MÉTHODE CINÉTIQUE
appliquée à la reconnaissance isomérique
T. Fouquet - groupe masse – méthode cinétique
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10 juillet 2009
MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD
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M H
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+ AP = -ΔHréaction
A H
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B iAH
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B i +
k 1
HBi
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A+
k 2
AH
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B i +
HBi
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A H...
MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD
(2)
 Tracé (« kinetic method plot »)
 Différentes versions
Standard
Isentropique
 Erreur s...
MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE
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[MII
+ réf*2 + sucre – H]+
r é f *
M I I
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MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (2)
 Dissociation du cluster primaire (trimérique)
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MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)
 Modélisation des cinétiques de dissociation par
l’abondance ...
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MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)
 Par exemple
 D-gal et D-fru disc...
DANS NOTRE CAS
 Métal :
Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn
 Références
Acides aminés
 Similitudes structurales
 Interaction Pi
...
QUELQUES SYSTÈMES
DISCRIMINANTS
  métal (II)
Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence  
L - Asp
gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/...
r é f *
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M I I
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EVOLUTIONS
 Trois problèmes :
Pas de formation du cluster trimérique
Pas de disti...
LIGAND FIXE
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[Fe – Asn2 – glc – H]+[Fe – Asn2 – gal – H]+
[Fe – Asn2 – fru – H]+
– gal– fru– glc
– Asn
 Pour le détermi...
  métal (II)
Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence  
L - Asp
gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
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QUANTIFICATION EN MÉLANGE
 D’après Cooks :
Méthode « intrinsèquement » linéaire
(si l’on respecte les limitations :
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QUANTIFICATION – QUELQUES
PROBLÈMES
 Déviations
Positives
Négatives
Inflexion ?
 Variable avec les sucres et les syst...
QUANTIFICATION ?
 Trois conditions nécessaires et suffisantes
Système discriminant
Trimère « suffisamment » formé
 err...
NON LINÉARITÉ DE LA MÉTHODE
 Trois causes possibles (pour le moment)
Entropie négligée
 Interactions intramoléculaires ...
VARIATION DE RSUCRE ?
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T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
Ln(Rfru marqué)
Ln(Rgal)
xgal
xgal
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VARIATION DE RSUCRE (2)
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T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
ln Rmélange – Cu-Ser
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Modélisat...
A PRÉCISER RIGOUREUSEMENT
 Contrairement à ce qui a été fait ici…
R13C – sucre / Rsucre ?
 Simple rapport dans le cas p...
MERCI DE VOTRE ATTENTION !
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Méthode cinétique appliquée à la reconnaissance isomérique

  1. 1. MÉTHODE CINÉTIQUE appliquée à la reconnaissance isomérique T. Fouquet - groupe masse – méthode cinétique 1 10 juillet 2009
  2. 2. MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD 2 M H + MH + + AP = -ΔHréaction A H + H2 B iAH + B i + k 1 HBi + A+ k 2 AH + B i + HBi + A+ A H + H2 B i ∆ ε 0 A ≈ Bi (Structure et interactions) (voies uniques de fragmentation) ~ fonctions de partitions  Méthode de mesure de propriétés et données thermochimiques  Cinétiques de dissociations compétitives d’un cluster formé : De l’analyte A D’un composé de référence Bi  Nécessité d’une fragmentation limitée Liaisons faibles Energie de collision faible T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  3. 3. MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD (2)  Tracé (« kinetic method plot »)  Différentes versions Standard Isentropique  Erreur sur la variation d’entropie constante  Conservation de la linéarité Etendue  Mesure de l’entropie pour chaque point  Tracés modifiés pour éliminer les corrélations  Nécessité de données sur les variations d’entropie des références 3 ln(k2/k1) AP(Bi) T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  4. 4. MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE 4 [MII + réf*2 + sucre – H]+ r é f * M I I s u c r e r é f * s u c r e M I I r é f * - H + T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  5. 5. MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (2)  Dissociation du cluster primaire (trimérique) 5 r é f * s u c r e M I I r é f * - H + r é f *M I I r é f * - H + M I I r é f * s u c r e - H + k 2 k 1 R = k 1 k 2 [ M I I + r é f * 2 - H ] + [ M II + r é f + s u c r e - H ] + = T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  6. 6. MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)  Modélisation des cinétiques de dissociation par l’abondance des ions fragments. 6 100 200 300 400 500 0.0 2.0e+5 4.0e+5 6.0e+5 8.0e+5 1.0e+6 1.2e+6 1.4e+6 [MnII + Asp2 + sucre – H]+ - réf* - sucre R = [ M II + A s p 2 - H ] + [ M II + A s p + f r u - H ] + [MnII + Asp2 – H]+ [MnII + Asp + sucre – H]+ T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  7. 7. 0 2e+5 4e+5 6e+5 8e+5 1e+6 MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)  Par exemple  D-gal et D-fru discriminés par Mn – L-Asp 7 T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique 0.0 2.0e+5 4.0e+5 6.0e+5 8.0e+5 1.0e+6 1.2e+6 1.4e+6 D-gal R = 0,40 D-fru R = 0,88
  8. 8. DANS NOTRE CAS  Métal : Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn  Références Acides aminés  Similitudes structurales  Interaction Pi  Analytes Monosaccharides : glucose, galactose et fructose 8 NH2 OH O O OH L - a c id e a s p a r t iq u e A s p NH2 OH O O OH L - a c id e g lu t a m iq u e G lu NH2 OH O O NH2 L - g lu t a m in e G ln NH2 OH O O NH2 L - a s p a r a g in e A s n NH2 OH O OH L - t h r é o n in e T h r NH2 OH O OH L - s e r in e S e r NH2 OH O L - p h é n y la la n in e P h e O OH H H H OH OH H OH H OH O OH H H OH H OH H OH H OH O OH OHH H OH H OH H H OH T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  9. 9. QUELQUES SYSTÈMES DISCRIMINANTS   métal (II) Ca Mn Fe Co Cu Zn référence   L - Asp gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03 trimère quasi non formé trimère peu formé 0,68 +/- 0,06 glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation  secondaire forte 3,0 +/- 0,2 fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3 L - Phe gal perte de Phe unique,  fragmentation secondaire  forte fragmentation secondaire  forte fragmentation  secondaire forte fragmentation  secondaire forte perte de sucre quasi  unique --> ligand fixe 0,21 +/- 0,03 glc 5,9 +/- 0,9 fru 5,7 +/- 0,5 L - Asn     perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi  exclusive gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10 glc 11,3 +/- 0,9           fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe L - Ser gal fragmentation secondaire  forte fragmentation secondaire  forte fragmentation  secondaire forte fragmentation  secondaire forte 2,32 +/- 0,04 fragmentation  secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3 fru 20,8 +/- 0,2 L - Gln   perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi  exclusive gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8   > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe L - Thr gal perte de réf* uniquement 0,04(2) +/- 0,006 non répétable Pas de distinction glc/fru 0,12 +/- 0,01 pas de distinction, perte  de réf* uniquement 0,25 +/- 0,03 glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3 fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2 L - Glu gal 0,12 +/- 0,02 peu répétable (chélate  faiblement formé) peu répétable (chélate  faiblement formé) protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05 fru 0,35 +/- 0,01 L - Arg protonation de L- Arg seule pas de formation de chélate D - fucose chélate non formé 9 T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  10. 10. r é f * s u c r e M I I r é f * - H + EVOLUTIONS  Trois problèmes : Pas de formation du cluster trimérique Pas de distinction isomérique, absolue ou partielle Fragmentation secondaire forte (> ion fragment attendu)  Utilisation d’un ligand fixe 10 r é f * s u c r e M II L f ix e - H |+ u n it é f ix e T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  11. 11. LIGAND FIXE 11 [Fe – Asn2 – glc – H]+[Fe – Asn2 – gal – H]+ [Fe – Asn2 – fru – H]+ – gal– fru– glc – Asn  Pour le déterminer Par exemple : Asn pour Fe Perte nulle ou faible de réf*  Lfixe Perte nulle de Lfixe avec une autre réf* T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  12. 12.   métal (II) Ca Mn Fe Co Cu Zn référence   L - Asp gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03 trimère quasi non formé trimère peu formé 0,68 +/- 0,06 glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation  secondaire forte 3,0 +/- 0,2 fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3 L - Phe gal perte de Phe unique,  fragmentation secondaire  forte fragmentation secondaire  forte fragmentation  secondaire forte fragmentation  secondaire forte perte de sucre quasi  unique --> ligand fixe 0,21 +/- 0,03 glc 5,9 +/- 0,9 fru 5,7 +/- 0,5 L - Asn     perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi  exclusive gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10 glc 11,3 +/- 0,9           fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe L - Ser gal fragmentation secondaire  forte fragmentation secondaire  forte fragmentation  secondaire forte fragmentation  secondaire forte 2,32 +/- 0,04 fragmentation  secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3 fru 20,8 +/- 0,2 L - Gln   perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi  exclusive gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8   > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe L - Thr gal perte de réf* uniquement 0,04(2) +/- 0,006 non répétable Pas de distinction glc/fru 0,12 +/- 0,01 pas de distinction, perte  de réf* uniquement 0,25 +/- 0,03 glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3 fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2 L - Glu gal 0,12 +/- 0,02 peu répétable (chélate  faiblement formé) peu répétable (chélate  faiblement formé) protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05 fru 0,35 +/- 0,01 L - Arg protonation de L- Arg seule pas de formation de chélate D - fucose chélate non formé   métal (II) Ca Mn Fe Co Cu Zn référence   L - Asp gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03 trimère quasi non formé trimère peu formé 0,68 +/- 0,06 glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation  secondaire forte 3,0 +/- 0,2 fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3 L - Phe gal perte de Phe unique,  fragmentation secondaire  forte fragmentation secondaire  forte fragmentation  secondaire forte fragmentation  secondaire forte perte de sucre quasi  unique --> ligand fixe 0,21 +/- 0,03 glc 5,9 +/- 0,9 fru 5,7 +/- 0,5 L - Asn     perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi  exclusive gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10 glc 11,3 +/- 0,9           fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe L - Ser gal fragmentation secondaire  forte fragmentation secondaire  forte fragmentation  secondaire forte fragmentation  secondaire forte 2,32 +/- 0,04 fragmentation  secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3 fru 20,8 +/- 0,2 L - Gln   perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre quasi  exclusive perte de sucre exclusive perte de sucre quasi  exclusive gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8   > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe L - Thr gal perte de réf* uniquement 0,04(2) +/- 0,006 non répétable Pas de distinction glc/fru 0,12 +/- 0,01 pas de distinction, perte  de réf* uniquement 0,25 +/- 0,03 glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3 fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2 L - Glu gal 0,12 +/- 0,02 peu répétable (chélate  faiblement formé) peu répétable (chélate  faiblement formé) protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05 fru 0,35 +/- 0,01 L - Arg protonation de L- Arg seule pas de formation de chélate D - fucose chélate non formé 100 200 300 400 500 0.0 5.0e+5 1.0e+6 1.5e+6 2.0e+6 2.5e+6  Formation du chélate Réf* = D – fucose (déoxy – galactose) Cu(Asn)fucose–sucre et Cu(Phe)fucose-sucre OK  Diminution des fragmentations secondaires  Renforcement des discriminations Fe – Thr : pas de distinction fru / glc  Rgal = 0,06  Rfru = 1,2 / Rglc = 1 Fe(Asn)Thr : OK !  Rgal = 0,17  Rglc = 1,2  Rfru = 4,0  Inconvénient : faible abondance du cluster 100 200 300 400 500 0 1e+5 2e+5 3e+5 4e+5 5e+5 6e+5 [FeII + L-Thr2 + D-gal – H]+ [FeII + L-Asn + L-Thr + D-gal – H]+ LIGAND FIXE 12 T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  13. 13. QUANTIFICATION EN MÉLANGE  D’après Cooks : Méthode « intrinsèquement » linéaire (si l’on respecte les limitations :  Proximité structurale des composés  Pas de barrière énergétique) X et Y deux composés en mélange Rx et Ry facteurs de reconnaissance  Possibilité de quantifier N composés en mélange si N – 1 systèmes discriminants 13 T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  14. 14. QUANTIFICATION – QUELQUES PROBLÈMES  Déviations Positives Négatives Inflexion ?  Variable avec les sucres et les systèmes 14 Cu – Ser – gal/fru Cu – Ser – gal/glc Co – Thr – gal/fru T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  15. 15. QUANTIFICATION ?  Trois conditions nécessaires et suffisantes Système discriminant Trimère « suffisamment » formé  erreur absolue Facteurs « suffisamment » différents  Erreur relative, ou incidence de l’erreur absolue 15 Co – Thr – glc/fru Rglc = 1,34 Rfru = 1,80 Rfru = 23,3 Rgal = 2,38 Cu – Ser – gal/fru T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  16. 16. NON LINÉARITÉ DE LA MÉTHODE  Trois causes possibles (pour le moment) Entropie négligée  Interactions intramoléculaires (liaison H)  Dissemblance réf* / analyte  Pb : impossibilité de correction « formelle » sans références  (interaction « métallique » et « moléculaire ») Modification ou différence de rendement de formation du trimère en mélange selon l’analyte  Exaltation ou diminution « artificielle » du ratio Modification de R en présence d’un autre sucre  Utilisation de sucres marqués 13 C 16 T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  17. 17. VARIATION DE RSUCRE ? 17 T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique Ln(Rfru marqué) Ln(Rgal) xgal xgal  Utilisation d’un sucre marqué : 13 C – fructose  Mélange gal – 13 C-fru  Clusters en m/Z et m/Z + 1  Fragmentation m/Z  Rgal  Fragmentation m/Z + 1  R13C-fru et R13C, 15N, 2D-gal  Corrections :  Isotopes naturels de gal  R13C – fru / Rfru Exemple (le seul ) : Cu – L-Ser
  18. 18. VARIATION DE RSUCRE (2) 18 T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique ln Rmélange – Cu-Ser xgal Modélisation grossière par une parabole Correction R13C – fru / Rfru Abondance naturelle a = -0.04 b = 0.908 a’ = -1.93 b’ = 3.14 ~ 1.9 ~ -4.2 ~ 3.1
  19. 19. A PRÉCISER RIGOUREUSEMENT  Contrairement à ce qui a été fait ici… R13C – sucre / Rsucre ?  Simple rapport dans le cas précédent… Abondance naturelle des isotopes de réf*, Lfixe et sucre non marqué (Soit les deux corrections apportées !) Et travailler avec d’autres systèmes et d’autres sucres… 19 T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
  20. 20. MERCI DE VOTRE ATTENTION ! 20 T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

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