M2R - ECM 2009

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222000000888---222000000999
Distinction isomérique et quantification de
monosaccharides par la méthode cinétique
Thierry FOUQUET
21 septembre 2009
Laboratoire Chimie Provence
Spectrométries Appliquées à la Chimie Structurale
Responsable du stage : Laurence CHARLES

A
Résumé
L'analyse isomérique quantitative de trois monosaccharides (D-fructose, D-galactose, D-
glucose), basée sur la dissociation de complexes trimériques simplement chargés formés par
electrospray, a été réalisée selon la méthode cinétique. Divers acides aminés L et cations
métalliques divalents ont été testés afin de choisir les meilleurs systèmes pour la distinction
isomérique et la quantification en mélange. Une forte discrimination est observée pour de nombreux
systèmes, dont le couple serine/Cu2+
et acide aspartique/Mn2+
, qui a été sélectionné pour l'analyse
quantitative. Des effets de compétition pour la formation/ionisation des complexes ont été mis en
évidence, mais une correction par des calibrations trois points assure la justesse et la répétabilité de
la quantification en mélange binaire et ternaire.
Abstract
Quantitative isomeric analysis of D-fructose, D-galactose and D-glucose was achieved using
collision-induced dissociation of electrosprayed trimeric ions with data analysis by the kinetic
method. Several L-amino acids and divalent metal cations were tested to select the best systems for
isomeric distinction and quantitation of each monosaccharide. Very high distinction could be
achieved for most tested systems amongst which serine/Cu2+
and aspartic acid/Mn2+
were selected
for quantitative analysis. Accurate quantitative results were obtained for each analyte in binary and
ternary mixtures using three-point corrected calibration curves, which account for the competition
effects evidenced to occur between sugars for the formation of the trimeric complexes.

B
Préambule
Ce rapport sera sans aucun doute mon dernier écrit à caractère scolaire, tout au moins dont la
portée n’excède pas le seul appât du gain pour une note honorable. Même si la forme et le fond
n’imitent en rien les autres rapports que j’ai pu rédiger jusqu’ici. C’est avec un certain
contentement, et une émotion certaine que je considère cet aboutissement aujourd’hui, et j’invite le
noble lecteur à prendre la mesure de cette charge émotionnelle à travers ces quelques lignes, car elle
ne transparaîtra fort heureusement plus dans le texte.
Que l’on rassure les correcteurs, la fantaisie de cette première personne ne se prolonge que dans
les remerciements ci-après, et laisse place au sérieux le plus absolu pour le reste du document. N’en
déplaise aux autres lecteurs.
Marseille, le 2 septembre 2009.
Remerciements
Mes premiers remerciements vont de toute évidence à Laurence Charles, pour la confiance
accordée en me permettant de réaliser mon stage de fin d’étude dans son laboratoire, ainsi que pour
l’aide précieuse apportée pour les divers travaux réalisés.
Je remercie également le Spectropôle (comme le veut la formule consacrée et usitée assez
largement) pour l’accès privilégié aux instruments. Quitte à choquer l’humaniste, j’adresse une
pensée émue à la QTrap 3200 Applied Biosystems avant que de finir les remerciements envers les
gens, mais j’aurai passé plus de temps en sa bruyante et fraîche compagnie qu’avec quiconque
certains jours heureux. Montaigne me le pardonne, je saluerai aussi le QToF, dont je n’ai
qu’effleuré l’utilisation. Mais enfin, boucher les deux instruments, deux capillaires, briser une
seringue Hamilton et faire du caramel – le tout en six mois – sans citer ces machines serait un
manque flagrant de respect, même envers un spectromètre de masse.
Et sans m’étendre davantage pour ne pas détourner le rare lecteur du but premier de ce
manuscrit, je remercie chaleureusement et d’une traite toutes les bonnes âmes du laboratoire que je
côtoie chaque jour. Eux-mêmes ne liront pas ce texte, mais si par pure fantaisie au détour d’une
pause café sans conversation, l’un d’eux venait à poser ses yeux sur cette page, je sais qu’il sera
assez modeste pour ne pas s’offusquer de l’absence de son nom.

1
Sommaire
Table des illustrations et des tableaux....................................................................... 2
Introduction ................................................................................................................. 3
Principes de la méthode cinétique.............................................................................. 5
Méthode cinétique pour la thermochimie.........................................................................................5
Méthode cinétique pour la distinction chirale..................................................................................7
Méthode cinétique pour la distinction isomérique ...........................................................................9
Résultats et discussion...............................................................................................11
Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique ..............................................................11
Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique : variante en ligand fixe .......................16
Quantification en mélange..............................................................................................................18
DĠůĂŶŐĞ ďŝŶĂŝƌĞ͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘ ϭϴ
DĠůĂŶŐĞ ƚĞƌŶĂŝƌĞ͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘ Ϯϰ
Conclusion..................................................................................................................26
Références bibliographiques ....................................................................................27

2
Table des illustrations et des tableaux
Figures :
Figure 1 : Structure cyclique à six chaînons (pyranose) des trois monosaccharides étudiés.
Figure 2 : Spectres ESI-MS/MS des deux clusters trimériques [M(réf)2(A)-H]+
avec le système
Cu/Pro, pour la distinction énantiomérique des acides aminés L et D-Tyrosine.
Figure 3 : Spectres ESI/MS-MS des trois clusters [M(réf)2(A)-H]+
des sucres étudiés pour le
système Cu/Ser.
Figure 4 : Comparaison des spectres ESI-MS/MS des clusters trimériques [Fe(Asn)(Thr)(sucre)-H]+
et [Fe(Thr)2(sucre)-H]+
quant à la fragmentation secondaire.
Figure 5 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction molaire
liquide Ƚ୧
୪
d’un des sucres.
Figure 6 : Abondance ionique du cluster trimérique [Cu(Ser)2(fru)-H]+
en fonction de la
concentration en D-fructose, pour différentes concentrations en D-glucose (13
C1)
exprimées en mM.
Figure 7 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction molaire
liquide Ƚ୧
୪
d’un des analytes.
Tableaux :
Tableau 1 : Acides aminés L utilisés comme références dans le cluster trimérique [M(réf)2(A)-H]+
.
Tableau 2 : Récapitulatif des comportements observés pour une série de références et de métaux en
ESI-MS.
Tableau 3 : Récapitulatif des systèmes potentiellement discriminants pour les trois sucres.
Tableau 4 : Résultats de quantification des fractions molaires en mélange binaire, par une
calibration deux points (standard) et trois points (corrigé) pour les trois
monosaccharides étudiés.
Tableau 5 : Résultats de quantification obtenus pour les mélanges ternaires I, II et III, par la
méthode cinétique corrigée.

3
Introduction
Les sucres constituent la classe la plus riche et la plus complexe de la grande famille des
biomolécules, et leurs rôles variés concernent de nombreux domaines, du transport et stockage de
l’énergie dans le métabolisme des êtres vivants à la reconnaissance cellulaire, en passant par la
structuration de tissus végétaux [1-3]. Leur capacité générale à former avec des métaux de
transitions des complexes polydentates, propriété largement utilisée dans la suite de ce travail, les
rend particulièrement utiles pour le transport de métaux ou de complexes métalliques à travers la
membrane cellulaire [4]. Certains sucres peuvent également être utilisés comme vecteur ou comme
base pour un principe actif, tel que l’acide shikimique (base de fabrication du Tamiflu, antiviral
utilisé dans le traitement de certaines souches de la grippe) ou l’héparine (anticoagulant puissant).
Ces propriétés parmi d’autres motivent la mise en place de techniques d’identification et de
quantification de sucres natifs isomères ou énantiomères, dont les monosaccharides qui constituent
les molécules de base des sucres complexes, en particulier les hexoses et pentoses, formes les plus
représentées.
Les techniques de Résonance Magnétique Nucléaire sont irremplaçables pour la détermination
structurale des saccharides, des équilibres forme ouverte/forme cyclique et anomériques mais sont
rapidement limitées par la complexité des signaux obtenus en mélange. Les méthodes
chromatographiques sont quant à elle très efficaces pour séparer des sucres isomères [5,6] ou
énantiomères [7] mais sont longues à mettre en œuvre.
En revanche, la spectrométrie de masse peut distinguer et/ou quantifier avec succès des sucres en
mélange. La discrimination purement qualitative de pentoses et d’hexoses par comparaison du
profil de fragmentation induite par collision (CID) d’adduits métalliques [8,9], azotés [10,11] ou
plus complexes [12] est une méthode déjà largement utilisée, mais la quantification d’isomères en
mélange binaire ou ternaire nécessite la comparaison de l’abondance de plusieurs ions fragments
dans le spectre MS/MS couplée à un développement d’algèbre matricielle [13]. Une autre méthode,
basée sur des réactions ion/molécule en phase gazeuse, permet de distinguer des composés
énantiomères en comparant la cinétique d’échange d’un ligand entre un adduit chiral et un gaz
neutre, qui varie avec la chiralité de l’analyte inclus dans l’adduit [14]. Toutes ces opérations
peuvent être effectuées grâce à la méthode cinétique développée par Cooks [15] et déclinée sous de
nombreuses formes. Cette méthode, dont les bases sont développées dans la première partie de ce

travail, permet de distinguer et quantifier des composés énantiomèr
l’étude des cinétiques de fragmentation de complexe
d’un ion central, d’une molécule de référence
succès à la distinction et quantification
la distinction isomérique et quantification
pour la distinction isomérique de monosaccharides.
donc une nouvelle application de la méthode cinétiq
en mélange binaire et ternaire de monosaccharides isom
galactose (Figure 1).
Figure 1 : Structure cyclique à six chaî
Les objectifs de cette étude sont dans un
discriminant les trois monosaccharides,
sucres en mélange binaire et ternaire
possible.
de distinguer et quantifier des composés énantiomères ou isomères en mélange
l’étude des cinétiques de fragmentation de complexes dimériques [16] ou trimériques,
central, d’une molécule de référence et d’un des analytes considérés
et quantification chirale d’acides aminés [17] et de sucres [
t quantification de peptides [20], la méthode cinétique a été évaluée ici
pour la distinction isomérique de monosaccharides. Le travail présenté dans ce rapport démontre
donc une nouvelle application de la méthode cinétique permettant la distinction et la quantification
mélange binaire et ternaire de monosaccharides isomères, le D-glucose,
tructure cyclique à six chaînons (pyranose) des trois monosaccharides étudiés
Les objectifs de cette étude sont dans un premier temps d’obtenir un en
les trois monosaccharides, puis de tester ces systèmes pour quantifier ces mêmes
sucres en mélange binaire et ternaire, dans une gamme de fractions molaires
Introduction 4
es ou isomères en mélange par
] ou trimériques, composés
et d’un des analytes considérés. Déjà appliquée avec
sucres [18,19], ainsi qu’à
la méthode cinétique a été évaluée ici
Le travail présenté dans ce rapport démontre
la distinction et la quantification
glucose, le D-fructose et le D-
nons (pyranose) des trois monosaccharides étudiés.
premier temps d’obtenir un ensemble de systèmes
ces systèmes pour quantifier ces mêmes
de fractions molaires aussi large que

5
Principes de la méthode cinétique
Méthode cinétique pour la thermochimie
La méthode cinétique standard développée par Cooks [15] dans les années 1970 est une méthode
approchée pour la détermination de propriétés thermochimiques, basée sur la mesure des cinétiques
de dissociation compétitive d’un ion cluster. Dans sa forme première, le cluster simplement chargé
est formé d’un ion central monovalent (noté C) coordinant une molécule de référence (notée réf)
dont on connait une propriété thermochimique, et l’analyte considéré (noté A) pour qui ladite
propriété thermochimique est inconnue. La fragmentation de ce cluster est supposée limitée aux
pertes compétitives de la référence et de l’analyte. Dans le cadre d’une expérience ESI-MS/MS, où
le cluster est soumis à dissociation induite par collision, ce processus peut être décrit comme suit :
Ϊ
ǡ ”±ˆ
”±ˆ ǦǦǦ Ϊ
ǦǦǦ

ͳ
ʹ ”±ˆ ǦǦǦ Ϊ
ǦǦǦ Ϊ
φ ‰ƒœ
(1)
Les constantes de vitesse de dissociation k1 et k2 reflètent l’affinité de l’analyte et de la référence
pour le cation central C, l’intérêt du spectre MS/MS tenant du fait que ces constantes peuvent être
imagées par l’abondance des ions fragments associés, soit :
ଵ
ଶ
؆
ሾ െ ାሿ
ሾ”pˆ െ ାሿ
(2)
Un développement thermodynamique approché [21] permet d’écrire :
ο‫ܩ‬ș
ൌ െܴீ௉ ȉ ܶ ‫ڄ‬ ݈݊ሺ݇ሻ (3)
où RGP est la constante des gaz parfaits, T la température et ο‫ܩ‬ș
l’énergie libre d’activation.
Soit dans le cas de deux cinétiques de dissociation, à partir de l’équation (3) :
݈݊ ൬
݇ଵ
݇ଶ
൰ ൌ
ο‫ܩ‬ଵ
ș
െ ο‫ܩ‬ଵ
ș
ܴீ௉ ȉ ܶ
ൌ
οο‫ܩ‬ș
ܴீ௉ ȉ ܶ
(4)
En supposant qu’il n’existe pas de barrière d’activation (οο‫ܩ‬ș
ൌ οο‫)ܩ‬ et que les phénomènes
entropiques sont négligés (cf. plus bas), on obtient :
݈݊ ൬
݇ଵ
݇ଶ
൰ ൌ
οο‫ܪ‬
ܴ ȉ ܶ
՜ ݈݊ ൬
݇ଵ
݇ଶ
൰ ൌ
οο‫ܪ‬
ܴ ȉ ܶ௘௙௙
(5)

Méthode cinétique pour la thermochimie 6
La température effective (notée Teff), insérée ici artificiellement pour contourner le fait que les
clusters en phase gazeuse sont des espèces isolées, donc ne sont en équilibre thermodynamique à
aucune température [22], peut trouver un sens plus fondamental en la considérant comme l’énergie
interne d’une population de clusters activés, homogène à une température [23-26], et une origine
plus formelle en utilisant le formalisme de la physique statistique pour obtenir les équations
précédentes, réalisé par Ervin [22] dans le cas microcanonique.
Prenons pour exemple de propriété thermochimique à déterminer pour un analyte A l’affinité
ionique AI pour un ion C+
, que l’on définit comme l’enthalpie de la réaction suivante :
‫ܥܣ‬ା
՜ ‫ܣ‬ ൅ ‫ܥ‬ା
(a)
‫ܫܣ‬ሺ‫ܣ‬ሻ ൌ ο‫ܪ‬௥ሺࢇሻ ൌ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܣ‬ሻ ൅ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥ‬ାሻ െ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥܣ‬ାሻ
(6)
On définit de la même façon l’affinité ionique d’une référence pour l’ion C+
:
‫ܥ݂±ݎ‬ା
՜ ‫݂±ݎ‬ ൅ ‫ܥ‬ା
(b)
‫ܫܣ‬ሺ‫݂±ݎ‬ሻ ൌ ο‫ܪ‬௥ሺ࢈ሻ ൌ ο‫ܪ‬௙ሺ‫݂±ݎ‬ሻ ൅ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥ‬ାሻ െ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥ݂±ݎ‬ାሻ
(7)
Le logarithme népérien du rapport des constantes de vitesses k1 et k2 peut s’écrire :
݈݊ ൬
݇ଵ
݇ଶ
൰ ൌ
οο‫ܪ‬
ܴீ௉ ȉ ܶ௘௙௙
ൌ
ο‫ܪ‬௥ሺͳሻ െ ο‫ܪ‬௥ሺʹሻ
ൌ
ൣο‫ܪ‬௙ሺ‫݂±ݎ‬ሻ ൅ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥܣ‬ାሻ൧ െ ൣο‫ܪ‬௙ሺ‫ܣ‬ሻ ൅ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥ݂±ݎ‬ାሻ൧
(8)
L’expression (8) peut se réécrire en terme d’affinité ionique d’après les équations (6) et (7) :
݈݊ ൬
݇ଵ
݇ଶ
൰ ൌ
‫ܫܣ‬ሺ‫݂±ݎ‬ሻ െ ‫ܫܣ‬ሺ‫ܣ‬ሻ
(9)
Si l’affinité ionique du composé de référence est connue, et si l’on dispose d’une série de références
d’affinité ionique AI(réf) distinctes, le tracé du logarithme népérien du rapport des constantes de
vitesse mesuré pour chaque mélange analyte/référence en fonction de ces même affinités ioniques
AI(réf) apporte l’affinité ionique inconnue AI(A) de l’analyte A (en tant qu’ordonnée à l’origine).
Il est à noter que la non-implication des phénomènes entropiques, argumentée par l’absence de
réarrangement pré-dissociatif et d’isomères du cluster, est une approximation simple et assurément
simpliste du problème. Des exemples de non linéarité et d’erreurs conséquentes dans la
détermination de propriétés thermochimiques lui ont d’ailleurs été attribués [27] (ainsi qu’à la
mesure de la température effective), et des premiers pas dans la modélisation des clusters ont

Méthode cinétique pour la thermochimie 7
pointé l’existence d’isomères des clusters et de réarrangements pré et post-dissociation. D’autres
versions de la méthode cinétique (isentropique, étendue) ont d’ailleurs été développées pour tenter
d’inclure l’entropie dans le traitement des données [27-30], malgré les doutes de certains auteurs
quant à leur réelle faisabilité et justesse [31-33].
Méthode cinétique pour la distinction chirale
La méthode cinétique appliquée à la reconnaissance chirale fait bien évidemment appel au même
formalisme que la méthode cinétique standard. Dans ce cas, le cluster utilisé est un complexe
trimérique simplement chargé, composé d’un ion central (noté M), le plus souvent un métal de
transition divalent coordinant deux molécules de référence (notées réf) et l’analyte chiral (noté A),
cluster que l’on notera par la suite [M(réf)2(A)-H]+
.
Le principe, similaire à celui de la chromatographie chirale [34], consiste à créer un
environnement asymétrique susceptible de discriminer deux molécules énantiomères par la
différence d’interactions que leur conformation propre impose. Ici, l’ion central crée cet
environnement asymétrique en imposant une proximité entre les molécules de référence, chirales
elles aussi, et l’analyte. Des interactions analyte/référence, analyte/métal et référence/métal sont
ainsi établies et seront, si le système est bien choisi, de force ou de nature différentes selon
l’énantiomère considéré. La fragmentation de ce cluster conduit (dans des conditions appropriées)
aux seules pertes compétitives d’une molécule de référence et de l’analyte. Les constantes de
vitesse associées, imagées par les abondances des ions fragments (notés [M(réf)(A)-H]+
et [M(réf)2-
H]+
) dans le spectre MS/MS, seront fonction de la stabilité de ces mêmes ions fragments, qui
dépend des interactions précitées et donc de l’énantiomère lui-même.
Si l’on note Ai un des énantiomères de l’analyte A, le schéma global de fragmentation s’écrit :
‹
ʹΪ
ǡ ”±ˆ

ͳ
ʹ
Ǧ
Ϊ
”±ˆ ʹΪ
”±ˆ
‹
Ϊ
”±ˆ ʹΪ
‹ Ǧ
”±ˆ ʹΪ ”±ˆ
Ϊ
Ǧ
(10)

La mesure de l’abondance d’un des ions fragments re
caractéristique d’un énantiomère pour un système
Par analogie avec le développement thermodynamique effe
on peut relier ce ratio Ri à la variation d’enthalp
Si l’on note Aj un énantiomère de Ai, son ratio Rj s’écrira de la même façon
Figure 2 : Spectres ESI-MS/MS des deux
la distinction énantiomérique des acides aminés L et D
On observe bien sur les spectres MS/MS
relative de l’ion fragment m/z 358
fragment m/z 292 issu de la perte de l
Méthode cinétique pour la distinction chirale
La mesure de l’abondance d’un des ions fragments relativement à l’autre définit un ratio, noté R,
caractéristique d’un énantiomère pour un système M/réf donné. On écrit Ri pour l’énantiomère i
analogie avec le développement thermodynamique effectué dans la méthode cinétique standard,
on peut relier ce ratio Ri à la variation d’enthalpie :
de Ai, son ratio Rj s’écrira de la même façon :
MS/MS des deux clusters trimériques [M(réf)2(A)-H]+
avec le système Cu/Pro
énantiomérique des acides aminés L et D-Tyrosine [45]
On observe bien sur les spectres MS/MS, selon l’énantiomère choisi, la différence d’abondance
358 issu de la perte de l’analyte (L- ou D-Tyr
issu de la perte de la référence (L-Pro) qui induit une forte différence de ratio R.
Méthode cinétique pour la distinction chirale 8
lativement à l’autre définit un ratio, noté R,
pour l’énantiomère i :
(11)
ctué dans la méthode cinétique standard,
(12)
(13)
le système Cu/Pro, pour
[45].
la différence d’abondance
Tyr) par rapport à l’ion
différence de ratio R.

Méthode cinétique pour la distinction chirale 9
C’est ensuite le rapport des deux ratios R mesurés pour chacun des énantiomères, noté Rchiral, qui
détermine la qualité du système pour la discrimination énantiomérique, qui est d’autant plus grande
que ce ratio s’éloigne de l’unité.
ܴ௖௛௜௥௔௟ ൌ
ܴ௜
ܴ௝
(14)
L’intérêt de la méthode cinétique à ce niveau concerne sa capacité à quantifier les énantiomères en
mélange. La mesure du ratio R en mélange sera une combinaison des deux ratios des analytes
chiraux i et j pris séparément, puisque les clusters formés pourront contenir chacun l’un ou l’autre
des énantiomères, et par conséquent se fragmenteront selon la cinétique décrite par Ri ou Rj
respectivement.
Les cinétiques de dissociation observées en mélange sont alors une combinaison linéaire des
enthalpies de réaction de chaque analyte, soit :
݈݊ሺܴሻ ൌ ݈݊ ቆ
ሾ‫ܯ‬ሺ‫݂±ݎ‬ሻ൫‫ܣ‬௜ǡ௝൯ െ ‫ܪ‬ሿା
ሾ‫ܯ‬ሺ‫݂±ݎ‬ሻଶ െ ‫ܪ‬ሿା
ቇ ൌ
ܽ ȉ οο‫ܪ‬௜ ൅ ሺͳ െ ߙሻ ȉ οο‫ܪ‬௝
(15)
où α est la fraction molaire de l’analyte i en mélange i/j
Ce qui se réécrit, en terme de ratio, comme une combinaison linaire semi-logarithmique :
࢒࢔ሺࡾሻ ൌ ࢻ ȉ ࢒࢔ሺࡾ࢏ሻ ൅ ሺ૚ െ ࢻሻ ȉ ࢒࢔൫ࡾ࢐൯ (16)
La mesure du ratio R, rapport des abondances des deux ions fragments dans le spectre
MS/MS fournit ainsi la fraction molaire (soit l’excès énantiomérique) des deux énantiomères
en mélange puisque les ratios des deux analytes pris séparément sont connus.
D’après Cooks [18], cette dépendance linéaire permet l’utilisation d’une calibration à deux points,
à ߙ௜ ൌ Ͳ ݁‫ݐ‬ ߙ௜ ൌ ͳ (soit la mesure des ratios pour chaque analyte pur), pour caractériser le système.
Méthode cinétique pour la distinction isomérique
Ce même principe de séparation par un environnement chiral, créé ici par la coordination de
deux molécules chirales de référence autour d’un ion métallique divalent, peut être utilisé de façon
tout à fait remarquable pour la distinction d’isomères, comme ce fut réalisé avec succès pour la
distinction isomérique de peptides [20]. Il n’y a bien évidemment qu’une seule évolution de

Méthode cinétique pour la distinction isomérique 10
terminologie par rapport à la méthode cinétique appliquée à la distinction chirale, les principes et
développements étant rigoureusement les mêmes. Riso remplacera Rchiral pour l’évaluation de la
qualité discriminante d’un système M/réf. Le raisonnement peut alors être étendu à un nombre N de
composés isomères, à la condition que l’on dispose de N-1 systèmes M/réf discriminants pour les N
analytes.
La mesure des N-1 ratios en mélange, connaissant le ratio de chaque analyte pris séparément
pour chacun des N-1 systèmes, apporte les N fractions molaires par la résolution d’un système à N-
1 inconnues (le nombre N d’analyte et leur nature étant déjà supposés connus).
ܰ ±‫ݏ݊݋݅ݐܽݑݍ‬
‫ە‬
ۖ
ۖ
ۖ
‫۔‬
ۖ
ۖ
ۖ
‫ۓ‬
ܰ െ ͳ ‫ݏ݁݉°ݐݏݕݏ‬ ൌ ܰ െ ͳ ±‫ݏ݊݋݅ݐܽݑݍ‬
‫ە‬
ۖ
‫۔‬
ۖ
‫ۓ‬
݈݊൫ܴெǡ௥±௙
൯ ൌ ෍ ߙ௜ ȉ ݈݊൫ܴ௜
ெǡ௥±௙
൯
ே
௜ୀଵ
ǥ
෍ ߙ௜ ൌ ͳ
ே
௜ୀଵ
ሺܰ ݈ܽ݊ܽ‫ݏ݁ݐݕ‬ ݁݊ ݉±݈ܽ݊݃݁ሻ

11
Résultats et discussion
Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique
La première partie du travail concerne bien évidemment la recherche systématique de systèmes
discriminants pour les trois monosaccharides étudiés, D-glucose, D-galactose et D-fructose. De
nombreuses études précédentes, pour l’application de la méthode cinétique à diverses classes de
composés chiraux (acides alpha-hydroxylés, acides aminés, sucres, …) [20,35-38] ont permis de
sélectionner une gamme d’ions centraux et de références possiblement adaptés à notre recherche. Il
n’existe pas en effet de règle bien définie quant à l’adéquation métal/référence/analyte et seules
quelques pistes et constatations empiriques peuvent guider ce choix. L’ion central est ainsi le plus
souvent un métal de transition divalent, Mn2+
, Fe2+
, Co2+
, Cu2+
et Zn2+
[39] (la littérature présente
également l’utilisation de Ni2+
[40], mais les résultats médiocres obtenus avec ce métal ne seront
pas présentés ici). Le calcium Ca2+
est également très utilisé [41,42], puisqu’il permet comme les
ions précédents de coordiner l’ensemble référence/analyte, bien qu’il n’appartienne pas à la classe
des métaux de transition.
Le choix de l’ion central arrêté, une sélection de références potentielles doit être effectuée, en
essayant de suivre quelques « règles » tout à fait empiriques :
ƒ Référence et analyte doivent avoir une affinité ionique similaire pour l’ion central (dans
notre cas une affinité métallique) [40]. Comme ces données sont le plus souvent inconnues (la
méthode cinétique pourrait dans le même temps permettre de déterminer ces affinités [43],
mais l’absence de toute donnée de référence n’a pas permis ce travail), on peut se référer à
l’affinité protonique comme approximation de l’affinité ionique même si cette analogie n’est
pas rigoureuse [44].
ƒ Une analogie structurale et fonctionnelle entre la référence et l’analyte est souhaitable [45],
qui limite alors la variation d’entropie lors de la fragmentation (réarrangement pré et post-
dissociation), variation considérée comme nulle dans la méthode cinétique standard présentée,
ou constante dans la variation isentropique de la méthode [26].
Le choix d’une gamme de référence s’est toutefois porté, et malgré l’importance du second critère,
sur les acides aminés, molécules largement utilisées dans ce rôle [18] et qui, si elles ne respectent la
similarité structurale avec les sucres étudiés, peuvent présenter des fonctions chimiques semblables
ou similaires.

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique 12
C’est le cas de sept des huit acides aminés choisis :
ƒ Sérine (Ser) et Thréonine (Thr) pour les fonctions alcools,
ƒ Acide aspartique (Asp) et Acide glutamique (Glu) pour les groupes carboxyles (présents
chez les monosaccharides en forme acyclique),
ƒ Asparagine (Asn), Glutamine (Gln) et Arginine (Arg) pour les fonctions amides ou amines.
Le huitième acide aminé, la Phénylalanine (Phe), a été considéré pour sa capacité éventuelle à
former des interactions « sucre – composé aromatique » décrites dans la littérature [46,47].
Tableau 1 : Acides aminés L utilisés comme références dans le cluster trimérique [M(réf)2(A)-H]+
.
NH2
H
OH
O
OH
Ǧ±”‹‡ ȋǦ‡”Ȍ
NH2
H
OH
O
OH
ǦŠ”±‘‹‡ ȋǦŠ”Ȍ
NH2
H
C
O
OH
OH
O
…‹†‡ Ǧƒ•’ƒ”–‹“—‡ ȋǦ •’Ȍ
NH2
H
O
OH
C
OHO
…‹†‡ Ǧ‰Ž—–ƒ‹“—‡ ȋǦ
Ž—Ȍ
NH2
H
O
OH
ǦŠ±›ŽƒŽƒ‹‡ ȋǦŠ‡Ȍ
NH2
H
C
O
OH
NH2
O
Ǧ •’ƒ”ƒ‰‹‡ ȋǦ •Ȍ
NH2
H
O
OH
C
NH2O
Ǧ
Ž—–ƒ‹‡ ȋǦ
ŽȌ
NH2
H
O
OH
NH
C
NH2NH
Ǧ ”‰‹‹‡ ȋǦ ”‰Ȍ
Nota :
Les références utilisées sont des molécules chirales. Les formes L et D de chaque acide aminé ont été utilisées pour la
recherche systématique des systèmes M/réf discriminants. Les résultats étant remarquablement semblables entre les
deux formes, en termes de capacité à former le cluster trimérique et de ratio R, seuls ceux associés aux formes L des
références sont présentés.
Une dernière molécule de référence, choisie quant à elle pour sa grande proximité structurale et
fonctionnelle avec les trois isomères est le D-fucose, soit le D-déoxygalactose. L’utilisation des
références structurellement les plus proches des analytes, soit lesdits analytes marqués

isotopiquement (le carbone C1 devient un carbone 13, soit un décalage de masse de +1 en MS et
MS/MS) constitue une perspective à cette étude mais augmente substantiellement le coût de
l’analyse.
La recherche des systèmes M/réf discriminants à partir des métaux de transition et acides aminés
sélectionnés s’articule autour de deux points :
ƒ La formation du cluster trimérique [M(réf)2(A)-H]+
en ESI-MS, condition sine qua non
de l’application de la méthode cinétique à la distinction isomérique ;
ƒ La fragmentation de ce cluster, qui doit permettre le calcul d’un ratio R défini
précédemment à partir des deux ions fragments, ce ratio devant enfin être caractéristique
d’un isomère.
Les résultats selon ces deux « critères » sont présentés dans les tableaux 2 et 3 :
Tableau 2 : Récapitulatif des comportements observés pour une série de références et de métaux en ESI-MS.
±–ƒŽ ȋ

Ȍ
ƒ ‡ ‘ —
”±ˆ±”‡…‡
Ǧ •’
Ǧ Š‡
Ǧ •
Ǧ ‡”
Ǧ
Ž
Ǧ Š”
Ǧ
Ž—
Ǧ ”‰
Ǧ ˆ—…‘•‡
trimère non formé
trimère formé : fragmentation
secondaire
trimère formé : - réf uniquement
trimère formé : - sucre uniquement
trimère formé : dissociations
compétitives
On notera l’absence de tendance évidente entre le numéro atomique du métal et son
comportement avec une référence donnée, justifiant a posteriori la recherche empirique de systèmes
discriminants.
Les systèmes ne permettant pas la formation du trimère ne peuvent évidemment pas être retenus
( െ ”‰ǡ ‫׊‬ ‘— െ ˆ—…‘•‡ǡ ‫׊‬ ’ƒ” ‡š‡’Ž‡ሻ. D’autres engendrent le trimère attendu
[M(réf)2(A)-H]+
mais le spectre MS/MS présente une fragmentation « secondaire » issue de l’ion
précurseur et des deux ions fragments souhaités, ce qui n’est pas acceptable dans le cadre de la
méthode cinétique, les fragmentations donnant les ions fragments [M(réf)(A)-H]+
et [M(réf)2-H]+
devant être les seules voies de dissociation du cluster trimérique [17]. D’autre part, si les ions
fragments se dissocient à leur tour, leur abondance ionique se trouvera faussée et le ratio mesuré

entaché d’une erreur dont on ne pourra garantir la répétabilité. Certains systèmes présentent une
seule voie de dissociation pour les trois monosaccharides :
ƒ La perte de référence uniquement, ce qui pour le moment tout du moins ne conduit à
rien d’exploitable en distinction ou en quantification ;
ƒ La perte de sucre uniquement, la référence devenant alors un candidat pour la variation
en ligand fixe de la méthode cinétique (voir plus bas), observée dans la grande majorité pour
les acides aminés à fonction amide, L-Asn et L-Gln.
Les systèmes permettant la formation du trimère et présentant une fragmentation compétitive entre
les deux voies de dissociation pour les trois sucres sont présentés dans le tableau 3.
Tableau 3 : Récapitulatif des systèmes potentiellement discriminants pour les trois sucres.
ȏ

±ˆ ‰ƒŽ ‰Ž… ˆ”— ‰ƒŽȀ‰Ž… ‰ƒŽȀˆ”— ‰Ž…Ȁˆ”—
ƒʹΪ
•’ ͳ͸ǡ͹ ͳǡͷͻ ͷǡͺ ͳͲǡͷ ʹǡͻ Ͳǡʹ͹
• Ͳǡͷͺͳ ͲǡͲͻͲ Ͳǡʹʹ͹ ͸ǡͷ ʹǡͷ͸ ͲǡͶͲ

Ž— ͻǡͲͻ Ͳǡͺͻ͵ ͵ǡͲ͵ ͳͲǡʹ ͵ǡͲͲ Ͳǡʹͻ
ʹΪ
•’ ʹǡ͸ʹ ͲǡͶͷ ͳǡͳͳ ͷǡͺ ʹǡ͵͸ ͲǡͶͳ
Š” ʹͶ ͳǡͻ͸ ͵ǡʹ͵ ͳʹ ͹ǡͶ Ͳǡ͸ͳ
‡ʹΪ •’ ʹǡʹ͹ ͲǡͶͳͳ ͲǡͶͷͷ ͷǡͷʹ Ͷǡͻͻ ͲǡͻͲ
‘ʹΪ Š” ͻǡʹ͸ Ͳǡ͹Ͷ͸ Ͳǡͷͷ͹ ͳʹǡͶ ͳ͸ǡ͸ ͳǡ͵Ͷ
—ʹΪ ‡” ͲǡͶʹͲ Ͳǡͳ͸ͳ ͲǡͲͶ͵ ʹǡ͸ͳ ͻǡͺ ͵ǡ͹
ʹΪ
•’ ͳǡͶ͵ Ͳǡ͵ͳ͹ Ͳǡ͵ͳʹ Ͷǡͷͳ Ͷǡͷͺ ͳǡͲʹ
Š‡ Ͷǡʹ Ͳǡͳͻʹ Ͳǡͳ͹ʹ ʹͳǡͻ ʹͶǡͶ ͳǡͳʹ
Š” Ͷǡͳ͹ Ͳǡ͵ͻʹ ͲǡͶʹ ͳͲǡ͸ ͻǡͻ Ͳǡͻ͵
(les écart-types ne sont pas indiqués par souci de clarté, le nombre de chiffres significatifs renseigne sur la précision des
mesures)
Les complexes au calcium sont tous prometteurs en termes de distinction isomérique, mais le
bouchage systématique du spectromètre lors du traitement de ces solutions a rendu leur utilisation
hasardeuse puis tout à fait indésirable. Néanmoins ces trois systèmes ne doivent pas être écartés, le
nitrate de calcium utilisé ici n’étant peut être pas adapté (produit ancien, hydraté). Les trois
systèmes Zn/réf ne discriminent pas suffisamment le D-glucose du D-fructose (Riso trop proche de
l’unité) et sont donc écartés, ainsi que le système Fe/Asp pour la même raison. Enfin, le système

Mn/Thr a été jugé susceptible d’induire de trop gra
associée au ratio obtenu pour le D
le tableau, mais le nombre de chiffres significatifs renseigne sur la précision d
Il reste donc trois systèmes aptes à quantifier les
Co/Thr et Cu/Ser. Puisque deux systèmes sont nécessaires et suffisant
isomères, seuls Cu/Ser er Mn/Asp
des Riso.
Nota : La similitude des résultats observés pour les forme
formes L et D des monosaccharides étudiés. Les systèmes discriminants les trois isomè
distinguer convenablement les énantiomères d’un mêm
Figure 3 : Spectres ESI/MS-MS des trois clusters [M(réf)
Les spectres MS/MS de la figure 3
les trois isomères étudiés. L’abondance ionique de
référence (- L-Ser) varie avec la nature du
272 issu de la perte de l’analyte (pic de base dans les
isomère.
Méthode cinétique appliquée à la distinction isomér
Mn/Thr a été jugé susceptible d’induire de trop grandes erreurs en quantification,
D-galactose (les écart-types des ratios mesurés ne figure
chiffres significatifs renseigne sur la précision de la mesure).
Il reste donc trois systèmes aptes à quantifier les trois monosaccharides en mélange, Mn/Asp,
Puisque deux systèmes sont nécessaires et suffisants pour le traitement de troi
Mn/Asp seront utilisés désormais, sélectionnés par simple
La similitude des résultats observés pour les formes L et D des références se retrouve logiquement pou
étudiés. Les systèmes discriminants les trois isomère
distinguer convenablement les énantiomères d’un même isomère.
MS des trois clusters [M(réf)2(A)-H]+
des sucres étudiés pour le système Cu/Ser
figure 3 illustrent la discrimination apportée par le systèm
les trois isomères étudiés. L’abondance ionique de l’ion fragment m/z 347
) varie avec la nature du sucre, relativement à l’abondance de l’ion fragment
issu de la perte de l’analyte (pic de base dans les trois cas) d’où un ratio R spécifique à chaque
ndes erreurs en quantification, vue l’incertitude
pes des ratios mesurés ne figurent pas dans
chiffres significatifs renseigne sur la précision de la mesure).
trois monosaccharides en mélange, Mn/Asp,
pour le traitement de trois
seront utilisés désormais, sélectionnés par simple comparaison
s L et D des références se retrouve logiquement pour les
étudiés. Les systèmes discriminants les trois isomères sont alors incapables de
des sucres étudiés pour le système Cu/Ser.
illustrent la discrimination apportée par le système Cu/Ser pour
347 issu de la perte de
sucre, relativement à l’abondance de l’ion fragment m/z
trois cas) d’où un ratio R spécifique à chaque

Remarque : Afin de rationaliser la recherche de systèmes discriminants, une approche basée sur
des calculs théoriques a été mise ne place. La modélisation des clusters trimériques et dimériques
principalement effectuée pour un système simple (Ca/Thr) s’est soldée par un arrêt des calculs. En
effet, la différence d’énergie de liaison [Ca(Thr)(A)-H]+
-- Thr et [Ca(Thr)2-H]+
-- A est de l’ordre
de 5 kcal.mol-1
, ce qui tend vers la limite de précision de la méthode. Or le système Ca/Thr présente
un comportement radical puisqu’il ne perd que la référence lors de la fragmentation. Les mêmes
calculs effectués pour des systèmes présentant des dissociations compétitives ne seraient donc pas
exploitables car fourniraient des résultats inférieurs à cette valeur déjà critique.
A noter enfin que la section Conditions expérimentales rappelle les protocoles utilisés pour
l’obtention des résultats présentés.
Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique : variante en ligand fixe
Comme son nom l’indique assez clairement, la variante en ligand fixe est une évolution de la
méthode cinétique standard appliquée à la reconnaissance chirale ou isomérique, dans laquelle l’une
des molécules de référence est remplacée par un ligand fixe, c’est-à-dire non éliminé lors des
dissociations compétitives. Ce ligand fixe est en fait le siège unique de la déprotonation (qui peut se
produire sur les trois molécules dans la méthode standard, d’où la formation d’isomères pour le
complexe trimérique) et implique une limitation des isomères du cluster ainsi que cette fixité par
rapport au métal [48].
réf*
sucre
MII
Lfixe - H
unité fixe
réf*
sucre
MII
réf*
- H
+
ligand fixe
+
(17)
La détection des références candidates au rôle de ligand fixe passe bien évidemment par
l’observation d’une perte de sucre quasi-exclusive pour tous les isomères lors de la fragmentation
du cluster trimérique incluant ce même ligand fixe. La fragmentation du cluster trimérique formé de
ce ligand, d’une autre référence non fixe et de l’analyte ne conduit alors à aucune perte de ligand
fixe. Le ligand fixe pourra par exemple exalter la discrimination isomérique, en augmentant les
interactions référence/analyte, ou limiter les problèmes entropiques par la diminution du nombre
d’isomères du clusters et des réarrangements post-fragmentation.

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomér
Dans le cas présent, l’utilisation du ligand fixe r
de situations problématiques, que
ƒ La non-formation du cluster trimérique, qui peut être liée
rigidité structurale de la référence
ƒ La trop forte fragmentation secondaire du cluster t
ƒ La faible discrimination ou l’absence de discrimina
monosaccharides ;
ou tout simplement de celle d’améliorer la discrimination déjà effective d’un s
c’est le cas dans la grande majorité des articles [48,
Cette application s’est révélée
ƒ le système Fe/Thr présente une
fixe Fe/Asn/Thr ne présente plus cette fragmentatio
discriminant pour les trois sucres
ƒ le D-fucose utilisé comme seule référence ne permet
aucun des métaux, tandis que le nouveau système Cu/Asn/D
complexe pour les trois sucres et est également dis
ƒ le système Zn/Asp a été précédemment éliminé pour s
glucose et D-fructose (
trois monosaccharides (
Figure 4 : Comparaison des spectres ESI
[Fe(Thr)2(sucre)-H]+
Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique – variante en ligand fixe
Dans le cas présent, l’utilisation du ligand fixe relève de la volonté de résolution ou d’amélioration
, que sont :
formation du cluster trimérique, qui peut être liée à une gène stérique
rigidité structurale de la référence ;
La trop forte fragmentation secondaire du cluster trimérique et des ions fragments
La faible discrimination ou l’absence de discrimination entre deux des trois
d’améliorer la discrimination déjà effective d’un système M/réf, comme
nde majorité des articles [48,49].
Cette application s’est révélée efficace dans certains cas pour les problèmes cités
le système Fe/Thr présente une fragmentation secondaire forte alors que
fixe Fe/Asn/Thr ne présente plus cette fragmentation, comme le montre la F
;
me seule référence ne permet la formation du cluster trimérique avec
le nouveau système Cu/Asn/D-fucose conduit à la formation du
complexe pour les trois sucres et est également discriminant ;
le système Zn/Asp a été précédemment éliminé pour son absence de discrimination entre D
) mais le système Zn/Asn/Asp permet la discrimination des
, , ).
omparaison des spectres ESI-MS/MS des clusters trimériques [Fe(Asn)(Thr)(sucre)
+
quant à la fragmentation secondaire (indiqué en rouge)
variante en ligand fixe 17
elève de la volonté de résolution ou d’amélioration
à une gène stérique ou une
rimérique et des ions fragments ;
tion entre deux des trois
d’améliorer la discrimination déjà effective d’un système M/réf, comme
efficace dans certains cas pour les problèmes cités :
fragmentation secondaire forte alors que le système à ligand
, comme le montre la Figure 4, et est
u cluster trimérique avec
fucose conduit à la formation du
discrimination entre D-
le système Zn/Asn/Asp permet la discrimination des
).
[Fe(Asn)(Thr)(sucre)-H]+
et
en rouge).

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique – variante en ligand fixe 18
L’observation de résultats opposés à ceux souhaités (perte de discrimination par exemple) rendent
cependant, comme la recherche de système, l’exploration hasardeuse et malheureusement
systématique.
Toutefois, pour la quantification d’isomères en mélange, l’utilisation d’un ligand fixe peut devenir
un moyen simple et rapide d’augmenter le nombre de systèmes discriminants. Ainsi, les systèmes
Co/Thr, Mn/Asp et Cu/Ser étant déjà discriminants, et les acides aminés Asn et Gln étant considérés
comme fixes pour les métaux précités, l’ensemble des systèmes (Mn, Co, Cu)/(Asn, Gln)/(Asp, Ser,
Thr) pourraient devenir 18 systèmes potentiellement discriminants, pouvant idéalement traiter 19
isomères en mélange.
Quantification en mélange
Mélange binaire
L’étape suivante et la finalité réelle du travail concerne la quantification des trois
monosaccharides isomères type en mélange par la méthode cinétique. D’après les développements
présentés, trois analytes nécessitent deux mesures de ratio dans des conditions différentes, soit deux
systèmes métal/référence [36]. Mn/Asp et Cu/Ser ont été sélectionnés pour ces mesures. D’après
Cooks et al. et comme présenté précédemment, la méthode cinétique appliquée à la reconnaissance
chirale (ou isomérique) est intrinsèquement linéaire, même si certains auteurs [50,51] (dont Cooks
[45]) ont pu observer des cas de non linéarité. C’est précisément le cas ici, puisque la mesure des
fractions molaires de deux des trois isomères en mélange (par la mesure d’un seul ratio, pour un
seul système) par l’application de la relation linéaire (16) a fourni des résultats largement biaisés
(des erreurs de plus de 40% par rapport à la fraction réelle ont été relevées). Le tracé du logarithme
népérien du ratio mesuré pour le système Cu/Ser en fonction de la fraction molaire d’un des
isomères en mélange binaire, linéaire en théorie, est présenté ci-après et illustre bien les non
linéarités observées.

Figure 5 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en f
d’un des sucres : ( ) D-galactose en mélange avec D
( ) D-galactose en mélange avec D
est représenté en ligne pointillée, les droites thé
La linéarité de la méthode cinétique étant mise en
explicites et implicites de cette méthode. En parti
l’indépendance de la formation du cluster trimériqu
isomères en mélange [52]. Pour un mélange binaire par exemple, si les analyte
identiquement avec le métal et les références pour
[M(réf)2(Ai)-H]+
et [M(réf)2(Aj)
fractions molaires des analytes en phase liquide
quantification juste. Cependant, tout
formation des clusters imposerait un biais entre la
même analyte impliqué dans le cluster correspondant, c’est
gazeuse.
Afin de vérifier si un tel phénomène de compétition est à l’origine des biais
ionique dans le spectre MS du cluster trimérique associé à un analyte i
croissantes a été mesurée en présence d’un
isotopiquement avec un 13
C (pour
dont les rapports m/z seront alors séparés
ogarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction
galactose en mélange avec D-fructose, ( ) D-fructose en mélange avec D
galactose en mélange avec D-glucose. Le « tracé » expérimental à partir des trois points de mesure
est représenté en ligne pointillée, les droites théoriquement attendues sont en trait plein
La linéarité de la méthode cinétique étant mise en défaut, il est nécessaire de revenir aux hypothèses
explicites et implicites de cette méthode. En particulier, un pré-requis
l’indépendance de la formation du cluster trimérique associé à un isomère vis
Pour un mélange binaire par exemple, si les analyte
identiquement avec le métal et les références pour former les clusters trimériques correspondant
)-H]+
, l’abondance des clusters en phase gazeuse reflètera
ions molaires des analytes en phase liquide et la mesure du ratio en MS/MS fournira une
ntification juste. Cependant, tout phénomène de compétition entre les deux isomère
formation des clusters imposerait un biais entre la fraction d’un analyte en solution
s le cluster correspondant, c’est-à-dire la fraction
phénomène de compétition est à l’origine des biais observés
du cluster trimérique associé à un analyte i,
n présence d’une concentration donnée en
C (pour distinguer les deux clusters [M(réf)2(Ai)-H]
seront alors séparés d’une unité de masse).
Quantification en mélange – mélange binaire 19
onction de la fraction molaire liquide
fructose en mélange avec D-glucose,
à partir des trois points de mesure
s sont en trait plein.
défaut, il est nécessaire de revenir aux hypothèses
élémentaire concerne
é à un isomère vis-à-vis des autres
Pour un mélange binaire par exemple, si les analytes Ai et Aj réagissent
former les clusters trimériques correspondants
l’abondance des clusters en phase gazeuse reflètera les
et la mesure du ratio en MS/MS fournira une
phénomène de compétition entre les deux isomères pour la
action d’un analyte en solution et celle de ce
fraction de l’analyte en phase
phénomène de compétition est à l’origine des biais observés, l’abondance
à trois concentrations
e concentration donnée en analyte j marqué
H]+
et [M(réf)2(Aj)-H]+

Ces mesures sont réalisées pour une gamme croissant
obtenus pour le système Cu/Ser et le
le graphe ci-dessous :
Figure 6 : Abondance ionique du cluster trimérique [Cu(Ser)
D-fructose, pour différentes concentrations en D
Un phénomène d’exaltation est clairement mis en évi
trimérique du fructose est bien une fonction linéaire de
pente de cette droite est une fonction sigmoïdale d
alors ici le rôle d’isomère « compétiteur
formation/ionisation du cluster trimérique d’
puisque la fraction molaire « réelle
gazeuse telle que mesurée par la méthode cinétique.
toutefois différente selon le système binaire envis
influence pourrait être un changement de structure
anomérique d’un isomère, par interac
différences de formation/ionisation du cluster trimérique associé.
Ces mesures sont réalisées pour une gamme croissante de concentration en analyte j. Les résultats
pour le système Cu/Ser et le mélange binaire D-fructose/D-glucose (13
cluster trimérique [Cu(Ser)2(fru)-H]+
en fonction de la concentration en
fructose, pour différentes concentrations en D-glucose (13
C1) exprimées en mM
Un phénomène d’exaltation est clairement mis en évidence ici, puisque si l’abondance du cluster
une fonction linéaire de la concentration de ce même fructose, la
pente de cette droite est une fonction sigmoïdale de la concentration en D-glucose marqué, qui joue
compétiteur ». La présence d’un second isomère impacte bien la
formation/ionisation du cluster trimérique d’un isomère donné, influence à l’origine d’un biais
réelle » de l’analyte en phase liquide diffère de sa
mesurée par la méthode cinétique. La portée de cet effet de compétition est
toutefois différente selon le système binaire envisagé. Une description envisageable de cette
influence pourrait être un changement de structure principale, ou la modification de l’équilibre
par interaction faible entre monosaccharides [5
nisation du cluster trimérique associé.
e de concentration en analyte j. Les résultats
13
C1) sont présentés sur
en fonction de la concentration en
exprimées en mM
dence ici, puisque si l’abondance du cluster
la concentration de ce même fructose, la
glucose marqué, qui joue
isomère impacte bien la
, influence à l’origine d’un biais
diffère de sa fraction en phase
a portée de cet effet de compétition est
Une description envisageable de cette
principale, ou la modification de l’équilibre
[53,54], entrainant des

Zhang et al [50] ont proposé l’introduction d’une constante d’équilibre ‫ܭ‬௜
௜ǡ௝
susceptible de
caractériser la distribution d’un analyte i dans les phases liquide et gazeuse en présence d’un
isomère j:
‫ܣ‬௜
௟
௄೔
೔ǡೕ
ሱሮ ‫ܣ‬௜
௚ (18)
Cette constante d’équilibre concerne bien évidemment un analyte donné dans un mélange donné
(binaire ici), puisqu’il doit rendre compte des phénomènes d’interactions entre analytes et ne pourra
en aucun cas caractériser un analyte de façon universelle.
En définissant une constante similaire pour l’analyte j (en présence de l’analyte i), on peut alors
définir la fraction molaire en phase gazeuse de l’analyte i en fonction des fractions molaires en
phase liquide des analytes i et j, et des constantes d’équilibre définies :
ߙ௜
௚
ൌ
‫ܭ‬௜
௜ǡ௝
ȉ ߙ௜
௟
‫ܭ‬௜
௜ǡ௝
ȉ ߙ௜
௟
൅ ‫ܭ‬௝
௜ǡ௝
ȉ ߙ௝
௟
(19)
Ce qui se réécrit, en considérant qu’il s’agit d’un mélange binaire [51] :
ߙ௜
௚
ൌ
‫ܭ‬௜
௜ǡ௝
‫ܭ‬௝
௜ǡ௝൘ ȉ ߙ௜
௟
‫ܭ‬௜
௜ǡ௝
‫ܭ‬௝
௜ǡ௝൙ ȉ ߙ௜
௟
൅ ൫ͳ െ ߙ௜
௟
൯
(20)
En reprenant l’équation (15), mais en y substituant le terme ߙ, classiquement associé à la fraction
molaire en phase liquide dans la méthode cinétique standard, à la fraction molaire en phase
gazeuse d’un des analytes, on obtient :
݈݊ሺܴሻ ൌ ߙ௜
௚
ȉ ݈݊ሺܴ௜ሻ ൅ ൫ͳ െ ߙ௜
௚
൯ ȉ ݈݊൫ܴ௝൯ (21)
où Ri et Rj sont les ratios des analytes i et j considérés séparément, valeurs expérimentales donc
soumises à aucune correction ou modification. En combinant les équations (19) et (20), on écrit le
ratio mesuré en mélange R en fonction d’une fraction molaire en phase liquide :
݈݊ሺܴሻ ൌ
ቌ
‫ܭ‬௜
௜ǡ௝
‫ܭ‬௝
௜ǡ௝൘ ȉ ݈݊ሺܴ௜ሻ െ ݈݊൫ܴ௝൯ቍ ȉ ߙ௜
௟
൅ ݈݊൫ܴ௝൯
‫ۉ‬
‫ۈ‬
‫ۇ‬‫ܭ‬௜
௜ǡ௝
‫ܭ‬௝
௜ǡ௝൙ െ ͳ
‫ی‬
‫ۋ‬
‫ۊ‬
ȉ ߙ௜
௟
൅ ͳ
(22)

La détermination du rapport
monosaccharides étudiés (gal/fru, gal/glc, fru/
celles déjà effectuées. Une régression de la forme
fraction molaire liquide) a été appliquée aux points
aux mesures du ratio R pour ces même
0, 50 et 100%. Cette régression permet
constantes d’équilibre, comme présent
validation, correspondant aux fractions molaires 25 et 75%
donc de la correction. Ainsi, la mesure du ratio R en mélange binaire i/j p
fraction molaire des analytes i ou j
obtenant ainsi les fractions en phase gaz
retrouvant ainsi les fractions molaires en phas
Figure 7 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en f
d’un des analytes. ( ) D-galactose en mélange avec D
( ) D-galactose en mélange avec D
Le tracé de la régression de la forme (21)
Puisque la régression est excellente et appuyée par
le calcul des rapports des constantes d’équi
une régression trois points. On obtient ainsi
Des mesures du ratio R et les calculs des fractions
rapport dans le cas des mélanges
étudiés (gal/fru, gal/glc, fru/glc) ne demande pas de mesures supplémentaires à
celles déjà effectuées. Une régression de la forme de l’équation (21) (fonction rationnelle de la
appliquée aux points expérimentaux de la Figur
aux mesures du ratio R pour ces mêmes mélanges binaires et des fractions molaires en phase liquide
. Cette régression permet une corrélation excellente et la détermination du
, comme présenté sur la Figure 7 dans le cas du système Cu/Ser
fractions molaires 25 et 75%, assurent la validité de la régre
insi, la mesure du ratio R en mélange binaire i/j permet de r
des analytes i ou j sans biais, soit en considérant la relation linéair
obtenant ainsi les fractions en phase gazeuse, soit en considérant la fonction rationnelle (21)
retrouvant ainsi les fractions molaires en phase liquide.
ogarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction molaire liquide
galactose en mélange avec D-fructose, ( ) D-fructose en mélange avec D
se en mélange avec D-glucose – points de validation à 25 et 75%.
de la forme (21) effectuée sur trois points (0, 50 et 100%) est réalisé
Puisque la régression est excellente et appuyée par les points de validation pour le système Cu/Ser,
le calcul des rapports des constantes d’équilibre pour le système Mn/Asp a également été
On obtient ainsi ,
Des mesures du ratio R et les calculs des fractions
mélanges binaires des trois
glc) ne demande pas de mesures supplémentaires à
(fonction rationnelle de la
igure 4, correspondant
binaires et des fractions molaires en phase liquide
la détermination du rapport des
igure 7 dans le cas du système Cu/Ser. Des points de
assurent la validité de la régression et
insi, la mesure du ratio R en mélange binaire i/j permet de retrouver la
sans biais, soit en considérant la relation linéaire (20) en
, soit en considérant la fonction rationnelle (21) en
onction de la fraction molaire liquide
fructose en mélange avec D-glucose,
points de validation à 25 et 75%.
est réalisé en trait plein.
pour le système Cu/Ser,
libre pour le système Mn/Asp a également été réalisé par
et
Des mesures du ratio R et les calculs des fractions molaires associées

par la relation (21), soit la correction phase liquide/phase gazeuse, sont alors effectués pour les
fractions 25 et 75% à partir des rapports des constantes d’équilibre calculés, et comparés aux
résultats obtenus avec la méthode linéaire standard. Ces données sont présentées dans le Tableau 4.
Tableau 4 : Résultats de quantification des fractions molaires en mélange binaire, par une calibration deux
points (standard) et trois points (corrigé) pour les trois monosaccharides étudiés. a
écart type, b
utilisé
comme point de calcul dans la calibration trois points.
ˆ”ƒ…–‹‘ ‘Žƒ‹”‡ ‡ ’Šƒ•‡ Ž‹“—‹†‡ Ψ ȋɐȌƒ
±Žƒ‰‡ „‹ƒ‹”‡ Ƚ୪
”±‡ŽŽ‡
…ƒŽ‹„”ƒ–‹‘ †‡—š ’‘‹–•
ȋ±–Š‘†‡ •–ƒ†ƒ”†Ȍ
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Une calibration trois points, qui permet d’obtenir le rapport des constantes d’équilibre régissant
l’équilibre phase liquide/phase gazeuse, permet également de bien corriger la non linéarité observée
précédemment en fournissant des valeurs de fractions molaires en phase liquide en bon accord avec
les fractions réelles, pour les deux systèmes métal/référence engagés. A noter que le système
Mn/Asp pour le mélange binaire gal/fru fournit de bons résultats pour une calibration deux points,
tendance reflétée par la valeur du rapport des constantes d’équilibre, ‫ܭ‬௚௔௟
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Les deux isomères se comportent dans ce cas d’une façon très similaire avec le métal et la
référence, impliquant des phénomènes de compétition limités. A noter enfin que cette valeur diffère
tout à fait du rapport des constantes d’équilibres obtenu avec le système Cu/Ser pour le même
mélange binaire (‫ܭ‬௚௔௟
௚௔௟ǡ௙௥௨
‫ܭ‬௙௥௨
௚௔௟ǡ௙௥௨
ൗ ൌ ʹǡͷͳ), ce qui montre que la constante d’équilibre phase
liquide/phase gazeuse d’un analyte dépend également du système discriminant métal/référence
utilisé.

La méthode peut alors être appliquée à tout système discriminant pour une quantification en
mélange binaire, en remplaçant la calibration deux points [18] de la méthode standard (0 et
100%) par une calibration trois points (0, 50 et 100% par exemple) [50].
Mélange ternaire
L’extension du raisonnement précédent à un mélange ternaire i/j/k est évidente, et l’obtention de
la relation entre logarithme népérien du ratio et fractions molaires en phase liquide immédiate :
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(23)
que l’on réécrit, avec l’hypothèse explicite d’un mélange ternaire :
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(24)
d’où la nécessité de deux mesures de ratios R sous deux conditions différentes (soit deux systèmes
métal/référence discriminants) afin d’expliciter les deux fractions molaires inconnues et d’en
déduire la troisième.
Si l’impact de la présence d’un isomère j sur la formation/ionisation du cluster d’un isomère i est
avéré, il peut sembler raisonnable, dans une première approximation, de négliger l’influence d’un
troisième isomère k sur cette compétition. Schématiquement cela revient à considérer, en termes
d’interactions entre isomères tout du moins, un mélange ternaire i/j/k comme une combinaison de
trois mélanges binaires i/j, j/k et i/k. Mathématiquement, cela se traduit par l’équation suivante :
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൅ ͳ
(25)

Quantification en mélange – mélange ternaire 25
Naturellement, et puisque les constantes d’équilibres sont attribuées pour un système
métal/référence et un mélange binaire donnés, la mesure d’un seul ratio R conduit à l’obtention de
trois valeurs possibles pour chaque fraction molaire, selon l’attribution de l’isomère k (le
« compétiteur ») au fructose, glucose ou galactose. Le Tableau 5 résume les résultats obtenus pour
trois mélanges ternaires gal/glc/fru distincts :
Tableau 5 : Résultats de quantification pour trois mélanges ternaires, par la méthode cinétique corrigée.
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a
écart type
On observe que les trois valeurs possibles pour chaque fraction molaire sont, sans être aberrantes,
parfois éloignées de la valeur réelle. Il n’existe pas cependant de tendance simple reliant la justesse
des résultats à l’identification de l’isomère k (le « compétiteur ») dans la formule (24) au fructose,
glucose ou galactose. L’identification de l’isomère k au fructose apporte les fractions les plus justes
pour le glucose et le galactose dans le mélange II, pour le fructose et le glucose dans le mélange III,
ce qui rompt la tendance possible observée dans le mélange I, où la fraction la plus juste pour un
isomère est obtenue lorsque cet isomère est l’isomère k.
C’est par contre la moyenne arithmétique de ces trois valeurs qui constitue une bonne
approximation de la fraction en phase liquide comme l’attestent les valeurs présentées dans le
tableau 5. Cette opération mathématique correspond en fait à l’approximation i/j/k ~ i/j + i/k + j/k,
qui est de ce fait sinon vérifiée au moins validée.
Tous ces résultats sont également présentés dans Distinction and quantitation of sugar isomers in
ternary mixtures using the kinetic method, article soumis au Journal of the American Society for
Mass Spectrometry, ainsi que dans Distinction isomérique et quantification de monosaccharides
par la méthode cinétique, poster présenté au SMAP 2009 (Spectrométrie de Masse et Analyse
Protéomique), à Dijon du 14 au 18 septembre 2009.

26
Conclusion
La méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique a été utilisée avec succès pour la
discrimination et la quantification de trois monosaccharides en mélanges binaire et ternaire, par
l’utilisation de cations métalliques divalents comme atome central et d’acides aminés pour
référence. La recherche de systèmes discriminants, largement empirique et par conséquent
systématique, fournit comme meilleurs systèmes des couples métal/référence dont ladite référence
présente effectivement une analogie structurale avec l’analyte (une fonction hydroxyle pour la
sérine et un groupement carboxyle pour l’acide aspartique).
L’hypothèse sous-jacente première de la méthode cinétique, i.e. la formation semblable du
cluster trimérique pour chaque analyte indépendamment des autres analytes, n’est pas respectée ici
puisque des phénomènes de compétition sont mis en évidence. Néanmoins la quantification des
isomères en mélange peut tout de même être assurée par une correction à la loi linéaire de la
méthode cinétique standard, en considérant que la fraction de l’analyte impliqué dans le cluster
trimérique (c’est-à-dire en phase gazeuse) n’est pas strictement égale à sa fraction molaire en
solution, mais qu’il existe un équilibre entre ces deux états. On ne peut cependant pas exclure
d’autres phénomènes susceptibles d’entrainer une non-linéarité, en particulier la présence de
complexes isobares de composition différente [55] et les phénomènes entropiques ignorés ici,
consciemment et à tort puisque analytes et références ne sont pas identiques structuralement et que
des interactions intramoléculaires existent. La signification physique des coefficients correcteurs,
décrits comme les rapports des constantes d’équilibre entre phase liquide et phase gazeuse, est donc
sans aucun doute plus complexe.
L’utilisation de la variation en ligand fixe de la méthode cinétique permettra de multiplier les
systèmes discriminants tout en limitant les changements de métal ou de référence, autorisant ainsi
une augmentation rapide de la capacité de quantification simultanée (N-1 systèmes pour N isomères
en mélange) et une limitation du nombre de manipulations associées. Les démarches préliminaires
concerneront alors la mesure du ratio de chaque analyte seul pour chaque système, et les 2 parmi N
calibrations trois points des mélanges binaires pour obtenir les coefficients correcteurs associés. La
moyenne arithmétique des N fractions molaires obtenues devrait fournir une bonne évaluation de la
fraction molaire en phase liquide réelle de chaque isomère.
Enfin, l’étude de la fragmentation du complexe dimérique [M(réf)(A)-H]+
(déjà explorée pour la
distinction isomérique de peptides [56]) peut constituer une source supplémentaire de systèmes et
fournir des avantages similaires à ceux apportés par le ligand fixe.

27
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