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REPUBLIQUE ALGERIENNE
DEMOCRATIQUE ET
POPULAIRE
MINISTERE DE
L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
Université
Constantine 1
Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des
Technologies Agro-Alimentaires (INATAA)
Microprojet
Thème:
Méthodes d’extraction et de purification des enzymes
Présenté par :
 CHEBIRA Hadjar
 MOUSSAOUI Rahima
Année universitaire 2014-2015
5e Année ingénieur
Plan de travail
Introduction
Généralité sur les enzymes
Méthodes d’extraction
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Sonication
 Des aires de compression et raréfaction apparaissent,
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à plusieurs centaines d’atmosphère.
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Méthodes chimiques
Extraction chimique
 Consiste à mélanger le produit en solution aqueuse
avec un petit volume de solvant organique dans lequel
il est très soluble.
 On agite ensuite vigoureusement le mélange pour
permettre au produit de se déplacer de la phase
aqueuse vers la phase organique, puis on récupère
celle-ci.
Enzymes lytiques
 Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir
compte de la paroi cellulaire qui protège la membrane
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Pectinases, etc., peuvent être employées pour rompre
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composé désiré de ses impuretés basée sur les différentes
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chargés négativement.
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molécules chargés positivement.
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fonctionne par partage de
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Mobile
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stationnaire est grande plus leur rétention est grande et
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 Les grosse molécules migrants plus vite que les molécules
de plus faible poids moléculaire qui elles peuvent diffuser
librement dans la phase stationnaire alors que les premières
ne le peuvent pas.
Chromatographie d’affinité
On utilise ici un système biologique, un ligand ayant
la propriété de fixé spécifiquement une molécule est
lié de façon covalente à la phase solide. Ainsi, au
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qui ont une affinité pour le ligand sont fixés alors que
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 Le principe de l’électrophorèse repose sur le
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électrique.
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vers l’anode (+) et une espèce cationique migrera
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Ce sont les caractéristiques intrinsèques de l’enzyme cible, qui permettront
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du matériel biologique de départ, le choix des techniques
d’extraction les plus adaptées à ce dernier et les techniques de
séparation et de purification adéquates aux propriétés
physico-chimiques de l’enzyme.
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MINISTERE DE
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Thème:
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méthodes d'extraction et de purification des enzymes

  • 1.
  • 2. REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université Constantine 1 Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des Technologies Agro-Alimentaires (INATAA) Microprojet Thème: Méthodes d’extraction et de purification des enzymes Présenté par :  CHEBIRA Hadjar  MOUSSAOUI Rahima Année universitaire 2014-2015 5e Année ingénieur
  • 3. Plan de travail Introduction Généralité sur les enzymes Méthodes d’extraction Méthodes de purification conclusion
  • 4.
  • 5. 1878 par Willy Kuhne Vient du grec « en zume » et signifie « dans la levure » L’industrie agro- alimentaire Gluco- amylase Extraction et purification Enzyme Objectif: passer en revue les différentes méthodes d’extraction et de purification des enzymes industrielles. Améliorer les qualité de l’aliment Une meilleur conservation Augmenter le rendement et la pureté Glucose produit à partir de l’amidon
  • 6.
  • 7. enzyme définition propriétés Protéine présentant des propriétés de catalyse spécifiques d’une réaction chimique du métabolisme de l’être vivant qui la produit
  • 8. Biocatalyseurs de nature protéique qui accélèrent une réaction biochimique et se retrouvent intact en fin de réaction et peuvent être réutilisées Les enzymes sont spécifiques, chaque enzyme possède un site actif décomposer en site catalytique et site pour le substrat Les enzymes sont sensibles à la température et au PH De nombreuses enzymes ont besoin de cofacteurs pour fonctionner (NAD)
  • 9. enzyme Classification et nomenclature 1 • Oxydoréductases 2 3 4 5 6 • Transférases • Hydrolases • Isomérases • Lyases • Ligases Selon l’enzyme commission une nomenclature des enzymes basée sur quatre nombres précédés de EC : EC .1. 2. 3. 4
  • 10. enzyme Source Industrie  Les enzymes jouent plusieurs rôles dans les productions alimentaires industrielles. enzymes source Action Usage Lipases Pénicillium roqueforti, hydrolyse les lipides en acides gras et glycérides Produire davantage de composés d'arômes dans les fromages et autres produits laitiers Amylases Aspergillus oryzae (moisissure) Bacillus subtilis (bactérie) hydrolyse de l'amidon en sucres solubles Améliorer la fermentation (pain, bière) Clarifier les jus de fruits et de légumes, etc. Invertase Saccharomyces cerevisiœ hydrolyse le saccharose en glucose et fructose Réduire la cristallisation dans les sirops et Produire du sucre inverti
  • 11.
  • 12. Définition :  l’extraction désigne l’action de séparer une enzyme du composé dont elle fait partie. Cette méthode consiste à libérer l’enzyme de la cellule par éclatement de la paroi ou de la membrane cellulaire par des procédés mécanique, physique ou chimique.  Pour l’isolement d’une enzyme, il est toujours préférable de choisir une source enrichie en cette enzyme particulière. physique chimiqueMécanique Méthodes d’extraction:
  • 13. Choc osmotique Les cellules sont incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par causer une rupture de la membrane plasmique.
  • 14. Méthodes mécaniques Congélation-décongélation Refroidissement brusque La concentration du soluté intra et extracellulaire Formation des cristaux intra et extracellulair e Cassures dans la cellule
  • 15. Broyage ou agitation avec des abrasifs Agitation violente Microbilles de verre désintègre les microorganismes avec rupture de la paroi
  • 16. Bombe à disruption  La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides.  On libère alors la pression tout d'un coup; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme des bulles à l'intérieur des cellules et les fait éclater. Chambre pressurisée Cellules Azote à haute pression
  • 17. Homogénéisateur d'Elvejm de potier Equipement simple Pilon sous forme de tige de verre Des dents sur son bout  La manipulation du pilon se fait manuellement ou par dispositif mécanique.
  • 18. Les billes de verre La suspension se répartit entre les billes, le tout est alors scellé et on lance la machine, qui fait furieusement tourbillonner les billes de verre dont l’action abrasive fait de dégrader les cellules.
  • 19. Liquide CavitationDes ultrasons Sonication  Des aires de compression et raréfaction apparaissent, et les cavités s’effondrent rapidement.  Les bulles produites dans les cavités sont compressées à plusieurs centaines d’atmosphère.  Ces chocs constituent les éléments de destruction des tissus cellulaires.
  • 20. Méthodes chimiques Extraction chimique  Consiste à mélanger le produit en solution aqueuse avec un petit volume de solvant organique dans lequel il est très soluble.  On agite ensuite vigoureusement le mélange pour permettre au produit de se déplacer de la phase aqueuse vers la phase organique, puis on récupère celle-ci.
  • 21. Enzymes lytiques  Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir compte de la paroi cellulaire qui protège la membrane plasmique.  Pour ceci les enzymes lytiques comme les cellulases, Pectinases, etc., peuvent être employées pour rompre les parois de ces cellules.
  • 22. Extraction liquide-liquide Extraire un ou plusieurs constituants Solvant initial Solvant d’extraction  Pour lequel le ou les constituants à isoler ont une grande affinité par rapport au liquide initial.  Les deux solvants A et B sont non miscibles.
  • 23. Extraction liquide-solide Se déroule en deux étapes Consiste en un passage d’un soluté du milieu liquide au milieu solide Consiste en une élution du soluté d’intérêt, par un solvant approprié, permettant de rompre les interactions soluté- matrice de la phase solide
  • 24.
  • 25. Définition : Est un ensemble d’opérations visant à enlever toutes les impuretés d’un extrait brut contenant l’enzyme d’intérêt. Elle a comme objectifs essentiels d’avoir:  un maximum du rendement de l’enzyme;  un maximum de pureté possible;  un maximum de son activité catalytique.
  • 26. Méthodes de purification Méthodes basées sur les différences de solubilité Méthodes basées sur la taille des molécules Méthodes basées sur les propriétés ioniques
  • 27. Méthodes basées sur les différences de solubilité Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium C’est une technique douce (préserve en générale la structure, et donc la fonction des enzymes.) solution protéique sulfate d’ammonium déshydratation et précipitation des protéines, induisant ainsi le phénomène de relargage.
  • 28.  Les ions sulfates et ammonium sont petits et neutralisent efficacement les charges des protéines. Cette méthode devra être suivie d’un lavage pour éliminer le sel résiduel.
  • 29. Méthodes basées sur la taille des molécules Dialyse Permet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective à franchir les pores d’une membrane de dialyse. cylindres allongés fermer aux deux extrémités contiennent le liquide à dialyser « boudin » de dialyse
  • 30.  Il est placé dans un récipient contenant le liquide contre lequel s’effectue la dialyse ou liquide de contre-dialyse.
  • 31. Centrifugation Différences de densité Un solvant Force de gravité  En effet, si la particule à une densité plus élevée que le fluide en lequel elle est immergée, elle tend à émigrer en bas, suivant la direction de force de pesanteur.
  • 32. Filtration membranaire  Consiste à séparer les particules solides qui se trouvent en suspension dans un liquide par une membrane, tout en limitant son colmatage pour obtenir un fonctionnement stable.  On distingue de type de procédés:  filtration tangentielle  filtration frontale
  • 33. Méthodes basées sur les propriétés ioniques chromatographie  Est une méthode relativement simple de séparation du composé désiré de ses impuretés basée sur les différentes affinités d’un composé à l’égard de deux phases.  L’une, dite stationnaire est emprisonné dans une colonne ou fixé sur un support et l’autre, dite mobile se déplace au contact de la première.
  • 34. Types de chromatographie Chromatographie par adsorption La phase solide La phase mobile constituée d’une résine adsorbante qui fixe certains composé en solution par l’entremise de liaisons de Van der Waals lorsqu’on charge la colonne modifie ensuite les propriétés de la résine, ce qui force la désorption des composés qui y étaient adsorbés et permet leur séparation
  • 35. Chromatographie par échange d’ions  Résines échangeuses d’anions (charges +) séparer les composés chargés négativement.  Résines échangeuses de cations (charges -) séparer les molécules chargés positivement.
  • 36. Chromatographie de partage fonctionne par partage de solutés entre deux phases non miscibles Stationnaire Mobile  Plus la répartition des composés d’un mélange dans la phase stationnaire est grande plus leur rétention est grande et inversement.
  • 37. Chromatographie d’exclusion Phase stationnaire (gel ou un réseau macromoléculaire) Exerçant un véritable effet de tamis vis-à-vis de grosses molécules  Les grosse molécules migrants plus vite que les molécules de plus faible poids moléculaire qui elles peuvent diffuser librement dans la phase stationnaire alors que les premières ne le peuvent pas.
  • 38. Chromatographie d’affinité On utilise ici un système biologique, un ligand ayant la propriété de fixé spécifiquement une molécule est lié de façon covalente à la phase solide. Ainsi, au moment du chargement de la colonne les composés qui ont une affinité pour le ligand sont fixés alors que les impuretés sont éliminées.
  • 39. L’électrophorèse  Le principe de l’électrophorèse repose sur le mouvement d’un ion à charge dans un champ électrique.  Si on dépose une espèce anionique, elle migrera vers l’anode (+) et une espèce cationique migrera vers la cathode (-).
  • 40.
  • 41. Ce sont les caractéristiques intrinsèques de l’enzyme cible, qui permettront de la séparer de ses congénères cellulaires. Protéine Des structures Densité charge Masse forme retrouve peut-être dans une certaine région de la cellule ou dans une organelle donnée certain degré d’hydrophilicité ou d'hydrophobicité*
  • 42.  Tous ces critères peuvent être utilisés dans le choix de la stratégie de purification.  Une bonne stratégie d’obtention d’une enzyme dans les meilleures conditions possibles comportera donc le bon choix du matériel biologique de départ, le choix des techniques d’extraction les plus adaptées à ce dernier et les techniques de séparation et de purification adéquates aux propriétés physico-chimiques de l’enzyme.
  • 43.
  • 44. REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université Constantine 1 Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des Technologies Agro-Alimentaires (INATAA) Microprojet Thème: Méthodes d’extraction et de purification des enzymes Présenté par :  CHEBIRA Hadjar  MOUSSAOUI Rahima Année universitaire 2014-2015 5e Année ingénieur

Notes de l'éditeur

  1. Nous tenons pour commencer, à vous adresser nos sincères remerciement pour votre présence aujourd’hui
  2. Nous avons l’honneur de vous présenter notre travail de mircoprojet intitulé sur le thème de
  3. Nous avons l’honneur de vous présenter notre travail de mircoprojet intitulé sur le thème de