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  1. 1. MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE
  2. 2. I- MICROBIOLOGIE QUANTITATIVEMicroorganismes = - combien? Quel taux? - distribution? - diversité? - rôle fonctionnel? - contrôles? Méthodes de mesure standardisées, précises, répétables, sensibles
  3. 3. 1- Echantillonnage Eau SédimentAccès direct, éloigné éloignéEchantillonnage filet, bouteille, filtre pelle, carottierTraitement dilution, concentration dilution - stériliser ou rincer - fixation (glutaraldéhyde, formaldéhyde) - stockage (4 ou - 20 ou - 80°C) - faire les analyses le + vite possible!!!!
  4. 4. Filet à plancton (algues et protozoaires)Bouteille de Niskin
  5. 5. Pelle à sédimentCarottier
  6. 6. 2. Activité enzymatique enzyme Substrat produit Disparition du substrat Apparition du produit - Activité réelle dynamique - Activité potentielle Traceurs et marquage - fluorescent, coloré - isotopique stable ou radioactif
  7. 7. 2.1- Dynamique AUTOCLAVED 150 Fe(II)Quantifier substrats et produits 100 Fe (II) uMAu cours du temps 50 Réduction de Fe (III) 0 0 200 400 600 800 time (h) Inhibiteurs ou compétiteurs nitrapyrine NH4+ oxidase chlorate NO2- oxidase C2H2 N2O réductases
  8. 8. 2.2- Traceurs et marqueurs Ajout de substrat devenir? - chromogène ou fluorogène - marquage isotopique Attention!!! Activité potentielle - Microcosmes (radioactifs, chromogène, fluorogène) - Nature (isotopes stables)
  9. 9. Substrat chromogène ou fluorogèneColorimétrie Microplaque Biolog INT respiration INT-formazan Fluorimétrie Methylumbellyferone Amino-methylcoumarine
  10. 10. Marquage isotopique Même élément = différentes masses Carbon-12 Carbon-13 Carbon-14 electrons neutrons protons (6P + 6N) (6P + 7N) (6P + 8N) Isotopes stables Isotopes radioactifs
  11. 11. Isotopes radioactifs3H [3H]-CH3 Oxydation du méthane14C [14C]-CaCO3 photosynthèse35S [35S]-SO42- Réduction des sulfates Particules β Excitation Cocktail scintillant = solvant 3H Solvant + émulsifiant + fluor cpm fluor
  12. 12. Isotopes stables Fractionnement Soufre 32S, 33S, 34S, 35S Isotope + léger réagit + viteDesulfovibrio spp. SO42- H2S enrichi en 32SDesulfatomaculum spp. Rapport isotopique 34S/32S – 34S/32Sstandard échantillon δ34Sechantillon = x 1000 34S/32S standard
  13. 13. Spectromètre de masse + GC Séparation et identification Rapport masse/charge des isotopes• 13C/12C = 0.011225 ions• 13C/12C = 0.011071• 13C/12C = 0.010918 Bombardement e- Masse molaire
  14. 14. 3- Biomasse Densité = nb de cellule par volume ou par surface Biomasse = mg de C par volume ou par surface fg C Cell-1culture Escherichia coli 109-323bacterioplancton Antarctique 7-13
  15. 15. 2 Stratégies: Comptage direct DIRECT BiomarqueursQuantité? INDIRECT culture
  16. 16. 2.1. CULTURE EN MILIEU SOLIDE COMPTAGE des UFC
  17. 17. 2.2. CULTURE LIQUIDE Estimation statistique Nombre le plus probable (NPP) 1 ml dans 9 ml Table de Mac Grady (extrait) NPP10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 3 2 0 9 + + + - - + - - - - 3 2 1 15 + + - - - 3 2 2 21 3 2 1 0 0 Bactéries/ml = 15/10-2 = 1500
  18. 18. 2.3. COMPTAGE DIRECTHémocytomètre Microscope Eucaryotes photoniqueElectrolyte Compteur de particules = cytomètre de fluxFluorescence Microscope à épifluorescence
  19. 19. Hémocytomètre Algues, champignons, protozoaires
  20. 20. Microscope à épifluorescence Occulaire Filtre em.Filtreexc. objectif excitation emission Acridine orange, DAPI, Syber green
  21. 21. Hybridation FISH Populations, groupes taxonomiques
  22. 22. Cytomètre de flux SSC = granularité Flux Détecteur de d’échantillon lumière FSC = taille SSCLaser FSC488nm Dispersion et émission
  23. 23. 2.4. BIOMARQUEURS ADN, ATP, chla, lipides, acide muramique….DNA 1.6-5.7 fg / bactérieATP 1 fg / bactérieProblèmes = état physiologique, tous les organismes vivants
  24. 24. LIPIDES Membranes cytoplasmiques Acides gras phospholipidiques Acides gras FAME = Fatty acid methyl ester PLFA = Phospholipid linked fatty acids 1- Extraction avec des solvants 2- Esterification 3- chromatographie gazeuse
  25. 25. Groupes fonctionnels Champignons18:2w6 Bactéries 18:1w7c cy19:0 i15:0 a15:0 Actinomycètes 10Me 18:0 i14:0 Biomarqueurs = diversité + biomasse
  26. 26. ACIDES NUCLEIQUES - ARNm = ADN gènes fonctionnels ARNr 23S ARNr 16S ARNr 5S Extraction= + 1- lyse (physique, chimique, enzymatique) 2- extraction (phenol/chloroforme) 3- purification 4- précipitation (éthanol, iso-propanol) http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html
  27. 27. PCR = Polymerase Chain Reaction Température ºC dénaturation 94-96 1er cycle amorces 50-60 hybridation+ dNTPs polymérase élongation 72 94-96 2e cycle
  28. 28. PCR en temps réel Sonde TaqMan mesurer à chaque cycle d’amplification la quantité d’ADN par marquage fluorescent log[ADN]=a(nombre de cycle)+b[ADN] Nb de cycles
  29. 29. 4- Diversité génétique = Acides nucléiques ARNm = diversité phénotypique ADN = diversité génotypique - Population - Groupes fonctionnels - Communauté PROFIL = code barre de l’espèce ou de la communauté SEQUENCE = succession de paires de base
  30. 30. Quel gène amplifier?- ARN ribosomal genres et espèces 16S ITS 23S- Eléments répétés espèces- DNA gyrase (gyrA et gyrB) espèces- Gènes fonctionnels groupes fonctionnels Ex. Nir K et Nir S codent des nitrites réductases dénitrification
  31. 31. Séparation par la TAILLEFragments de taille variable ITS, éléments répétés, microsatellites Paires de bases - 1000 Électrophorèse 500 en cuve ou en capillaire + 200 Gel d’agarose ou d’acrylamide par LC (pair d’ions)
  32. 32. Fragments de même taille ARNr 16S, gènes fonctionnels Couper avec une enzyme de restriction POPULATION A B Souche RFLP (restriction fragment length polymorphism)
  33. 33. COMMUNAUTE Trop de bandes * Espèce Aamorce fluorescente* * Espèce B A B A+B A+B *Gel d’acrylamide(electrophorèse *capillaire) RFLP tRFLP
  34. 34. Séparation par la COMPOSITION % bases G+C DENATURATIONÉlectrophorèse sur gel d’acrylamide GC clamp Amplicon Gradient dénaturant chimique (DGGE) ou thermique (TGGE, TTGE) Élution à 65 ºC dHPLC pair d’ions
  35. 35. CONFORMATION = SSCP Single strand conformation polymorphism Électrophorèse d’acrylamide (gel ou capillaire)ARNr 16S, gènes fonctionnels Dans le gel à 20°C les simples brins se replient sur eux-mêmes A+BDénaturation (98°C-5 min)2 simples brins
  36. 36. Analyse du profil = Diversité et structure Richesse: nombre de phylotypes chaque bande = 1 phylotype ou OTU Structure: profil de bandes Similarité entre 2 communautés = similarité entre 2 profils Composition? Quelles espèces?
  37. 37. Identification = séquençage Analyse phylogénétiqueÉlectrophorèseou dHPLC Séquençage séparation des Identification phylotypes
  38. 38. Séparer sans électrophorèse= clonagerestriction Plasmides 2 kb β-galactosidase Fosmides 40kb vecteur Cosmides 40kb Résistance BAC 300 kb ADN environnement YAC >300 kb vecteur ligation sélection
  39. 39. Maxima cloaca (genoscope- Evry)
  40. 40. séquençage ATGGCCTTAAAAGC ATGGCCTTAAAAGC ATGGCCTTAAAAG ATGGCCTTAAAA PCR ATGGCCTTAAA ATGGCCTTAA Électrophorèse ATGGCCTTA capillaire ATGGCCTT ATGGCCT dNTPs ATGGCC fluorescents ATGGC ATGG STOP! ATG AT A
  41. 41. Hybridation Puces à ADN ARNr 16S ou gènes fonctionnels
  42. 42. Attention!!!Choix de la méthodeBiais

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