1. “PREPARACION DE MEDIOS DE
CULTIVO PARA BIOQUÍMICAS E
IDENTIFICACION DE LOS
GRUPOS BACTERIANOS”

2. GRUPOS BACTERIANOS:
Los principales grupos bacterianos son los
siguientes:
• Las clamidias: son bacterias de crecimiento
intracelular obligado. Su diámetro es de 250 a 500
nm, y a diferencia de los virus poseen ADN y
ribosomas que les permiten sintetizar sus propias
proteínas. Las especies de Clamidias que producen
patología en el ser humano son Chlamydia
psittaci, Chlamydia trachomatis y Chlamydia
pneumoniae y su asociación es con enfermedades
de transmisión sexual, infecciones respiratorias y
enfermedad ocular.

3. • Las rickettsias: son pequeñas bacterias
pleomórficas que se comportan como parásitos
intracelulares obligados, se mantienen en la
naturaleza mediante un ciclo que incluye
mamíferos como reservorios e insectos como
vectores y tienen una distribución geográfica
irregular, causando enfermedad cuando se
producen las adecuadas circunstancias de
proximidad a los animales reservorios o de
pobreza y hacinamiento. La rickettsias pueden
afectar a todo tipo de pacientes, por tanto, no
son patógenos oportunistas, y, salvo Coxiella
burnetti, todas ellas producen vasculitis y
lesiones en la piel, pudiendo ser descartadas
cuando éstas no existen.

4. • Los micoplasmas: son los
microorganismos más pequeños capaces de
una existencia independiente, representando
la forma de vida libre más pequeña. A
diferencia del resto de las bacterias, carecen
de pared celular y su membrana es rica en
esteroles. Mycoplasma pneumoniae,
Mycoplasma hominis y Ureaplasma
urealyticum son los patógenos más
frecuentes en el hombre, y han de ser
considerados fundamentalmente en
síndromes respiratorios y en patología de
transmisión sexual.

5. • Las espiroquetas: son microorganismos
pertenecientes a la familia Treponemataceae,
bacterias helicoidales cuyos géneros más
significativos son Leptospira, Treponema y
Borrelia. Pueden afectar a sujetos previamente
sanos, y sólo en determinados contextos
debemos pensar en ellas.
• Las bacterias clásicas o eubacterias:
constituyen una de las causas más importantes
de infección. Debe pensarse en enfermedad
bacteriana prácticamente en casi todo tipo de
infección, pero muy especialmente ante cuadros
agudos y de rápida evolución. Las infecciones
bacterianas pueden ser atribuibles
fundamentalmente a bacterias grampositivas y a
bacterias gramnegativas.

6. • Bacterias altas: Este grupo de bacterias
formado por los géneros Nocardia,
Mycobacterium y Actynomices tienen como
propiedad más característica su ácido-alcohol
resistencia y la tendencia a producir cuadros
clínicos de instauración lenta e insidiosa
caracterizados por la producción de lesiones
granulomatosas con tendencia a la cavitación
y a la fistulización. La nocardiosis y la
tuberculosis pueden afectar tanto a pacientes
sanos como a inmunodeprimidos, y tienen
una preferencia por la participación
respiratoria.

7. PRUEBAS BIOQUIMICAS:
• Las pruebas bioquímicas son una serie de
análisis clínicos que sirven a la Medicina
como apoyo a la hora de diagnosticar
infecciones por bacterias. Consisten en
distintos test químicos aplicados a medios
biológicos, los cuales, conocida su
reacción, nos permiten identificar
distintos microorganismos presentes.

8. PRUEBAS IMVIC:
• Se compone de cuatro pruebas; su finalidad es
identificar un organismo del grupo de los
coliformes. La presencia de estos indica
contaminación fecal.
• Agar Citrato.- La utilización de citrato como
única fuente de carbono se detecta en un medio
de cultivo con citrato como única fuente de
carbono mediante el crecimiento y la
alcalinización del medio; es una prueba útil en
la identificación de enterobacterias.

9. • Indol.- La producción de indol es una
característica importante para la identificación de
muchas especies de microorganismos. La prueba
de indol está basada en la formación de un
complejo rojo cuando el indol reacciona con el
grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído.
La prueba estudia la capacidad de degradar el
triptófano con producción de Indol y metabolitos
indólicos.
• Rojo Metilo.- Estudia la fermentación ácido
mixta con producción de ácidos estables en el
tiempo. Una de las características taxonómicas que
se utilizan para identificar los diferentes géneros
de enterobacterias lo constituyen el tipo y la
proporción de productos de fermentación que se
originan por la fermentación de la glucosa. Se
utiliza para visualizar la producción de ácidos por
la vía de fermentación ácido mixta.

10. • Vogues Proskauer.- Se determina la vía de
fermentación descrita en la prueba de rojo de
metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es
un producto intermediario en la producción
de butanodiol. En medio alcalino y en
presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a
diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-
naftol dando un color rojo-fucsia.

11. AGAR CITRATO DE
SIMMONS:

12. PRUEBA DE CITRATO
• Principio: Esta prueba sirve para determinar
si un organismo es capaz de utilizar citrato
como única fuente de carbono y compuestos
amoniacales como única fuente de nitrógeno
en su metabolismo, provocando una
alcalinización del medio.
• Objetivo: El citrato es parte del grupo de
pruebas indol- rojo de metilo- voges-
proskauer-citrato (IMViC)para la
identificación de la familia
Enterobacteriaceae, de microorganismos
gramnegativos relacionados y de bacterias no
fermentadoras.

13. • Entre las enterobacterias estas
características se dan en los siguientes
géneros:
Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citroba
cter, arizona y algunas especies de
Salmonella. Sin
embargo, Escherichia, Shigella, Salmonell
a typhi y Salmonella paratyphi, listeria son
incapaces de crecer con esos nutrientes.

14. PROCEDIMIENTO
 Preparación del medio( Agar citrato de
simmons): En un matraz erlenmeyer medir 100
ml de agua purificada y agregar 2.24g del medio.
Poner tapón de algodón envuelto en gasa y dejar
rehidratar por 15 minutos.
• Calentar hasta su punto de ebullición sin dejar
de agitar.
• Dejar enfriar sin solidificación.
• Depositar 3ml del medio en un tubo de ensaye
• Meter al autoclave a 121°C( 15 libras de presión)
durante 15 minutos.
• Dejar que el medio solidifique en posición
inclinada.

15.  Cultivar un microorganismo en el agar.
Crecimiento a partir de un cultivo puro de
18 a 24 horas en agar con hierro de
Kliglert u otra medio adecuado; no se
recomiendan las suspensiones en caldo.

19.  Los cultivos se incuban hasta por 4 días a
temperatura de 35 a 37°C
• incubadora es un dispositivo que sirve
para mantener y hacer crecer cultivos
microbiológicos o cultivos celulares. La
incubadora mantiene la
temperatura, la humedad y otras
condiciones en grado óptimo

20. INTERPRETACIÓN
• Positivo (+): Crecimiento con un intenso
color azul en el pico de flauta.
• Negativo (-): Los microorganismos no crecen
y el medio conserva su color verde.
• Sólo las bacterias capaces de metabolizar el
citrato podrán multiplicarse en este medio y
liberarán iones amonio lo que, junto con la
eliminación del citrato (ácido), generará una
fuerte basificación del medio que será
aparente por un cambio de color del
indicador de pH, de verde a azul.

22. AGAR DE HIERRO
KLIGLER

23. USO:
• El Agar Hierro de Kligler es un medio
empleado para la diferenciación de cultivos
puros de bacilos Gram negativos en base a su
capacidad para fermentar la dextrosa y la
lactosa y a la producción de sulfuro de
hidrógeno.

24. PREPARACIÓN:
• Suspender 52 g del medio en un litro de
agua purificada. Calentar con agitación
suave hasta su completa disolución y
hervir durante un minuto.
• Dispensar en tubos de vidrio, tapar y
esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras
de presión) durante 15 minutos. Dejar
enfriar en posición inclinada.

25. PROCEDIMIENTO:
• 1. Tomar una colonia bien aislada a partir de
un medio sólido.
• 2. Inocular los tubos inicialmente por
picadura en el fondo del tubo (de 3 a 5 mm) y
posteriormente por estría en la superficie.
• 3. Incubar los tubos con las tapas flojas a 35-
37°C durante 18 a 48 horas.
• 4. Leer los tubos para la producción de ácido
en el fondo y la superficie, así como la
producción de gas y sulfuro de hidrógeno.

26. SIEMBRA:
• Este medio se siembra a partir de un
cultivo puro. Debe sembrarse tanto por
estría en la superficie inclinada como por
picadura en la columna vertical. Se
recomienda utilizar tubos con tapones que
permitan el acceso del aire o si son
roscados dejarlos flojos ya que si no se
dificulta la reoxidación del indicador. Este
medio no permite la diferenciación entre
los organismos de los géneros
Salmonella, Shigella y Proteus.

27. RESULTADOS:
• 1. Una superficie alcalina y un fondo ácido
(rojo/amarillo) indica fermentación solo de la
dextrosa.
• 2. Una superficie y fondo ácido (amarillo/amarillo)
indica la fermentación de dextrosa y lactosa.
• 3. Una superficie y fondo alcalino (rojo/rojo) indica
que no hubo fermentación de ninguno de los
carbohidratos.
• 4. La presencia de burbujas o fracturas en el medio
indica la producción de gas.
• 5. La presencia de un precipitado negro indica la
producción de sulfuro de hidrógeno.

28. PRIMEROS AUXILIOS:
Ojos Lavar el ojo con abundante agua.
Obtenga atención médica si el dolor o
enrojecimiento persisten.
Piel Lave la piel con agua y jabón.
Ingestión Lave la boca con agua. Haga que la
persona afectada beba 1-3 vasos
de agua para diluir lo digerido.
Inhalación Retire de la exposición. Si no se siente
bien consulte a un médico.

29. MEDIO MIO:

30. MEDIO MIO
Medio usado para la identificación de
Enterobacteriaceae en base a su
movilidad, actividad de ornitina
decarboxilasa y producción de indol.

31. PREPARACIÓN:
Formula(en gramos por Suspender 31g del
litro): polvo en un litro de
Dextrosa 1.0 agua destilada.
Extracto de levadura 3.0 Calentar a ebullicion
Peptona 10.0 hasta completa
Tripteina 10.0 disolucion. Distribuir
Clorhidrato de L-ornitina 5.0 en tubos y esterilizar 15
Agarm2.0 minutos a 121 C
Purpura de bromocresol 0.02
pH final: 6.5 0.2

32. CARACTERÍSTICAS:
• Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo
debido a la presencia de extracto de
levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína
aporta grandes cantidades de triptófano, sustrato de
la enzima triptofanasa, para la realización de la
prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de
carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para
la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el
púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que
en medio alcalino es de color púrpura y en medio
ácido es amarillo. Por su composición, es posible
detectar 3 reacciones en un mismo tubo:
movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e
indol.

33. • La movilidad se demuestra por un
enturbiamiento del medio o por crecimiento
que difunde mas allá de la línea de
inoculación
• La reacción positiva a la ornitina está dada
por un color púrpura del medio. Debido a la
fermentación de la glucosa se reduce el pH
produciendo una condición ácida y
originando que el indicador de pH púrpura
de bromocresolvire al amarillo
• El indol, es producido a partir del triptofano
por los microorganismos que contienen la
enzima triptofanasa

34. RESULTADOS
1-Movilidad:
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá
de lalínea de siembra.-Resultado negativo: crecimiento
solamente en la línea de siembra.
2-Ornitina decarboxilasa:
-Resultado positivo: color púrpura.-Resultado negativo: color
amarillo. A veces se puede desarrollar un colorvioláceo en la
superficie del medio.
3-Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la
movilidad yla prueba de ornitina.-Resultado positivo: color
rojo al agregar el reactivo revelador.-Resultado negativo: el
color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.
Características del medio
Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente
opalescente

35. MEDIO SIM

36. MEDIO SIM:
• Este medio se utiliza para comprobar la
motilidad, la formación de H2S y la
producción de indol por parte de la bacteria.
• Prueba: Aminoácidos, enzimas y proteínas.
• 1.Determinar si la bacteria a través de
Triptofanasas puede degradar el Triptófano a
indol.
• 2. Determinar si hay producción de H2S a
partir de aminoácidos azufrados
• 3. Determinar si la bacteria es móvil.

37. PREPARACIÓN:
Medir 100ml de agua destilada en un matraz
Erlenmeyer y agregar 3g del medio. Tapar el
matraz con algodón envuelto en gasa y dejar
reposar de 10 a 15min.
Calentar agitando hasta su punto d ebullición y
dejar enfriar.
Distribuir 4ml del medio en un tubo de ensaye
y esterilizar en autoclave a 121° durante 15
minutos.
Dejar que el medio se solidifique en posición
vertical.

38. SIEMBRA:
A partir de un cultivo de 18 a 24 horas en medio
sólido, sembrar por punción profunda con aguja de
inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe
inocular el centro del tubo, y la punción debe
abarcar 2 tercios de profundidad del medio de
cultivo desde la superficie. Es importante que la
siembra se realice en línea recta.
Se incuba en un periodo de 24 horas a una
temperatura de 37°.
Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de
reactivo de Kovac´s o de Erlich.

39. MOTILIDAD
La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez
difusa del medio de cultivo alrededor del canal de
la picadura. La no motilidad se caracteriza por el
crecimiento producido exclusivamente a lo largo
de la línea de inoculación.

40. La producción de H2S se reconoce por el
ennegrecimiento de la zona de crecimiento o
del medio debido a la presencia del tiosulfato
sódico.

41. Para la demostración del indol se usa el reactivo de
Kovacs. Las cepas indol positivas: desarrollan un
color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o
de Erlich. Las cepas indol negativas no tienen
cambio de color.

42. Microorganismo Movilidad Indol Producción de
ácido sulfhídrico
E. coli ATCC 25922 + + -
K. pneumoniae ATCC - - -
700603
P. mirabilis ATCC + - +
43071
S. typhimurium ATCC + - +
14028
S. enteritidis ATCC + - +
13076
S. flexneri ATCC - - -
12022

43. CALDO DE UREA:

44. USO:
• Se emplea para la diferenciación de bacterias
por medio de la utilización de la urea como
única fuente de carbono.
• Se utiliza solamente para la detección de la
actividad de la ureasa en especies del género
Proteus que dan la prueba positiva después
de una incubación de 8 h. Si los nutrientes
suministrados por el extracto de levadura se
consumen antes de que la bacteria muestre
un crecimiento aceptable no podrá
determinarse con exactitud su capacidad de
hidrolizar la urea.

45. • Si un microorganismo es capaz de
hidrolizar la urea, pero no de utilizar el
amoníaco como fuente de nitrógeno, no se
produce crecimiento y es posible observar
un resultado falso negativo. No se
recomienda para las bacterias con reacción
de ureasa retardada.
• Sembrar el medio de cultivo con el cultivo
puro de ensayo. Incubar 24 – 48 h a 35ºC.

46. PREPARACIÓN:
• Rehidratar 3.87 g del medio en 100 ml de
agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos.
Cuando se ha disuelto, esterilizar por
filtración. Distribuir en tubos de ensayo en
volúmenes de 0.5 a 2 ml. Es posible usar
cantidades mayores, pero las reacciones son
más lentas. Se puede esterilizar en autoclave
de 5 a 8 libras de presión durante 15 minutos.
• ES IMPORTANTE PROTEGERLO DE LA
LUZ. Conservar en refrigeración de 2º a 8º C.

47. CARACTERÍSTICAS
• Color: Rosado
• Inhibidor: No tiene
• Indicador: Rojo de Fenol
• Sustrato Principal: Urea
• Sustrato Secundario: Extracto de levaduras,
fosfato monopotasico y fosfato disódico.
• No se autoclava

50. TINCIÓN DE ZIEHL-
NEELSEN (BAAR).
La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una
técnica de tinción diferencial rápida y
económica, para la identificación de
microorganismos patógenos, por ejemplo M.
tuberculosis.

51. PROCEDIMIENTO:
•Preparación del frotis
•Extensión de la muestra

52. •Fijación.
•Carbol fucsina

53. •Calentar hasta la emisión de vapor
(Mantener el calor 10 minutos, evitar la ebullición y luego dejar enfriar).
•Lavar con agua

54. •Decoloración con alcohol ácido
(Máximo 3 minutos y posteriormente lavar)
Tinción de contraste: azul de metileno
(1 Minuto)

55. •Enjuagar.
•Secar

56. Resultado

57. TINCIÓN DE GRAM:
Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfología celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximación a la
diferenciación bacteriana,
considerándose Bacteria Gram positiva a las
bacterias que se visualizan de color moradas
y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan
de color rosa o rojo o grosella.

59. TINCIÓN SIMPLE:
Es una tinción sencilla en la cual la bacteria
es teñida con un solo reactivo. Es preferible
utilizar tintes básicos que contengan un
cromógeno (compuesto que da color al tinte)
con carga positiva, ya que la pared celular de
las bacterias posee componentes con carga
negativa que atraen y enlazan el cromógeno.
Esta tinción se utiliza para observar la
morfología y el crecimiento de las bacterias.

60. PROCEDIMIENTO