Seg alim mycozoon nov2015

Desarrollo y aplicación de
nuevos métodos para la
detección e identificación
de micobacterias
en productos de
origen ganadero
Iker Agirregomoskorta Sevilla
Dpto. Sanidad Animal, NEIKER-TECNALIA
email: isevilla@neiker.eus Tel: 944034300

Euskadin Elikagaien Segurtasun arloko Ikerketa Planaren emaitzak transferitzeko III. Jardunaldia, Basque Culinary Center, 2015-XI-20
III Jornada transferencia resultados Plan Investigación Seguridad Alimentaria Euskadi, Basque Culinary Center, 20-XI-2015
Introducción
 > 170 especies de micobacterias
 Distribución mundial
 Diagnóstico difícil (cultivo problemático y
genéticamente muy similares)
 Responsables de:
 Tuberculosis (humana y animal)
 Paratuberculosis
 Infecciones diseminadas graves
 Lepra
 Linfadenitis cervical y otras
 Úlcera de Buruli
 Granuloma de estanque
 Otras micobacteriosis
 Asociadas a otras enfermedades
 Crohn?
 Otras inflamatorias intestinales?
 Otras consideradas autoinmunes?
Bacilos sueltos y en grumos de M. avium
subsp. paratuberculosis al microscopio.
Colonia madura de M. bovis en medio
M7H9 sólido.
Las micobacterias:

 Complejo M. tuberculosis (MTC):
Introducción
Muy importantes por su impacto socioeconómico y sanitario:
M. tuberculosis (Mtb)
M. canettii
M. africanum
M. microti
M. pinnipedii
M. orygis
M. mungi
M. caprae (Mca)
M. bovis (Mbo)
 Subespecies de M. avium:
M. avium subsp. avium (Maa)
M. avium subsp. silvaticum (Mas)
M. avium subsp. hominissuis (Mah)
M. avium subsp. paratuberculosis (Map)
Todas capaces
de infectar al
ser humano!!!
TB en humanos (TBh).
TB bovina, caprina
o animal (TBa).
Espectro de hospedadores
más amplio del MTC.
TB aviar y otras.
Infecciones variadas en cerdo y otros.
Infecciones respiratorias, linfadenitis
e infecciones sistémicas en humano.
Paratuberculosis de rumiantes.
Asociada a Crohn y otras autoinmunes.

Animales
domésticos
Personas (inmunocomprometidas
o inmunocompetentes)
Otras
fuentes Fauna
silvestre
Introducción
Circulación de cepas
“Se estima que la
importancia
epidemiológica de
la interrelación
entre fauna salvaje,
animales
domésticos y el
humano aumente
considerablemente
junto con el
crecimiento de la
población humana”
(Miller M y cols. 2013. One
Health in the shrinking world:
experiences with
tuberculosis at the human-
livestock-wildlife interface.
Comp Immunol. Microbiol.
Infect. Dis. 36:263-268)

Enmarcado en el proyecto:
MYCOZOON:
“Desarrollo de nuevos métodos moleculares para la
detección e identificación de micobacterias
responsables de zoonosis en productos ganaderos”
(PI2011-50; Departamento de Educación,
Univesidades e Investigación del Gobierno Vasco)
Participantes (NEIKER):
Elena Molina, Natalia Elguezabal, Joseba M. Garrido, Patricia Vázquez
Ramón A. Juste, Iker Agirregomoskorta Sevilla
OBJETIVO:
Crear una estrategia basada en biología molecular para la detección e
identificación precoz de micobacterias de interés médico y veterinario
causantes de zoonosis a partir de muestras relacionadas con la industria
ganadera o la caza destinadas al consumo humano.
Introducción

¿Por qué este proyecto?
Introducción
 Necesidad de detección e identificación
diagnóstica más ágil:
 Casos sospechosos de TB / PTB
 Casos sospechosos de micobacteriosis sin
definir
 Animales de compañía, de zoológico y
silvestres
 Muestras ambientales y otras
 Identificación de aislamientos
 Técnicas de carácter múltiple para usar en
otros proyectos de investigación:
 Cribado de muestras de explotaciones, de
matadero, silvestres…
 Estudio de la presencia de micobacterias en
la cadena alimentaria
 Estudio de muestras de origen humano
 …

MUESTRAS
cultivo
+
— CULTIVO NEGATIVO
CULTIVO POSITIVO
extracción de DNA
DNA extraído
PCR Género +—
PCR complejo TB
PCR M. avium sp
—
PCR & secuenciación de
16S rRNA/ITS/rpoB…
Otras
Introducción
Spoligotyping
+
PCR RD 1-12
oxyR
pncA
katG
gyrA
gyrB
PCR & secuenciación/REA
MIRU-VNTR
Otras técnicas
IS1311
hsp65
LSP
+ PCR IS1245
PCR IS901
PCR IS900
PCR FR300
PCR DT1
PCR & secuenciación/REA
MIRU-VNTRIdentificación de
grupo, especie
o subespecie
¿Por qué este proyecto?
mucho trabajo
tedioso,
laborioso
y costoso

En esta presentación:
1. Diseño y evaluación de un método para detectar simultáneamente DNA
(PCR cuádruple en tiempo real) del género Mycobacterium (Myc), de M.
avium (Mav) y del complejo M. tuberculosis (MTC), con un control interno
(IAC) que identifica falsos negativos, todo en una única reacción.
2. Diseño y evaluación de un método de detección e identificación basado en
un array de DNA y microesferas marcadas en suspensión (Luminex) para
diferenciar entre las subespecies de Mav y otro para diferenciar entre las
especies del MTC.
3. Análisis de alimentos lácteos y cárnicos obtenidos en el supermercado, por
medio de las técnicas moleculares desarrolladas y de cultivo.
Introducción

un array de DNA y miecroesferas marcadas en suspensión (Luminex) para
especies del MTC.
Introducción

sonda
Myc
(ITS)
sonda
Mav
(IS1311)
sonda
MTC
(devR)
sonda
IAC
MUESTRAS
cultivo
+
— CULTIVO NEGATIVO
CULTIVO POSITIVO
extracción de DNA
— — — — reacción inhibida (INHIBIDA; falso negativo)
— — — + sin presencia de micobacterias (NEGATIVA)
+ — + presencia de al menos Mav (Mav POSITIVA)+
— + + presencia de al menos MTC (MTC POSITIVA)+
+ + + presencia de al menos Mav y MTC (Mav&MTC POSITIVA)+
— — + presencia de micobacterias ≠ Mav y MTC (Myc POSITIVA):
secuenciación 16S rRNA/ITS/rpoB…: Identificación especie
+
DNA extraído
Detección de DNA de Myc, de Mav y del MTC
en UNA SOLA reacción:
PCR MycMavMTC
1. Diseño y evaluación de la PCR cuádruple en tiempo real
3 dianas genómicas + 1 de control = 4 sondas
Diseño

PCR MycMavMTC
Prueba especificidad y sensibilidad analítica
38 cepas de Micobacterias: 28 cepas NO-Micobacterianas:
M. avium subsp. paratuberculosis (K-10f, St 764 cattle, St 22G sheep, 6.1/95 bison) Salmonella enterica serovar Typhimurium (ATCC 13311f)
M. avium subsp. avium (ATCC 25291a, f, St 18f) Salmonella enterica serovar Enteritidis (ATCC 13076f)
M. avium subsp. hominissuis (St 104b, f) Enterococcus faecalis (ATCC 7080f, ATCC 19433f)
M. avium subsp. silvaticum (ATCC 49884a, f) Listeria monocytogenes (ATCC 19111f)
M. tuberculosis (St H37Ra ATCC 25177f, CCUG 37357c, f) Corynebacterium pseudotuberculosis (1452/14)
M. bovis BCG (ATCC 19015g, CCUG 27863 Danishc, f) Nocardia cyriacigeorgica (335710d)
M. bovis (2575/08c, St 1403) Nocardia nova (335633d)
M. caprae (St 1491, 2806/08-1) Nocardia farcinica (334307d)
M. microti (ATCC 11152f) Rhodococcus equi (ATCC 33701e, f)
M. pinnipedii (VV-E-989c, ST593a) Yersinia ruckeri (ATCC29473f)
M. africanum (ST181a) Yersinia pseudotuberculosis (33427-PST-If)
M. intracellulare (GM51b) Leptospira interrogans serovar Hardjo (CC00002 Ames)
M. chimaera (FI1069Tb, f) Actinomyces spp (4894/11)
M. colombiense (16Bb) Clostridium perfringens (NC 13110f)
M. marinum (CECT 7091Tf) Staphylococcus aureus (995/05-17)
M. asiaticum (St 336) Staphylococcus pseudointermedius (5586/11)
M. kansasii (CECT 3030Tf) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853f)
M. gordonae (CECT 3029f) Campylobacter jejuni (ATCC 33560f)
M. chelonae (St 362) Campylobacter lari (ATCC 35221f)
M. flavescens (St 9H) Campylobacter coli (ATCC 33559f)
M. scrofulaceum (St 12H) Escherichia coli (ATCC 11775f, ATCC 25922f, ATCC 35150f)
M. vaccae (ATCC 15483f) Erlichia canis (s/n/14)
M. phlei (ATCC 11758f) Lactobacillus acidophilus (CECT 362f)
M. fortuitum (St ISCIII) Mannheimia haemolytica (5030/12)
M. smegmatis (ATCC 700084f) Leuconostoc mesenteroides (2606/10)
M. genavense (ATCC 51234f)
M. terrae (CECT3028f)
M. abscessus (CECT 8522f, CECT 8534f)
Resultado esperado para todas las cepas
100% especificidad analítica

PCR MycMavMTC
Prueba especificidad y sensibilidad analítica
 Para identificar la cantidad mínima de DNA detectable por la PCR MycMavMTC:
 PCR de diluciones seriadas de DNA puro (10 ng/l) de:
• M. bovis BCG representando a MTC (sonda devR)
• M. avium subsp. hominissuis (Mah) representando a Mav (sonda IS1311)
• M. kansasii representando a género Myc, ≠ Mav y MTC (sonda ITS)
5-50 fg de DNA micobacteriano/reacción

1-10 genomas micobacterianos/reacción

a) Inoculadas con concentraciones decrecientes (7) de una sola cepa de referencia (× 3 cepas):
• M. bovis BCG (por MTC)
de 1,91×106 a 1,91 CFU/g
• M. avium ssp. hominissuis (por Mav)
de 1,59×107 a 1,59×101 CFU/g
• M. kansasii (por Myc)
de 2,46×106 a 2,46 CFU/g
PCR MycMavMTC
Prueba sensibilidad con muestras inoculadas con una especie
concentración (CFU/g)
CULTIVO (MGIT y Coletsos)
y
PCR MycMavMTC

PCR MycMavMtc
ITSdenak probe IS1311 probe devR probe Cultureb
Cepa inoculada CFU/g mean CT (SD) PRa mean CT (SD) PR mean CT (SD) PR BACTEC Coletsos
M. bovis BCG 1.91×106 24.37 (0.49) 3 UD 0 21.9 (0.09) 3 P P
1.91×105 28.41 (0.15) 3 UD 0 25.78 (0.15) 3 P P
1.91×104 32.47 (0.08) 3 UD 0 26.69 (0.12) 3 P P
1.91×103 36.95 (0.22) 3 UD 0 33.08 (0.42) 3 P P
1.91×102 UDc 0 UD 0 38.58 (0) 1 P N
1.91×101 UD 0 UD 0 UD 0 N N
1.91 UD 0 UD 0 UD 0 N N
M. avium subsp. hominissuis 1.59×107 23.55 (0.28) 3 18.26 (0.19) 3 UD 0 P P
1.59×106 27.16 (0.18) 3 21.86 (0.34) 3 UD 0 P P
1.59×105 31.47 (0.33) 3 26.24 (0.44) 3 UD 0 P P
1.59×104 35.20 (1.03) 3 28.42 (0.28) 3 UD 0 P P
1.59×103 43.10 (0) 1 33.51 (0.49) 3 UD 0 P N
1.59×102 UD 0 37.52 (0.54) 3 UD 0 P N
1.59×101 UD 0 UD 0 UD 0 N N
M. kansasii 2.46×106 25.23 (0.33) 3 UD 0 UD 0 P P
2.46×105 28.38 (0.09) 3 UD 0 UD 0 P P
2.46×104 32.12 (0.06) 3 UD 0 UD 0 P P
2.46×103 35.88 (0.55) 3 UD 0 UD 0 P P
2.46×102 UD 0 UD 0 UD 0 P N
2.46×101 UD 0 UD 0 UD 0 N N
2.46 UD 0 UD 0 UD 0 N N
a) Inoculadas con concentraciones decrecientes (7) de una sola cepa de referencia (× 3 cepas)
:
PCR MycMavMTC
Prueba sensibilidad con muestras inoculadas
Límite de detección en muestras de tejido inoculado
100-1.000 CFUs/g
Similar al cultivo MGIT-BACTEC
Mejor que el cultivo en Coletsos

a) Inoculadas con combinaciones de diferentes concentraciones de M. bovis BCG y M.
avium subsp. hominissuis (Mah) imitando coinfección con Mav y MTC (36 muestras en
total):
PCR MycMavMTC
Prueba sensibilidad con muestras inoculadas con una mezcla de Mav y MTC
M. bovis
CFU/g
Mah CFU/g
1,59×106 1,59×101
1,91×105
1,91
Sólo
PCR MycMavMTC

PCR MycMavMTC
Prueba sensibilidad con muestras inoculadas
b) Inoculadas con mezclas de M. bovis BCG y Mah imitando coinfección por Mav y MTC
M. avium subsp. hominissuisCFU/g
1.59×106 1.59×105 1.59×104 1.59×103 1.59×102 1.59×101
M. bovis
BCG CFU/g probe
mean CT
(SD) PRa
mean CT
(SD) PR
mean CT
(SD) PR
mean CT
(SD) PR
mean CT
(SD) PR
mean CT
(SD) PR
1.91×105 ITSdenak 27.89 (0.50) 3 29.28 (0.34) 3 29.12 (0.06) 3 29.97 (0.44) 3 28.65 (0.22) 3 29.07 (0.16) 3
IS1311 23.11 (0.52) 3 27.15 (0.35) 3 30.07 (0.64) 3 35.38 (0.81) 3 41.12 (0) 1 UD 0
devR 26.78 (0.92) 3 26.68 (1.46) 3 26.58 (0.49) 3 26.24 (0.42) 3 26.08 (0.06) 3 26.11 (0.16) 3
1.91×104 ITSdenak 28.13 (0.15) 3 31.28 (0.51) 3 31.68 (0.53) 3 32.17 (0.88) 3 32.46 (0.39) 3 34.23 (2.06) 3
IS1311 23.17 (0.17) 3 26.93 (0.38) 3 29.44 (0.04) 3 35.57 (1.81) 3 40.95 (0) 1 UD 0
devR 29.74 (0.30) 3 30.09 (1.15) 3 29.29 (0.73) 3 29.46 (1.04) 3 29.93 (0.76) 3 30.67 (0.15) 3
1.91×103 ITSdenak 28.62 (0.33) 3 31.47 (0.72) 3 34.90 (0.18) 3 36.50 (0.31) 3 36.92 (1.94) 2 38.55 (0.04) 0
IS1311 23.15 (0.75) 3 26.47 (0.52) 3 29.78 (0.12) 3 33.14 (0.01) 3 38.54 (1.53) 3 UD 0
devR 39.52 (0.68) 3 33.54 (0.74) 3 33.47 (0.16) 3 33.27 (0.03) 3 33.25 (0.45) 3 33.76 (0.35) 3
1.91×102 ITSdenak 28.58 (0.29) 3 32.85 (0.22) 3 38.29 (0.64) 0 42.77 (0) 1 UD 0 UD 0
IS1311 23.51 (0.52) 3 27.68 (0.30) 3 31.56 (0.71) 3 33.12 (0.30) 3 37.49 (3.33) 3 UD 0
devR UDb 0 39.78 (0) 1 UD 0 39.42 (0) 1 UD 0 UD 0
1.91×101 ITSdenak 28.57 (0.01) 3 33.58 (0.42) 3 36.69 (1.24) 0 40.22 (0.82) 0 UD 0 UD 0
IS1311 23.45 (0.02) 3 27.93 (0.34) 3 29.85 (0.08) 3 32.96 (0.60) 3 35.51 (3.83) 3 UD 0
devR UD 0 UD 0 UD 0 UD 0 UD 0 UD 0
1.91 ITSdenak 28.78 (0.24) 3 32.64 (0.67) 3 37.19 (1.71) 0 42.39 0 UD 0 UD 0
IS1311 23.69 (0.06) 3 27.49 (0.71) 3 29.74 (0.94) 3 34.42 (0.59) 3 35.76 (1.68) 3 UD 0
devR UD 0 UD 0 UD 0 UD 0 UD 0 UD 0
Se mantiene el límite de detección
incluso
en infecciones mixtas

a) 231 muestras clínicas de tejido y leche con resultado previo de CULTIVO e
IDENTIFICACIÓN por varias PCRs.
b) 147 aislamientos clínicos (obtenidos en MGIT, M7H10, HEYM, LJ, Coletsos)
previamente IDENTIFICADOS por varias PCRs.
PCR MycMavMTC
Evaluación de la PCR con muestras clínicas de campo

a) 231 muestras clínicas de tejido y leche
PCR MycMavMTC
RESULTADO PREVIO
RESULTADO PCR MycMavMTC Y
CONFIRMACIÓN DE DISCORDANTES
Hospedador
Nº de
muestras Cultivo IDENTIFICACIÓN
ITS denak
(Myc)
IS1311
(Mav)
devR
(MTC) CONFIRMACIÓN
bov, ovi, cap, jab, cér 111 N ninguna N N N
bov, ovi, cap, jab 64 P Map N/P P N
bov, ovi, jab 9 N ninguna N P N Map
bov, jab, cér 26 P M. bovis N/P N P
jab 2 P M. bovis N N N
cap, jab 12 P M. caprae N/P N P
cap 1 P M. caprae P P P M. caprae & Map
cap 1 P M. caprae N N N
jab 1 N ninguna N P N Mah
jab 2 P Mah N P N
cér 1 P Myc sp. P N N M. avium A
cér 1 P Myc sp. P N N Myc sp. B
Sensibilidad = 97,5%
Especificidad = 100%
(Técnica de referencia: resultados previos de cultivo verificados)
*Detección de una coinfección de M. caprae y M. a. paratuberculosis

b) 147 aislamientos clínicos
PCR MycMavMTC
IDENTIFICACIÓN
PREVIA DEL
AISLAMIENTO
RESULTADO PCR MycMavMTC Y
CONFIRMACIÓN DE DISCORDANTES
Hospedador
Nº de
muestras
ITS denak
(Myc)
IS1311
(Mav)
devR
(MTC) CONFIRMACIÓN
bov, ovi, cap 45 Map P P N
bov, ovi, cap, cér, jab, mus,
ave
16 Maa P P N
hum, bov, cér, jab, mus 10 Mah P P N
bov, por, cér, jab, cam 45 M. bovis P N P
hum, bov, cap, cér, jab 25 M. caprae P N P
elefante 1 M. tuberculosis P N P
jab 1 M. bovis P P P M. bovis & Mah
hum, mus 2 M. intracellulare P N N
mus 1 M. gastri P N N
desconocido 1 Myc sp. P N N ≈ M. goodie C
Confirmada la
Especificidad
*Detección de un cultivo mixto

especies del MTC.
2. Diseño y evaluación del sistema Luminex para identificación de sp./ssp.

Mav POSITIVAS en PCR MycMavMTC

Mav-ID PCRyTSPE & LUMINEX
IDENTIFICACIÓN ESPECIE MTC/SUBESPECIE Mav
con Sistema LUMINEX (Diseño)
plataforma LUMINEX
MTC ID1
MTC ID2
MTC ID3
MTC ID4
+
—
+
+
+
+
+
—
+
+
—
—
—
—
—
—
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
—
+
+
+
MTC ID5+ — — —+ + + +
+
+
+
?
?
+
+
+
—
+
MTC ID6— — — —+ + — — — —
MTC ID7+ — — —— + + + + —
IAC MTC+ + + ++ + + + + +
Identificación de
subespecie de Mav
o de especie de MTC
Mav ID1
Mav ID2
Mav ID3
+
—
+
+
—
+
+
—
—
+
—
—
—— —
Mav ID4 + + — + —
Mav ID5 — + + — +
IAC Mav + + + + +
MTC POSITIVAS en PCR MycMavMTC

MTC-ID PCRyTSPE & LUMINEX
M.a.hominissuis
M.a.avium
M.a.silvaticum
M.a.paratuberculosis
M.intracellulare/otras
presencia (+) / ausencia (–) presencia (+) / ausencia (–)
5 dianas +
control interno
de una vez
7 dianas +
control interno
de una vez
M.canettii
M.tuberculosis
M.africanum
M.microti
M.pinnipedii
M.caprae
M.bovis
M.bovisBCG
M.mungi
M.orygis

 Para evaluar el sistema de identificación de subespecies
de M. avium (Mav-ID PCRyTSPE & LUMINEX)
 50 aislamientos clínicos y 80 muestras clínicas
 Para evaluar el sistema de identificación de especies del
Complejo M. tuberculosis (MTC) (MTC-ID PCRyTSPE &
LUMINEX)
 90 aislamientos clínicos y 40 muestras clínicas
 Identificación de la especie/subespecie de todos los aislamientos  Correcta
 Identificación de la especie/subespecie de muestra clínica  Correcta
*Sensibilidad ligeramente inferior que PCR MycMavMTC
(resultados no concluyentes si la carga micobacteriana es muy baja; CT>35-36)
 Identificadas nuevas signaturas genotípicas no descritas
IDENTIFICACIÓN ESPECIE MTC/SUBESPECIE Mav
con Sistema LUMINEX (Evaluación)

especies del MTC.
3. Análisis de productos de supermercado

SIMCAPV
2001-2014
 Motivación del estudio:
 Presencia de micobacterias en:
• Productos de consumo humano
• Recursos hídricos
• …
 Fuente de infección en humano?
 Situación a nivel de consumidor desconocida
 Aumento incidencia NTMs frente a MTC
*(M. bovis también sube)
ESTUDIO DE PRODUCTOS A NIVEL DE CONSUMIDOR
Otras
fuentes
productos

 Planificación del estudio:
 Productos de 5 supermercados habituales:
— leche y derivados lácteos (queso, yogur, mantequilla, nata).
— cárnicos frescos (picadas normal, hamburguesas, salchichas) y derivados cárnicos
(salchichas cocidas, mortadelas, chorizos frescos, patés).
 Dos tandas de muestreo:
— 1ª tanda: 122 productos (67 lácteos y 55 cárnicos).
— 2ª tanda: 135 productos; repetición de la 1ª + 13 extra).
 Extracción de DNA y PCR MycMavMTC.
 Cultivo según protocolos en uso.
 Identificación de especies o subespecies en caso de positivos (Luminex).

 Resultados POSITIVOS de la PCR
MycMavMTC:
→ Presencia de DNA
micobacteriano en 19 muestras de
las 122 analizadas!! un 15,6%
Resultados de la 1ª Tanda
Producto DNA detectado
Queso fresco 1 Mycobacterium sp.
Yogur artesanal 1 Mycobacterium sp.
Salchichas pollo 1 M. avium
Hamburguesa potro 1 M. avium
Mortadela 1 M. avium
Leche polvo desnatada 1 MTC
Leche polvo bebés 1 MTC
Nata 1 MTC
Mantequilla 1 MTC
Mantequilla 2 MTC
Queso fresco 4 MTC
Queso fresco 5 MTC
Queso tierno 1 MTC
Queso cremoso 1 MTC
Yogur cremoso 1 MTC
Yogur cremoso 2 MTC
→ Detectadas al límite (CT>36)  Carga
micobacteriana estimada baja

 Resultados de IDENTIFICACIÓN
de POSITIVOS por el sistema
Luminex:
Yogur artesanal 1 Mycobacterium sp.
Salchichas pollo 1 M. avium
Hamburguesa potro 1 M. avium
Mortadela 1 M. avium
Leche polvo desnatada 1 MTC
Nata 1 MTC
Mantequilla 1 MTC
Mantequilla 2 MTC
Queso fresco 4 MTC
Queso fresco 5 MTC
Queso tierno 1 MTC
Queso cremoso 1 MTC
Yogur cremoso 1 MTC
Yogur cremoso 2 MTC
→ Muy al límite (CT>36) para
considerarse 100% concluyentes
Map, Mah !!??
M. bovis !!??
MycMavMTC:

 Resultados de CULTIVO:
 No se obtuvo ningún aislamiento
 ¿No había micobacterias vivas? ¿Sólo muertas?
 Fallo o falta de sensibilidad de los métodos de cultivo

MycMavMTC:
Leche pasterizada 1 Mycobacterium sp.
Leche polvo desnatada 1 Mycobacterium sp.
Leche polvo bebés 1 Mycobacterium sp.
Queso tierno 1 Mycobacterium sp.
Salchicha cocida 1 Mycobacterium sp.
Chorizo fresco 1 Mycobacterium sp.
Paté de pato 1 Mycobacterium sp.
Leche polvo bebés 2 M. avium
Paté de pato 2 M. avium
Nata 1 MTC
Mantequilla 1 MTC
Yogur cremoso 1 MTC

Leche polvo desnatada 1 Mycobacterium sp.
Leche polvo bebés 1 Mycobacterium sp.
Queso tierno 1 Mycobacterium sp.
Salchicha cocida 1 Mycobacterium sp.
Paté de pato 1 Mycobacterium sp.
Leche polvo bebés 2 M. avium
Paté de pato 2 M. avium
Nata 1 MTC
Mantequilla 1 MTC
Yogur cremoso 1 MTC
 Resultados de IDENTIFICACIÓN
de POSITIVOS por el sistema
Luminex:
→ Muy al límite (CT>36) para
considerarse 100% concluyentes
1 Map + otra subsp
1 M. bovis
MycMavMTC:

 Resultados de CULTIVO (provisional):
 3 cultivos POSITIVOS (el resto negativo):
• M. avium subsp. avium en salchicha fresca de pollo
• M. avium pendiente de caracterizar en carne picada de vacuno
• M. avium pendiente de caracterizar en fórmula de leche para bebés

1) Se ha desarrollado un método rápido para la detección simultánea de DNA del género
Mycobacterium, de M. avium y del Complejo M. tuberculosis (PCR MycMavMTC) altamente
específico y sensible, aplicable a DNA extraído de varios tipos de muestra y de gran utilidad para
el diagnóstico y otros estudios de detección de micobacterias.
2) Se ha desarrollado un sistema múltiple muy específico y sensible capaz de identificar la
subespecie concreta de M. avium (Mav_ID Luminex) o la especie concreta del Complejo M.
tuberculosis (MTC_ID Luminex) previamente detectada por la PCR cuádruple en tiempo real (PCR
MycMavMTC), que puede ser aplicado a DNA extraído de varios tipos de muestra.
Conclusiones generales y observaciones finales
CONCLUSIONES MÁS REMARCABLES DEL PROYECTO

3) Se ha detectado la presencia de DNA de M. avium, del Complejo M. tuberculosis y de otras
micobacterias en el 14% de los alimentos analizados (lácteos y cárnicos), que fueron comprados
en distintos supermercados de nuestra región.
4) Se ha detectado la presencia de M. avium subsp. viable en una salchicha de pollo fresca, en
carne picada de vacuno y en fórmula de leche (en polvo) para bebés.
5) Los resultados obtenidos sugieren que sería interesante evaluar el riesgo que supone para la
salud pública la entrada en la cadena alimentaria de bacterias no recogidas por la legislación.
CONCLUSIONES MÁS REMARCABLES DEL PROYECTO

 Sería de gran interés:
• Optimizar métodos de extracción y cultivo en derivados lácteos.
• Ampliar el estudio e incluir otros alimentos (pescado, verduras, agua, alimentos de
producción ecológica,…).
• Estudiar la relevancia en salud pública de los hallazgos de este proyecto.
OBSERVACIONES FINALES

- Ayuda económica:
• Dpto. de Educación,
Universidades e Investigación,
Gobierno Vasco
• Dpto. de Desarrollo
Económico y Competitividad
(Agricultura, Pesca y Política
Alimentaria) , Gobierno Vasco
ESKERRIK ASKO EMANDAKO LAGUNTZAGATIK!
- Participantes en el proyecto:
Elena Molina
Joseba M. Garrido
Natalia Elguezabal
Patricia Vázquez
Ramón A. Juste
- Colaboraciones:
• Ganaderos y veterinarios y
Diputaciones de Bizkaia,
Gipuzkoa y Araba (y otros)
• Otras personas de NEIKER
• Valentín Pérez y cols.
(Universidad de León)
• Christian Gortázar y cols.
(Instituto de Investigación en
Recursos Cinegéticos)
- Suministro de cepas:
• Maria Laura Boschiroli
(Santé Animale, ANSES, France)
• Maria Jesús García
(Universidad Autónoma de Madrid)
• Beatriz Romero
(VISAVET, Universidad Complutense
de Madrid)
• Emilio Pérez-Trallero
(Hospital Universitario Donostia)
• José Ramos-Vivas
(Hospital Universitario Marqués de
Valdecilla)
ESKERRIK ASKO ZUEN ARRETAGATIK
MUCHAS GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN
- Organizadores de las jornadas:
• Dptos. de Desarrollo
Económico y Competitividad y
de Salud, Gobierno Vasco
• ELIKA fundazioa
• Basque Culinary Center

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