1. REAÇÃO DA POLIMERASE
EM CADEIA - PCR
Polymerase Chain Reaction

2. O QUE É PCR?
 É uma metodologia que se baseia na
amplificação exponencial seletiva de uma
quantidade reduzida de DNA de uma
única célula, sem o uso de um organismo
vivo.

3. HISTÓRICO
 Karys Mullis descreveu a PCR no final da
década de 1980.
 Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer
Corporation patenteou este processo .
 O Prêmio Nobel da Química foi atribuído à
Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.
 Atualmente, método PCR é usado
habitualmente nos laboratórios de investigação
médica e biológica para uma variedade de
tarefas.

4. PARA QUE SERVE A PCR?
 Diagnóstico médico;
 Mapeamento genético;
 Detecção de doenças hereditárias;
 Clonagem de genes;
 Testes de paternidade;
 Criação de organismos transgênicos;

5. PARA QUE SERVE A PCR?
 Medicina Forense:
 pequenas amostras de DNA retiradas da
cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas
de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até
mesmo a minúscula quantidade de DNA
deixada em uma impressão digital) são
amplificadas para serem analisadas pelo
método de fingerprinting.

6. PROCEDIMENTOS
 Devem ser realizados com o maior cuidado para
evitar contaminações que possam alterar o
resultado.
 Em primeiro lugar, deve-se extrair o material
genético da célula ou outro material a ser
estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem
danificá-lo.(Normalmente o material extraído é o
DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA
(ARN) em uma RT-PCR que é um
desdobramento da PCR e possui outras
aplicações).

7. PROCEDIMENTOS:
 Após a extração do DNA, adiciona-se uma
mistura (conhecida como pré-mix) que
contém:
 dNTPs
 Primers (ou iniciadores)
 Solução Tampão.
 Enzima Taq DNA polimerase

8. Taq DNA polimerase
 A Taq DNA polimerase, também denominada
Taq polimerase ou apenas Taq, é uma DNA
polimerase termoestável, utilizada na
amplificação de fragmentos de DNA através da
técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido
identificada pela primeira vez na bactéria
Thermus aquaticus, encontrada em fontes
hidrotermais. A Taq polimerase suporta as
elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo
uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a
94ºC).

9. PROCEDIMENTOS
 Toda esta mistura é colocada no
termociclador, o qual faz ciclos de
temperatura pré-estabelecidos com
tempos exatos específicos para cada
reação (fragmento a ser amplificado).

10. TERMOCICLADOR

11. PROCEDIMENTOS
 O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre
em três fases:
 Fase de Desnaturação (94-96ºC)
 Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)
 Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)

12. Fase de Desnaturação
 a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por
pouco tempo para que haja a separação
da dupla cadeia de DNA (Desnaturação)
através da quebra das pontes de
hidrogênio, dando origem a duas fitas
simples de DNA sobre as quais a síntese
posteriormente vai ocorrer

13. Fase de hibridização ou
anelamento
 a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC
dependendo da quantidade de C e G
encontrada no primer, para que os primers
se anelem (pareiem) com a fita molde de
DNA (anelamento).

14. Fase de Extensão do DNA
 a temperatura é elevada a 72ºC para que
a enzima taq-polimerase possa funcionar
sintetizando a nova molécula (extensão),
em seguida um novo ciclo é iniciado.

15. PROCEDIMENTOS
 O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.
 Duas cadeias são sintetizadas a partir de
cada cadeia molde em cada ciclo
completo de PCR, o que dá um
crescimento EXPONENCIAL, havendo ao
fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do
que no início.

16. RESULTADOS
Nº de Ciclos Nº de Cópias
1 2
2 4
3 8
6 64
20 1.048.576
30 1.073.741.824

17. RESULTADOS
 O resultado é analisado através de uma
eletroforese em gel de agarose ou de
poliacrilamida e depois é interpretado com
a ajuda de um profissional competente.

18. VANTAGENS
 Capacidade de amplificar uma sequência
precisa de DNA.
 Simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e
especificidade.
 Não é necessário isolar o DNA que se pretende
amplificar, mesmo que se encontre misturado
com o DNA de outras espécies, uma vez que os
primers definirão a especificidade.
 Técnica rápida, barata e segura.

19. LIMITAÇÕES
 Necessidade de conhecer a sequência de
DNA a amplificar para sintetizar primers
específicos.
 Relativa facilidade com que ocorre a
contaminação por DNA estranho.
 Limitada extensão da sequência.
 Incorporação errônea de bases durante a
replicação.

20. VARIAÇÕES DA TÉCNICA
BÁSICA DE PCR
 Nested PCR
 Hot Start
 Real time PCR
 RAPD-PCR
 Entre outras...

21. Nested PCR
 Para melhorar a especificidade e a
eficiência da reação, o segmento
genômico é amplificado primeiro de forma
abrangente, copiando até mesmo
seqüências localizadas fora dela, e
utilizando-se este primeiro produto, segue-
se à amplificação da real sequência-alvo.

22. Hot Start
 Variação da PCR onde a reação de
amplificação é iniciada a temperaturas
elevadas.
 Atividade da Taq DNA polimerase é
inibida durante a preparação da reação
 evitando a amplificação de produtos
inespecíficos,aumentando a
especificidade e melhorando o rendimento
da reação.

23. Real time PCR
 PCR em tempo real compreende uma
amplificação convencional de DNA, porém
a detecção do resultado é feita a longo
dos ciclos através de marcadores.
 O risco de contaminação se torna menor.

24. RAPD-PCR
 Consiste na amplificação randômica do
DNA, por um par de iniciadores de baixa
especificidade para com o DNA molde,
gerando assim anelamentos inespecíficos.
 Essa técnica permite a tipagem do
genoma de microorganismos,
possibilitando sua comparação entre
isolados de amostras clínicas.

25. BIBLIOGRAFIA
 http://virtual.unipar.br/courses/GMBM/doc
ument/aula-PCR-
MESTRADO.pdf?cidReq=GMBM
 http://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htm
 http://pt.wikipedia.org/wiki/PCR

26. OBRIGADO!!!