAAAAG                   ATGGC...
Hybridation                  Puces à ADN   ARNr 16S ou gènes fonctionnels
Attention!!!Choix de la méthodeBiais
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  1. 1. MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE
  2. 2. I- MICROBIOLOGIE QUANTITATIVEMicroorganismes = - combien? Quel taux? - distribution? - diversité? - rôle fonctionnel? - contrôles? Méthodes de mesure standardisées, précises, répétables, sensibles
  3. 3. 1- Echantillonnage Eau SédimentAccès direct, éloigné éloignéEchantillonnage filet, bouteille, filtre pelle, carottierTraitement dilution, concentration dilution - stériliser ou rincer - fixation (glutaraldéhyde, formaldéhyde) - stockage (4 ou - 20 ou - 80°C) - faire les analyses le + vite possible!!!!
  4. 4. Filet à plancton (algues et protozoaires)Bouteille de Niskin
  5. 5. Pelle à sédimentCarottier
  6. 6. 2. Activité enzymatique enzyme Substrat produit Disparition du substrat Apparition du produit - Activité réelle dynamique - Activité potentielle Traceurs et marquage - fluorescent, coloré - isotopique stable ou radioactif
  7. 7. 2.1- Dynamique AUTOCLAVED 150 Fe(II)Quantifier substrats et produits 100 Fe (II) uMAu cours du temps 50 Réduction de Fe (III) 0 0 200 400 600 800 time (h) Inhibiteurs ou compétiteurs nitrapyrine NH4+ oxidase chlorate NO2- oxidase C2H2 N2O réductases
  8. 8. 2.2- Traceurs et marqueurs Ajout de substrat devenir? - chromogène ou fluorogène - marquage isotopique Attention!!! Activité potentielle - Microcosmes (radioactifs, chromogène, fluorogène) - Nature (isotopes stables)
  9. 9. Substrat chromogène ou fluorogèneColorimétrie Microplaque Biolog INT respiration INT-formazan Fluorimétrie Methylumbellyferone Amino-methylcoumarine
  10. 10. Marquage isotopique Même élément = différentes masses Carbon-12 Carbon-13 Carbon-14 electrons neutrons protons (6P + 6N) (6P + 7N) (6P + 8N) Isotopes stables Isotopes radioactifs
  11. 11. Isotopes radioactifs3H [3H]-CH3 Oxydation du méthane14C [14C]-CaCO3 photosynthèse35S [35S]-SO42- Réduction des sulfates Particules β Excitation Cocktail scintillant = solvant 3H Solvant + émulsifiant + fluor cpm fluor
  12. 12. Isotopes stables Fractionnement Soufre 32S, 33S, 34S, 35S Isotope + léger réagit + viteDesulfovibrio spp. SO42- H2S enrichi en 32SDesulfatomaculum spp. Rapport isotopique 34S/32S – 34S/32Sstandard échantillon δ34Sechantillon = x 1000 34S/32S standard
  13. 13. Spectromètre de masse + GC Séparation et identification Rapport masse/charge des isotopes• 13C/12C = 0.011225 ions• 13C/12C = 0.011071• 13C/12C = 0.010918 Bombardement e- Masse molaire
  14. 14. 3- Biomasse Densité = nb de cellule par volume ou par surface Biomasse = mg de C par volume ou par surface fg C Cell-1culture Escherichia coli 109-323bacterioplancton Antarctique 7-13
  15. 15. 2 Stratégies: Comptage direct DIRECT BiomarqueursQuantité? INDIRECT culture
  16. 16. 2.1. CULTURE EN MILIEU SOLIDE COMPTAGE des UFC
  17. 17. 2.2. CULTURE LIQUIDE Estimation statistique Nombre le plus probable (NPP) 1 ml dans 9 ml Table de Mac Grady (extrait) NPP10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 3 2 0 9 + + + - - + - - - - 3 2 1 15 + + - - - 3 2 2 21 3 2 1 0 0 Bactéries/ml = 15/10-2 = 1500
  18. 18. 2.3. COMPTAGE DIRECTHémocytomètre Microscope Eucaryotes photoniqueElectrolyte Compteur de particules = cytomètre de fluxFluorescence Microscope à épifluorescence
  19. 19. Hémocytomètre Algues, champignons, protozoaires
  20. 20. Microscope à épifluorescence Occulaire Filtre em.Filtreexc. objectif excitation emission Acridine orange, DAPI, Syber green
  21. 21. Hybridation FISH Populations, groupes taxonomiques
  22. 22. Cytomètre de flux SSC = granularité Flux Détecteur de d’échantillon lumière FSC = taille SSCLaser FSC488nm Dispersion et émission
  23. 23. 2.4. BIOMARQUEURS ADN, ATP, chla, lipides, acide muramique….DNA 1.6-5.7 fg / bactérieATP 1 fg / bactérieProblèmes = état physiologique, tous les organismes vivants
  24. 24. LIPIDES Membranes cytoplasmiques Acides gras phospholipidiques Acides gras FAME = Fatty acid methyl ester PLFA = Phospholipid linked fatty acids 1- Extraction avec des solvants 2- Esterification 3- chromatographie gazeuse
  25. 25. Groupes fonctionnels Champignons18:2w6 Bactéries 18:1w7c cy19:0 i15:0 a15:0 Actinomycètes 10Me 18:0 i14:0 Biomarqueurs = diversité + biomasse
  26. 26. ACIDES NUCLEIQUES - ARNm = ADN gènes fonctionnels ARNr 23S ARNr 16S ARNr 5S Extraction= + 1- lyse (physique, chimique, enzymatique) 2- extraction (phenol/chloroforme) 3- purification 4- précipitation (éthanol, iso-propanol) http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html
  27. 27. PCR = Polymerase Chain Reaction Température ºC dénaturation 94-96 1er cycle amorces 50-60 hybridation+ dNTPs polymérase élongation 72 94-96 2e cycle
  28. 28. PCR en temps réel Sonde TaqMan mesurer à chaque cycle d’amplification la quantité d’ADN par marquage fluorescent log[ADN]=a(nombre de cycle)+b[ADN] Nb de cycles
  29. 29. 4- Diversité génétique = Acides nucléiques ARNm = diversité phénotypique ADN = diversité génotypique - Population - Groupes fonctionnels - Communauté PROFIL = code barre de l’espèce ou de la communauté SEQUENCE = succession de paires de base
  30. 30. Quel gène amplifier?- ARN ribosomal genres et espèces 16S ITS 23S- Eléments répétés espèces- DNA gyrase (gyrA et gyrB) espèces- Gènes fonctionnels groupes fonctionnels Ex. Nir K et Nir S codent des nitrites réductases dénitrification
  31. 31. Séparation par la TAILLEFragments de taille variable ITS, éléments répétés, microsatellites Paires de bases - 1000 Électrophorèse 500 en cuve ou en capillaire + 200 Gel d’agarose ou d’acrylamide par LC (pair d’ions)
  32. 32. Fragments de même taille ARNr 16S, gènes fonctionnels Couper avec une enzyme de restriction POPULATION A B Souche RFLP (restriction fragment length polymorphism)
  33. 33. COMMUNAUTE Trop de bandes * Espèce Aamorce fluorescente* * Espèce B A B A+B A+B *Gel d’acrylamide(electrophorèse *capillaire) RFLP tRFLP
  34. 34. Séparation par la COMPOSITION % bases G+C DENATURATIONÉlectrophorèse sur gel d’acrylamide GC clamp Amplicon Gradient dénaturant chimique (DGGE) ou thermique (TGGE, TTGE) Élution à 65 ºC dHPLC pair d’ions
  35. 35. CONFORMATION = SSCP Single strand conformation polymorphism Électrophorèse d’acrylamide (gel ou capillaire)ARNr 16S, gènes fonctionnels Dans le gel à 20°C les simples brins se replient sur eux-mêmes A+BDénaturation (98°C-5 min)2 simples brins
  36. 36. Analyse du profil = Diversité et structure Richesse: nombre de phylotypes chaque bande = 1 phylotype ou OTU Structure: profil de bandes Similarité entre 2 communautés = similarité entre 2 profils Composition? Quelles espèces?
  37. 37. Identification = séquençage Analyse phylogénétiqueÉlectrophorèseou dHPLC Séquençage séparation des Identification phylotypes
  38. 38. Séparer sans électrophorèse= clonagerestriction Plasmides 2 kb β-galactosidase Fosmides 40kb vecteur Cosmides 40kb Résistance BAC 300 kb ADN environnement YAC >300 kb vecteur ligation sélection
  39. 39. Maxima cloaca (genoscope- Evry)
  40. 40. séquençage ATGGCCTTAAAAGC ATGGCCTTAAAAGC ATGGCCTTAAAAG ATGGCCTTAAAA PCR ATGGCCTTAAA ATGGCCTTAA Électrophorèse ATGGCCTTA capillaire ATGGCCTT ATGGCCT dNTPs ATGGCC fluorescents ATGGC ATGG STOP! ATG AT A
  41. 41. Hybridation Puces à ADN ARNr 16S ou gènes fonctionnels
  42. 42. Attention!!!Choix de la méthodeBiais

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