Aula do prof dr Maurício Rodrigues em 2006.

1. Vacinas gênicas
mrodrigues@ecb.epm.br

2. História
 1774- Benjamin Jetsy / Fazendeiro
 The Dorset / England
 Imunizou seus 2 filhos e sua esposa com
“cowpox” a fim de evitar a varíola
 1796- Edward Jenner / Médico
 Gloucestershire / England
 Imunizou uma criança chamada James
Phipps

3. Prevenção
Epidemiologia Patogênese
Imunologia Quimioterapia

4. Importância das vacinas no
controle e erradicação de doenças infecciosas
 Método preventivo
 Redução rápida da transmissão
 Relação benefício-custo alta
 Erradicação da varíola no mundo

5. Características de uma vacina efetiva
 Segura
 Capaz de induzir altos níveis de proteção
 Induzir níveis de proteção duradouros
 Induzir anticorpos neutralizantes
 Induzir linfócitos T efetores
 Baixo custo
 Estabilidade
 Fácil administração
 Poucos ou nenhum efeitos colaterais

6. Efeito da vacinação contra poliomielite no Brasil
Anos (Ministério da Saúde)
1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989
Incidênciadepolimielitepor
100.000habitantes
0
20
40
60
80
100
Coberturadavacina(%)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5

7. Efeito da vacinação contra poliomielite no mundo

8. Composição químicas da vacinas existentes
- Vírus vivos atenuados
- Vírus inativados
- Bactérias vivas atenuadas
- Bactérias mortas
- Toxóides
- Polissacarídeos
- Componentes antigênicos
- obtidos por engenharia genética

9. Vírus vivos atenuados
 Anti-varíola
 Anti-febre amarela
 Anti-caxumba
 Anti-poliomielítica (Oral
Sabin)
 Anti-rubéola
 Anti-sarampo
Vírus inativados
 Anti-poliomielítica
injetável (Salk)
 Anti-rábica
 Anti-Tuberculose (BCG)Bactérias vivas atenuadas
Bactérias mortas
 Anti-colérica
 Anti-coqueluche
 Anti-febre tifóide

10. Toxóides  Anti-tétano
 Anti-diftérica
Polissacarídeos
 Anti-H. influenza do tipo b
 Anti-meningocócica
 Anti-pneumocócica
Componentes
antigênicos obtidos
por engenharia
genética
 Anti-hepatite B

11.  Vantagens
 Múltiplos antígenos
 Simples produção
 Baixo custo relativo
 Desvantagens
 Formulação antigênica
complexa
 Toxicidade
 Resposta imune complexa
Vacinas convencionais

13. Razões que dificultam a geração de uma vacina
contra alguns microrganismos patogênicos
 Ausência de cultura axênica
 Necessidade de grande suprimento de
células humanas para o crescimento in vitro
 Alto custo
 Alto risco

14. Possíveis soluções para a produção de
antígeno vacinas sintéticas
 Peptídios Sintéticos
 Proteínas recombinantes
 Microrganismos geneticamente modificados
 Vacinas de DNA

15. RESEARCH PRIORITIES FOR PRODUCTION OF NEW
AND IMPROVED VACCINES
 hepatitis types A, B, C, and D
 enteric pathogens including rotavirus, shigella, and cholera
 sexually transmitted diseases (genital herpes, gonorrhea, and chlamydia)
 croup and pneumonia in infants and children caused by respiratory
syncytial virus
 AIDS
 respiratory diseases caused by pneumococcus
 group B streptococcus
 influenza
 malaria
 tuberculosis
 Ieprosy

16. Doenças

18. Vacina recombinante ideal
 Múltiplos antígenos
 Antígenos expressos em diferentes fase
do parasito
 Composta de antígenos com um
polimorfismo limitado
 Capaz de induzir múltiplos tipo de
resposta imune protetora
 Alta eficácia e baixo custo

19. Direcionamento da pesquisa
 Determinação dos mecanismos imunológicos de
proteção
 Isolamento dos genes que codificam para
antígenos destes microrganismos
 Identificação de epítopos relevantes e com baixa
variação antigênica entre as cepas

20. E como foram definidos os mecanismos
imunológicos de proteção?
 Transferência passiva de imunidade
 Anticorpos monoclonais
 Clones de linfócitos T CD4 ou CD8

21. PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Sistemas de expressão de proteínas
recombinantes
 Procariotos (E.coli)
 Eucariotos - Leveduras (S. cerevisae)
 Baculovírus

22. Vacina contra hepatite B recombinante
Antígeno S
Purificação
Levedura
Plasmídio
Vacina
Gene ag S
Proteína

23. Antígeno S da Hepatite B
Partícula
Membranosa
Anticorpos

24. Vacinas recombinantes contra a hepatite B
Engerix-B SmithKline Beecham/US
Recombivax HB Merck/US
GenHevac B Pasteur/France
•Mais de 1 bilhão de doses (1982-presente).
•Produzida em leveduras (S. cerevisiae)

25. VÍRUS RECOMBINANTES
Vacinas gênicas
VACINAS DE DNA
Vetores preparados para transferir genes

26. DNA
Vírus
Selvagem
Gene
exógeno
Célula hospedeira
Proteína
recombinante
Vírus
Recombinante
Vírus recombinantes

27. Geração de vírus recombinantes

28. Vírus utilizados
 Vaccinia (vacina contra varíola)
 Influenza (vacina contra gripe)
 Adenovirus (vacina contra infecção por
adenovirus)
 Vírus da Pólio (vacina contra pólio)
 Vírus da febre amarela (vacina contra
febre amarela).

29. Estrutura dos flavivírus
Dímero da proteína do
envelope

30. Modelo estrutural de um dímero da proteína
do envelope do vírus da Febre Amarela
Bonaldo et al. (2002)Epítopos exógeno

31. Estrutura do vírus influenza
hemaglutinina do
vírus da influenza

32. Estrutura do vírus
vaccinia
Estrutura do Adenovírus

33. Formas de inoculação
 Sub-cutânea
 Intra-muscular
 Por via de mucosas

34. Propriedades adjuvantes
 Interferons
 IL-6
 Outros?

35. Imunização com vírus recombinantes
Anticorpos Linfócitos T
CD4 TH1
Linfócitos T
CD8

36. Vírus recombinante
•Já usado como vacina
•Produção em larga escala
•Diversos tipos de resposta
imune
•Grande quantidade de
Informação (vírus de DNA)
•Limitação da quantidade a ser
inoculada
•Limitação da quantidade de
antígeno produzido
•Pouca antigenicidade
Vantagens Desvantagens

37. VACINAS DE DNA
Plasmídio
vetor de
expressão
Gene
exógeno
Promotor forte
Citomegalovírus
Cauda Poli-A

38. Formas de inoculação
 Sub-cutânea
 Intra-muscular
 Por via de mucosas

39. Micro-bombardeamento com partículas (“gene gun”)

40. Microenhancer array

41. Propriedades adjuvantes
 Interferons
 IL-12
 Outros?

42. Núcleo
Proteína
ExógenaCélula hospedeira
Plasmídio epissomal

43. Injeção intra-
muscular de
DNA plasmidal
marcado com
rodamina
DNA plasmidial Núcleo Overlay

44. Expressão da proteína exógena após
imunização intramuscular
b-galactosidase

45. Expressão da proteína exógena após injeção s.c.
GFP
b-galactosidase

46. Imunização com DNA
Anticorpos Linfócitos T
CD4 TH1
Linfócitos T
CD8

47. Vacinas de DNA
 Sem proteína
 Grande quantidade de informação
genética
 Vários tipos de resposta imune
 Produção da proteína “in situ”
 Simples, estável e de baixo custo
relativo
 Sistema novo e pouco
conhecido
 Possibilidade de integração
do vetor de expressão no
genoma
Vantagens Desvantagens

48. Immunização com DNA no homem?
Hepatitis B DNA vaccine induces protective antibody
responses in human non-responders to conventional
vaccination.
Rottinghaus ST, Poland GA, Jacobson RM, Barr LJ, Roy
MJ.
Department of Internal Medicine, Mayo Clinic, 55905,
Rochester, MN, USA
Vaccine. 2003. 21:4604-8.

49. Linfócitos T CD8 ab
Restritas por MHC classe I
1996
Nobel Prize of Medicine:
Peter C. Doherty and
Rolf Zinkernagel
Citotóxicos para células infectadas por vírus

50. MCH classe I + peptídeo MCH classe II + peptídeo
Linfócitos T CD8 ab Linfócitos T CD4 ab

51. Cutting edge:
CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their
proliferative responses.
Foulds KE, Zenewicz LA, Shedlock DJ, Jiang J, Troy
AE, Shen H.
J Immunol. 2002 Feb 15;168(4):1528-32.
Linfócitos T CD8 proliferam e se
diferenciam mais rápido que
linfócitos T CD4

52. 107 linfócitos T CD8
específicos por baço
105 linfócitos T CD4
específicos por baço
Durante a infecção experimental por LCMV

53. Durante a infecção experimental por LCMV
Células CD8 de memória

54. Apoptose da célula alvo infectada
Mecanismos efetores mediados por linfócitos T CD8
Lise da célula alvo infectada
Secreção de linfocinas (Interferon-g, TNF, quimiocinas, etc.)

55. Vírus (HIV, etc)
Patógenos cuja a imunidade mediada por CD8 é crítica
Bactérias (M. tuberculosis, etc.)
Protozoários intracelulares
(Plasmodium, T. cruzi, Toxoplasma)

56. Vírus HIV
Gag
PolGenoma viral
Env

57. Diferentes estratégias para a indução
de linfócitos T CD8 específicos
 Vírus Recombinante
(DNA or RNA)
 DNA plasmidial
 Combinação
(prime-boost heterólogo)

58. Rodrigues et al., 1994 and Miyahiara et al., 1995
ELISPOT for detection of peptide-specifc CD8 T cells.

59. Tetramer/Pentamer staining for
detection of peptide-specifc CD8 T cells

60.  D=DNA plasmidial
 V=Vaccinia
 A=Adenovírus

61. Prime-boost heterólogo e ativação de linf. T CD8

62. DNA plasmidial
Vaccinia recombinante : MVA
DNA plasmidial +CRL (adjuvante)
Adenovirus (Ad5) recombinante
DNA plasmidial +MPL (adjuvante)
DNA plasmidial +CRL / Ad5
DNA plasmidial +CRL / MVA
 Vírus Recombinante
(DNA)
 DNA plasmidial
 Combinação
(prime-boost heterólogo)
Vacinação experimental de macacos contra a
infecção por SHIV

63. DNA MVA
DNA+CRL Ad5
DNA+MPL
DNA+CRL / Ad5DNA+CRL / MVA
Freqüência de linfócitos T CD8 específicos

64. Céls. CD4 RNA Viral no Plasma
Controle
DNA
DNA+CRL
DNA+MPL
MVA
Ad5
Control
DNA+CRL/MVA
DNA+CRL/Ad5

65. DNA MVA SHIV DNA MVA SHIV
Carga viral (RNA no plasma) Contagem de CD4 no sangue
Controles
Controles
Desafio = intrarrectal

66. A Randomised, Double-Blind, Controlled Vaccine Efficacy
Trial of DNA/MVA ME-TRAPAgainst Malaria Infection in
Gambian Adults
Vasee S. Moorthy, Egeruan B. Imoukhuede, Paul Milligan, Kalifa Bojang, Sheila Keating, Pauline Kaye, Margaret
Pinder, Sarah C. Gilbert, Gijs Walraven, Brian M. Greenwood, Adrian S. V. Hill.
http://www.malaria-vaccines.org.uk/

67. Recombinant virus against malaria
(Clinical trials = humans)
2005

68. http://www.vacinashiv.unifesp.br/

69. Conclusões
 Conhecimento básico para o desenvolvimento de vacinas
recombinantes
 Conhecimento importante dos mecanismos imuno-protetores
contra microrganismos patogênicos
 Já existe várias vacinas comerciais contra hepatite B
 Existem várias vacinas recombinantes sendo testadas.
Os estudos para o desenvolvimento de vacinas
recombinantes têm trazido: