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Université Victor Segalen Bordeaux 2

Année 2010

                                                                                                       Thèse n°

                                                  THÈSE
                                                     pour le

           DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2
                             Mention : Sciences Biologiques et Médicales

                                          Option : Biologie-Santé


                                  Présentée et soutenue publiquement

                                         Le 20 Décembre 2010

                                      Par Fabien LABROUSSAA

                           Né le 15 Mars 1984 à Pau (Pyrénées-Atlantiques)




        INTERACTIONS ENTRE SPIROPLASMA CITRI
   ET SON INSECTE VECTEUR CIRCULIFER HAEMATOCEPS

   La phosphoglycérate kinase de S. citri : une « actin-binding protein »
      impliquée dans la transmission du spiroplasme par la cicadelle


Membres du Jury


M. BONNEU M., Professeur à l’IPB ENSTBB de Bordeaux ............................ Président
Mme. BRAULT V., Directrice de Recherche à l’INRA de Colmar ................... Rapporteur
M. HEDDI A., Professeur à l’INSA de Lyon ..................................................... Rapporteur
Mme. MARZACHI C., Chercheur à l’Institut de Virologie Végétale de Turin . Examinateur
M. LANDRY M., Professeur à l’Université de Bordeaux 2 ............................... Examinateur
Mme. SAILLARD C., Maître de Conférence à l’Université de Bordeaux 2                            Directrice de thèse
THÈSE
                                   pour le

     DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2
                 Mention : Sciences Biologiques et Médicales

                           Option : Biologie-Santé


                    Présentée et soutenue publiquement

                          Le 20 Décembre 2010

                       Par Fabien LABROUSSAA

               Né le 15 Mars 1984 à Pau (Pyrénées-Atlantiques)




     INTERACTIONS ENTRE SPIROPLASMA CITRI
ET SON INSECTE VECTEUR CIRCULIFER HAEMATOCEPS




La phosphoglycérate kinase de S. citri : une « actin-binding protein »
   impliquée dans la transmission du spiroplasme par la cicadelle
A mon père
Remerciements

          Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de l’Unité Mixte de Recherche 1090 Génomique et Diversité
du Pouvoir Pathogène (Institut National de la Recherche Agronomique et Université Victor Ségalen Bordeaux
2), dirigé par Mr Alain Blanchard, sous la direction de Mme Colette Saillard.

        Je tiens tout d’abord à remercier Mr Blanchard pour m’avoir permis de réaliser ma thèse, ainsi que mes
précédents stages de Master 1 et 2, dans son laboratoire.

         Je souhaite également remercier Mr Bonneu de me faire l’honneur de présider ce jury.

       Je tiens à adresser mes plus sincères remerciements à Mme V. Brault et Mr A. Heddi d’avoir accepté
d’examiner et de juger ce manuscrit.

         Je remercie également Mme C. Marzachi et Mr M. Landry d’avoir accepté de participer à ce jury de
thèse.

          Un grand merci à Colette pour m’avoir accompagné pendant ces quatre dernières années. Merci pour
son encadrement de chaque instant, pour m’avoir laissé la liberté de m’exprimer pleinement dans mon travail.
Merci également pour les nombreuses heures passées à la correction de ce manuscrit et aussi lors de chacune de
mes présentations orales. Si ces années de thèse ont été un réel plaisir pour moi, c’est en grande partie grâce à
elle. J’espère que si j’avais à être le dernier thésard de ta carrière, j’aurais été à la hauteur de mes prédécesseurs.

        J’adresse aussi un grand merci à Joël et Sybille pour leur encadrement pendant mon stage de M1. Merci
à Joël pour toutes les discussions scientifiques ou non, très utiles tout au long de ces années. Merci à Sybille
pour son encadrement et sa rigueur qui m’ont apporté toutes les bases indispensables au travail de laboratoire.
Merci à vous deux pour votre soutien.

        Je tiens à remercier Marie-Pierre pour sa formidable gentillesse et sa disponibilité sans failles. Merci
pour m’avoir formé à toutes les techniques de Protéomique. Merci aussi pour m’avoir épargné de nombreuses
taches chronophages (commandes, micro-injections des insectes, solutions, etc…).

         J’adresse un grand merci à Nathalie, ma nouvelle voisine de bureau, pour tout ce temps consacré aux
manips de microscopie confocale. Merci aussi pour les cellules de Circulifer haematoceps. Mon travail n’aurait
pas été le même sans le tien. Promis ! A la fin de ma thèse, je te donne mon bureau que tu jalouses depuis ces
derniers mois !

         Je remercie énormément Laure, une des rares personnes au monde à se battre pour faire des tests
statistiques ! Merçi d’avoir consacrer du temps à l’éveil d’un néo-biochimiste. Je remercie ici une source
intarissable d’idées, de conseils et de connaissances dans de nombreux domaines scientifiques.

         Je tiens également à remercier Michel Castroviejo pour avoir accepté de me prêter pour quelques heures
tous ses appareils de chromato mais aussi pour sa gentillesse au cours de chacune de mes visites.

        Un grand Merci collectif et sincère à tout le labo « Molli ».
Aux « IPPistes », Pascal SP, Claire et Guillaume et pour le travail sur Mycoplasma mycoïdes.
A toute l’équipe « Phyto » au sens large : Xavier, Sylvie, Delphine, Anne, Gulnara, Sandrine, Christophe, Jam,
Pascal S et Jean-Luc.
A Jacqueline pour ces conseils et pour tous les autoclavages réalisés en « urgence ».

                                                          3
Aux « serristes », Kaelig et Denis, pour s’occuper de toutes nos bizarreries, pour leurs connaissances pour le
secours et le dépannage d’appareils défectueux, sans oublier leurs talents pour le barbecue ! Vous êtes dignes de
votre illustre prédécesseur, Patrick, que je remercie également sincèrement pour son travail et sa personnalité.
Aux secrétaires, Evelyne et Isa, pour leurs disponibilités et leurs sourires. Peut-être que j’arriverais un jour à
vous pardonner pour les pérégrinations italiennes….

Merci aussi à Marc, Laure, Clothilde et Cédric pour les moments « détente » : pause-café, Sodexo et quelques
soirées. Je me souviendrais encore longtemps des discussions non-scientifiques improbables et variées qui
animaient ces moments-là. Merci à Marc pour m’avoir enseigné tous les secrets du « Bob Whitcomb Award » !
J’ai une pleine bacholle de souvenirs, y’en aura de reste !

         Je tiens à remercier Suzann pour avoir mis à ma disposition ses indéniables talents artistiques pour le
dessin de Circulifer haematoceps. J’espère arriver à le mettre aussi bien en valeur que ce qu’il le mérite. Toutes
les brèves discussions de fin d’après-midi étaient un réel plaisir.

        Je remercie également Lise et Laura pour leur travail au cours de leurs stages de M1. Bonne chance à
vous pour la suite.

         Anne, Claire et Jam, compagnons de thèse, une pensée spéciale pour vous. Bonne chance pour la suite et
j’espère qu’on aura la chance de se revoir plus tard dans quelques congrès sur quelques îles paradisiaques….

        En résumé, un grand merci à vous tous qui m’avait permis d’évoluer dans un cadre agréable et propice
au travail et fait de ma thèse une superbe expérience et un tremplin pour ma carrière.

         Assez parlé travail !
         Je remercie, du fond du cœur, mes parents qui m’ont toujours permis d’étudier en toute sérénité. Merci
pour l’intérêt que vous avez toujours porté à mes études. Je vous en serais éternellement reconnaissant.

         Je remercie toute ma « famille ». Merci de votre soutien pendant toutes ces années et de m’avoir permis
de m’échapper du monde de la Recherche à chaque fois. Yves, Marie-Lucienne, Ben, Carole, Arnaud (compagnon
de galère…Courage !) et Poys, merci de m’avoir accueilli dans votre tribu et fait partager de si bons moments.

        Un grand merci à tous mes amis et plus particulièrement Flo, Céc, David, Camille et Lio. Que ce soit à
Paris, Brive, Seignosse ou Pau, il y avait toujours une bonne excuse pour fêter quelque chose ! Bonne nouvelle,
voilà une nouvelle raison de faire la fête !

         Même si mes recherches restent relativement floues et obscures pour beaucoup d’entre vous, je n’aurais
rien réussi sans vous !

         Une dernière pensée toute particulière pour Marie qui m’a supporté avant la thèse, pendant ma thèse
(miracle !) et qui, j’espère, me supportera encore de longues années après.




                                                        4
Liste des publications et des communications à des congrès

Labroussaa, F.; Dubrana, M.P., Béven, L., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C.
A minimal actin-binding region of the S.citri phosphoglycerate kinase is implicated in the
transmission process by the insect vector Circulifer haematoceps.
Soumis à publication à Applied and Environmental Microbiology .

Labroussaa, F. ; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C.
Entry of Spiroplasma citri into Circulifer haematoceps cells involves interaction between
spiroplasma phosphoglycerate kinase and leafhopper actin.
Applied and Environmental Microbiology. 2010, 76(6); 1879-1886.




Labroussaa, F., Arricau-Bouvery, N., Breton, M., Dubrana, M.P., Duret, S., Bové, J.M.,
Renaudin, J. & Saillard, C*.
Transmission of the phytopathogenic mollicute “Spiroplasma citri” by its leafhopper vector
“Circulifer haematoceps” involves plasmid-encoded determinants and phosphoglycerate kinase
protein from the spiroplasma.
18th Conference of the International Oraganization of Citrus Virologists (IOCV), 8-12/11/2010,
Campiñas (Brésil). COMMUNICATION ORALE.

Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P., Béven, L., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C.
Deciphering the role of the Spiroplasma citri phosphoglycerate kinase in the internalization into
its insect vector cells.
16ème colloque Biologie de l’Insecte, 18-20/09/2010, Lyon. COMMUNICATION ORALE.

Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C.
Interactions between Spiroplasma citri and its insect vector Circulifer haematoceps: the dual role
of the phosphoglycerate kinase.
18ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM), 11-16/07/2010,
Chianciano (Italie). COMMUNICATION ORALE récompensée par le prix Robert Whitcomb.

Béven, L., Bouyssou, G., Charenton, C., Dautant, A., Labroussaa, F., Sköllermo, A., Perrson,
A., Blanchard, A. & Sirand-Pugnet, P.
Putative membrane ATPase of mycoplasmas: a specific evolution of ATP synthase F1 subunit.
18ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM), 11-16/07/2010,
Chianciano (Italie). POSTER.

Labroussaa, F.*; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C.
Transmission de S.citri par son insecte vecteur: rôle de la phosphoglycérate kinase dans
l’invasion des cellules de l’hôte.
10ème Journée scientifique de l'Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé; 28/04/2010;
Arcachon. POSTER.

Labroussaa, F.*; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C.
Interactions entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur, la cicadelle Circulifer haematoceps : le
double jeu de la phosphoglycérate kinase.
9ème Rencontres Plantes-Bactéries ; 18-22/01/2010, Aussois. COMMUNICATION ORALE.

                                                 5
Labroussaa, F. ; Arricau-Bouvery, N.*; Dubrana, M.P. & Saillard, C.
La phosphoglycérate kinase inhibe l'internalisation de Spiroplasma citri dans les cellules en
culture de son insecte vecteur Circulifer haematoceps.
Congrès IMMUNINV; 21-23/10/2009; Poitiers. COMMUNICATION ORALE.

Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P. ; Saillard, C. & Arricau-Bouvery, N.
Interactions protéine-protéine entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer
haematoceps.
1ère Journées des doctorants du Département SPE, 2-3/09/2009, Rennes. COMMUNICATION
ORALE.

Labroussaa, F. ; Dubrana, M.P. ; Saillard, C. & Arricau-Bouvery, N*.
La phosphoglycérate kinase de Spiroplasma citri, une actin-binding protein impliquée dans
l'internalisation du spiroplasme dans les cellules de son insecte vecteur.
7ème Colloque national de la Société Française de Phytopathologie (SFP); 08-11/06/2009; Lyon.
COMMUNICATION ORALE.

Labroussaa, F.*; Dubrana-Ourabah, M.P. ; Bouvery, N. & Saillard, C.
Interaction protéines-protéines entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer
haematoceps : identification de protéines d'insectes potentiellement impliquées dans la
transmission.
9ème Journée scientifique de l'Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé; 08/04/2009;
Arcachon. POSTER.

Labroussaa, F.*; Dubrana-Ourabah, M.P. ; Bouvery, N. & Saillard, C.
Mise en évidence chez la cicadelle Circulifer haematoceps, de protéines potentiellement
impliquées dans la transmission de Spiroplasma citri.
8ème Rencontres Plantes-Bactéries ; 14-18/01/2008; Aussois. COMMUNICATION ORALE
récompensée par le prix de la meilleure communication orale.

Labroussaa, F. ; Bouvery, N. ; Dubrana-Ourabah, M.P. & Saillard, C*.
Interaction between Spiroplasma citri and the actin cytoskeleton of its insect vector's salivary
gland cells.
17ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM); 06-11/07/2008;
Tianjin (Chine). COMMUNICATION ORALE.

Labroussaa, F. ; Dubrana-Ourabah, M.P.*; Bouvery, N. & Saillard, C.
Interaction protéines-protéines entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer
haematoceps : identification de protéines d'insectes potentiellement impliquées dans la
transmission.
7ème Rencontre francophone de Mycoplasmologie; 17-18/07/2007; Lyon. COMMUNICATION
ORALE.

Bouvery, N.*; Labroussaa, F. ; Martin, E. ; Dubrana, M.P. ; Renaudin, J. & Saillard, C.
Interaction entre les protéines de Spiroplasma citri et celles du cytosquelette des cellules des
glandes salivaires de son insecte vecteur Circulifer haematoceps.
15ème Colloque Physiologie de l'Insecte; 09-11/07/2007; Rennes. COMMUNICATION ORALE.

* auteur qui a présenté la communication ou le poster.


                                                6
Table des matières
INTRODUCTION

I.   Les mollicutes .................................................................................................................. 12
   1. Taxonomie......................................................................................................................... 12
   2. Phylogénie......................................................................................................................... 13
   3. Evolution et caractéristiques importantes ......................................................................... 13
II. Mollicutes phytopathogènes............................................................................................. 14
   1. Phytoplasmes..................................................................................................................... 15
   2. Spiroplasmes phytopathogènes ......................................................................................... 16
     2.1.     Spiroplasma phoeniceum et Spiroplasma kunkelii.................................................... 16
     2.2.     Spiroplasma citri ....................................................................................................... 17
        2.2.1.     Description de la maladie et mise en culture..................................................... 17
        2.2.2.     Caractéristiques de S. citri................................................................................. 18
        2.2.3.     S. citri, un organisme modèle pour l’élaboration d’outils génétiques............... 19
III. Transmission de microorganismes intracellulaires .......................................................... 21
   1. Transmission par insecte vecteur ...................................................................................... 21
     1.1.     Relation entre le microorganisme et son insecte ....................................................... 21
        1.1.1.     Transmission externe......................................................................................... 21
        1.1.2.     Transmission intracellulaire .............................................................................. 21
        1.1.3.     Relation entre les spiroplasmes et leurs insectes............................................... 22
     1.2.     Insectes vecteurs........................................................................................................ 23
        1.2.1.     Vecteurs mollicutes phytopathogènes ............................................................... 23
           1.2.1.1. Classification................................................................................................. 23
           1.2.1.2. Vecteurs de S. citri ........................................................................................ 23
           1.2.1.3. Morphologie des cicadelles ........................................................................... 24
        1.2.2.     Circuit du spiroplasme dans l’insecte................................................................ 25
   2. Cycle cellulaire de la transmission.................................................................................... 26
     2.1.     Adhésion.................................................................................................................... 27
        2.1.1.     Adhésines de type fibrillaire ............................................................................. 27
           2.1.1.1. Bactéries à Gram-négatif............................................................................... 27
           2.1.1.2. Bactéries à Gram-positif................................................................................ 29
        2.1.2.     Adhésines de type non-fibrillaire ...................................................................... 30
           2.1.2.1. Autotransporteurs .......................................................................................... 30
           2.1.2.2. Effecteur Tir (translocated intimin receptor) ................................................ 30
           2.1.2.3. Hémagglutinine filamenteuse (FHA) ............................................................ 31
           2.1.2.4. Système de sécrétion de type 3 (SSTT) ........................................................ 31
        2.1.3.     Adhésion chez les mollicutes ............................................................................ 33
           2.1.3.1. Mycoplasmes................................................................................................. 33
           2.1.3.2. Phytoplasmes................................................................................................. 33
           2.1.3.3. Spiroplasmes ................................................................................................. 35
     2.2.    Internalisation............................................................................................................ 35
        2.2.1.     Voie clathrine-dépendante................................................................................. 35
        2.2.2.     Phagocytose....................................................................................................... 36
          2.2.2.1. « Zipper » mécanisme ................................................................................... 36
          2.2.2.2. « Trigger » mécanisme.................................................................................. 37
          2.2.2.3. Voie dépendante des microtubules................................................................ 37
        2.2.3.     Mycoplasmes..................................................................................................... 38
       2.2.4.      Virus .................................................................................................................. 39
       2.2.5.      Franchissement de la barrière des glandes salivaires ........................................ 40
     2.3.    Echappement à la machinerie lysosomiale................................................................ 41
       2.3.1.      Arrêt de la maturation des phagosomes ............................................................ 41

                                                                      7
2.3.2.    Libération de la vacuole .................................................................................... 42
       2.3.3.    Détournement du système lysosomial............................................................... 42
    2.4.    Dissémination dans l’hôte ......................................................................................... 42
  3. Déterminants génétiques de la transmission de Spiroplasma citri.................................... 43
    3.1.    Transmission expérimentale de S. citri ..................................................................... 43
    3.2.    Identification de protéines chez S. citri candidates dans la transmission.................. 44
IV. Situation du sujet et objectifs de recherche ...................................................................... 46

CHAPITRE 1: Interactions protéine-protéine entre S. citri et son insecte vecteur Circulifer
haematoceps

I.   Introduction et objectifs ................................................................................................... 48
II.  Résultats et discussion...................................................................................................... 51
   1. Publication 1...................................................................................................................... 51
   2. Résultats supplémentaires ................................................................................................. 52
     2.1.     Identification de protéines d’insectes impliquées dans une interaction avec S. citri 52
        2.1.1.     Comparaison des far Western monodimensionnels                                           (1-D) réalisés avec les
        protéines totales et de glandes salivaires d’insectes.......................................................... 52
        2.1.2.     Far Western bi-dimensionnel (2-D) avec les protéines totales et celles des
        glandes salivaires d’insectes.............................................................................................. 53
        2.1.3.     Identification des protéines d’insectes impliquées par spectrométrie de masse 54
           2.1.3.1. Signaux d’interaction communs aux deux far Western. ........................... 54
              Signal d’interaction à 42 kDa : l’actine..................................................................... 54
              Signal d’interaction à 50 kDa : la tubuline................................................................ 55
              Signal d’interaction à 25 kDa : Rab GTPases ........................................................... 56
           2.1.3.2. Signal spécifique du far Western réalisé avec les protéines des glandes
           salivaires d’insectes....................................................................................................... 57
              Signal d’interaction à 27 kDa : la protéine 14-3-3 .................................................... 57
     2.2.     Recherche et identification du partenaire de l’actine chez S. citri ............................ 57
           2.2.1.1. Transmembrane conserved hypothetical lipoprotein (SPICI 03-098)........... 58
           2.2.1.2. La phosphoglycérate kinase (PGK)............................................................... 59
III. Conclusion........................................................................................................................ 59

CHAPITRE 2: Caractérisation de la région minimale de liaison à l’actine de la PGK de S. citri et
implication dans la transmission

I.   Introduction et objectifs ................................................................................................... 62
II.  Résultats et discussion...................................................................................................... 64
   1. Publication 2...................................................................................................................... 64
   2. Résultats supplémentaires et discussion............................................................................ 74
     2.1.   Recherche du mécanisme d’interaction entre la PGK et l’actine.............................. 74
     2.2.   Recherche d’homologie de séquences chez la PGK d’autres organismes. ............... 76
     2.3.   Localisation de la PGK ............................................................................................. 77
III. Conclusion........................................................................................................................ 78

CHAPITRE 3: Réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de phosphoglycérate kinase

I.      Introduction ...................................................................................................................... 80
II.     Résultats ........................................................................................................................... 81
      1. Construction du vecteur pGOTpgk ................................................................................... 81
      2. Obtention et sélection des clones délétés dans le gène pgk............................................... 82

                                                                        8
3.Recherche du site d’intégration du pGOTpgk dans le chromosome de S. citri ................ 83
     3.1.   Approche par PCR pour détecter une intégration au niveau de l’OriC ou du
     promoteur de la spiraline....................................................................................................... 84
     3.2.   Approche par PCR « aléatoire »................................................................................ 84
   4. Identification des gènes dans le chromosome de S. citri ayant subi l’intégration ............ 85
III. Discussion et conclusion .................................................................................................. 86

CHAPITRE 4: Étude préliminaire de complexes protéiques impliqués dans la transmission de
S.citri par l’insecte vecteur

I.   Introduction et objectifs ................................................................................................... 88
II.  Résultats et discussion...................................................................................................... 90
   1. Recherche de complexes par la technique de BN-PAGE chez S. citri. ............................ 90
     1.1.   Extraction et analyse des complexes membranaires. ................................................ 91
     1.2.   Extraction et analyse des complexes cytosoliques. ................................................... 92
   2. Recherche chez S. citri des complexes impliquant la PGK .............................................. 94
     2.1.   Protéines associées à la PGK dans des complexes connus ....................................... 96
III. Discussion et conclusion .................................................................................................. 99

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES

I.         Hypothèses concernant le cycle de S. citri dans l'insecte C. haematoceps .................... 102
      1.      Franchissement de la barrière de l'épithélium intestinal ................................................. 102
      2.      Franchissement de la barrière des glandes salivaires ...................................................... 102
           2.1.   Franchissement de la lame basale des glandes salivaires........................................ 102
           2.2.   Adhésion au plasmalemme des glandes salivaires .................................................. 103
           2.3.   Internalisation dans les cellules des glandes salivaires ........................................... 104
           2.4.   Devenir des vésicules d'endocytose contenant S. citri ............................................ 105
           2.5.   Libération dans le canal salivaire ............................................................................ 105
II.        Perspectives .................................................................................................................... 106

MATERIELS ET METHODES

I.   Matériel biologique ........................................................................................................ 109
   1. Spiroplasma citri : souches et conditions de culture....................................................... 109
   2. Escherichia coli : souches et utilisation .......................................................................... 109
   3. L’insecte vecteur : la cicadelle Circulifer haematoceps ................................................. 110
     3.1.   Origine et conditions d’élevage............................................................................... 110
     3.2.   Capture et dissection des cicadelles ........................................................................ 110
     3.3.   Obtention d’une lignée cellulaire ............................................................................ 111
II. Plasmides........................................................................................................................ 111
   1. Commerciaux .................................................................................................................. 111
     1.1.   pBS .......................................................................................................................... 111
     1.2.   pET28a(+) ............................................................................................................... 112
   2. Obtenus au laboratoire .................................................................................................... 112
     2.1.   pGOT1..................................................................................................................... 112
III. Méthodes d’analyse d’ADN........................................................................................... 113
   1. Purification de l’ADN génomique de S. citri.................................................................. 113
   2. Purification de l’ADN plasmidique................................................................................. 113
   3. Purification de fragments d’ADN à partir de gel d’agarose............................................ 113
   4. Hydrolyse par les endonucléases de restriction............................................................... 114

                                                                         9
5.  Analyse des fragments d’ADN sur gel d’agarose ........................................................... 114
   6.  Amplification d’ADN par PCR....................................................................................... 114
   7.  Mutagénèse dirigée ......................................................................................................... 115
   8.  Clonage de fragment d’ADN amplifié par PCR ............................................................. 115
    8.1.    Préparation du fragment PCR ................................................................................. 115
    8.2.    Préparation du vecteur............................................................................................. 116
    8.3.    Ligation du fragment PCR et de son vecteur .......................................................... 116
  9. Transformation des bactéries .......................................................................................... 116
    9.1.    E. coli ...................................................................................................................... 116
       9.1.1.     Electrocompétentes ......................................................................................... 116
       9.1.2.     Chimiocompétentes......................................................................................... 117
    9.2.    S. citri ...................................................................................................................... 118
  10.    Marche sur le chromosome ......................................................................................... 118
IV. Méthodes d’analyse des protéines.................................................................................. 119
  1. Extraction des protéines .................................................................................................. 119
    1.1.    Préparation des protéines de S. citri ........................................................................ 119
      1.1.1.      Protéines pour l’électrophorèse mono-dimensionnelle ................................... 119
      1.1.2.      Protéines pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle ......................................... 120
      1.1.3.      Fractionnement des protéines membranaires .................................................. 120
    1.2.    Préparation des protéines de C. haematoceps ......................................................... 120
      1.2.1.      Totales ............................................................................................................. 120
      1.2.2.      Glandes salivaires............................................................................................ 121
      1.2.3.      Pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle......................................................... 121
  2. Production de protéines recombinantes tagguées His6 .................................................... 121
    2.1.    His6-PGK................................................................................................................. 121
    2.2.    His6 PGK FL1, 2, 3, 4, 5 ......................................................................................... 122
  3. Purification des protéines par chromatographie liquide.................................................. 123
    3.1.    Colonne de protein A Sépharose CL-4B................................................................. 123
    3.2.    Purification de protéines recombinantes ................................................................. 124
       3.2.1.     IMAC (immobilized metal affinity chromatography)..................................... 124
       3.2.2.     Chromatographie d’exclusion ......................................................................... 125
       3.2.3.     Fractionnement sur colonne échangeuse d’ions.............................................. 126
  4. Dosage des protéines ....................................................................................................... 126
    4.1.    Bradford .................................................................................................................. 126
    4.2.    Bradford modifié ..................................................................................................... 126
  5. Séparation des protéines en gel d’électrophorèse ........................................................... 127
    5.1.    Electrophorèse mono-dimensionnelle ..................................................................... 127
       5.1.1.     Gels de polyacrylamide à concentration constante ......................................... 127
       5.1.2.     Gels en gradient de polyacrylamide 4-15 % ................................................... 127
    5.2.    Electrophorèse bi-dimensionnelle ........................................................................... 128
  6. Visualisation des protéines après électrophorèse ............................................................ 129
    6.1.    Coloration au bleu colloïdal .................................................................................... 129
    6.2.    Coloration au nitrate d’argent classique.................................................................. 129
    6.3.    Coloration au nitrate d’argent compatible avec la spectrométrie de masse ............ 130
       6.3.1.     Méthode O’Connell et al, 1997....................................................................... 130
       6.3.2.     Kit Proteosilver™ Silver Stain........................................................................ 130
  7. Transfert des protéines et détection immunologique ...................................................... 131
    7.1.    Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose............................... 131
    7.2.    Détection immunologique des protéines sur membrane ......................................... 131
  8. Etude d’interaction protéine-protéine par la technique de far Western .......................... 132
  9. Identification des protéines par spectrométrie en masse................................................. 132

                                                                     10
10.     Etude des complexes protéines chez S. citri ............................................................... 133
    10.1.      Technique de Blue-Native PAGE ....................................................................... 133
       10.1.1. Préparation des protéines ................................................................................ 133
       10.1.2. Electrophorèse des protéines ........................................................................... 133
          10.1.2.1. 1ère dimension ............................................................................................ 133
          10.1.2.2. 2ème dimension........................................................................................... 134
    10.2.      Pontage des complexes protéiques associant la PGK chez S. citri ..................... 134
       10.2.1. Préparation des protéines ................................................................................ 134
       10.2.2. Purification sur colonne de Nickel .................................................................. 135
V. Etude de la transmission expérimentale de S. citri......................................................... 135
  1. Transmission à la pervenche de Madagascar Catharanthus roseus................................ 135
    1.1.    Insectes .................................................................................................................... 135
    1.2.    Les pervenches de Madagascar ............................................................................... 135
    1.3.    Micro-injection intra-abdominale des cicadelles .................................................... 135
    1.4.    Transmission à la pervenche de Madagascar .......................................................... 136
    1.5.    Symptomatologie .................................................................................................... 136
  2. « Recrachage » à travers une membrane de Parafilm® .................................................. 137
    2.1.    Injection de la culture de S. citri GII3 dans l’insecte .............................................. 137
    2.2.    Injection des protéines recombinantes dans l’insecte ............................................. 137
    2.3.    Transmission à travers une membrane de Parafilm® ............................................. 137
    2.4.    Mise en culture des spiroplasmes à partir des insectes ........................................... 137
  3. Effet de la PGK et des peptides sur l’adhésion et/ou l’internalisation............................ 138
    3.1.    Adhésion.................................................................................................................. 138
    3.2.    Internalisation.......................................................................................................... 138
  4. Observations au microscope confocal............................................................................. 139
    4.1.    Glandes salivaires de C. haematoceps infectées ..................................................... 139
    4.2.    Cellules de C. haematoceps incubées avec la His6-PGK ........................................ 140

REFERENCES………………………………………………………………………………….141




                                                                    11
Introduction
Classification                     Guanine+Cytosine               Taille du génome                                Besoin en
                                                    (moles %)                          (kpb)                     Cholestérol                    Tween 80


Ordre I: MYCOPLASMATALES
 Famille I: MYCOPLASMATACEAE
   Genre I: Mycoplasma                                    23-40                      580-1350                         Oui                        Non
   Genre II: Ureaplasma                                   27-30                      760-1170                         Oui                        Non

Ordre II: ENTOMOPLASMATALES
 Famille I: ENTOMOPLASMATACEAE
   Genre I: Entomoplasma                                  27-29                      790-1140                        Oui                         Non
   Genre II: Mesoplasma                                   27-30                      870-1100                        Non                         Oui
 Famille II: SPIROPLASMATACEAE
   Genre I: Spiroplasma                                   25-30                      780-2220                        Oui∗
                                                                                                                        ∗                        Non

Ordre III: ACHOLEPLASMATALES
 Famille: ACHOLEPLASMATACEAE
   Genre: Acholeplasma                                    26-36                     1500-2085                        Non                         Non
            Candidatus Phytoplasma                        25-30                      600-1240

Ordre IV: ANAEROPLASMATALES
  Famille: ANAEROPLASMATACEAE
    Genre I: Anaeroplasma                                 29-34                     1500-1600                        Oui                         Non
    Genre II: Asteroleplasma                               40                         1500                           Non                         Non




Tableau I.1: Classification des membres de l’ordre des Mollicutes.
∗: S. floricola, S. apis, S. chinense, et les spiroplasmes du groupe XII peuvent se multiplier dans un milieu sans sérum. (Rose et al., 1993)
Introduction


                                       Introduction


I. Les mollicutes

        Les mollicutes sont des eubactéries sans paroi présents chez l’homme, les animaux, les
insectes et les plantes. Leur découverte date de la fin du 19ème siècle lorsque Nocard et Roux
cultivèrent pour la première fois l’agent de la péripneumonie contagieuse bovine,
Mycoplasma mycoïdes (Nocard & Roux, 1898). Ce nom de mycoplasme ne sera donné qu’en
1929 par Nowak, à la suite de l’apparition de filaments évoquant des formes mycéliennes qui
apparaissent au cours de la culture de cette bactérie. Ce n’est qu’en 1967 que l’ensemble des
mycoplasmes fut regroupé dans la classe des Mollicutes (Edward & Freundt, 1967).


        1. Taxonomie

        La classe des Mollicutes est constituée de plusieurs centaines d’espèces réparties en 4
ordres, eux-mêmes répartis en 5 familles et 8 genres (Tableau 1.1 ; (Tully et al., 1993; Razin
et al., 1998)).
        L’ordre des Mycoplasmatales est constitué d’une seule famille, la famille des
Mycoplasmataceae comprenant deux genres: le genre Mycoplasma et le genre Ureaplasma.
Dans cet ordre, les organismes ont besoin de cholestérol pour leur croissance et sont
majoritairement aérobies. Les mollicutes du genre Ureaplasma ont la capacité d’hydrolyser
l’urée. Leurs hôtes sont préférentiellement l’homme et les animaux.
        L’ordre des Acholeplasmatales comprend une seule famille, les Acholeplasmataceae,
ne contenant que le genre Acholeplasma dont les organismes n’ont pas besoin de cholestérol
pour leur croissance. Ces organismes sont quant à eux présents chez les mammifères, les
insectes et les plantes.
        L’ordre Anaeroplasmatales regroupe des bactéries, anaérobies, isolées uniquement de
la panse des ruminants et classées en une famille, les Anaeroplasmataceae, comprenant deux
genres. Les membres du genre Anaeroplasma ont besoin de cholestérol pour leur croissance
contrairement aux membres du genre Asteroleplasma.
        Les Entomoplasmatales sont des mollicutes isolés de la surface de plantes et
d’arthropodes. Cet ordre est scindé en deux familles : la famille des Entomoplasmataceae,
constituée des deux genres Mesoplasma et Entomoplasma, et celle des Spiroplasmataceae,
représentée par un seul genre, le genre Spiroplasma. Les spiroplasmes sont caractérisés par

                                              12
Figure I.2: Arbre phylogénétique basé sur les séquences d’ADNr des Mollicutes.
(D’après Sirand-Pugnet, 2007.)
Introduction


leur morphologie hélicoïdale et leur motilité. Ils sont plus ou moins exigeants en stérols. Les
habitats des spiroplasmes sont les invertébrés, la surface des plantes mais également, pour
trois d’entre eux uniquement, les tubes criblés du phloème.
       De nombreux mollicutes n’ont pas encore été cultivés en milieu acellulaire. De ce fait,
leur statut taxonomique n’a pu être établi selon les standards minimaux de définition
d’espèce. C’est en particulier le cas des phytoplasmes qui se multiplient dans les insectes et
les tubes criblés du phloème.


       2. Phylogénie

       Des études phylogénétiques basées sur l’ADN 16S de ces bactéries ont montré que les
mollicutes ont évolué de manière régressive à partir d’un ancêtre bactérien à Gram-positif et à
faible pourcentage en base G+C (Woese, 1987). Cet ancêtre serait commun avec certaines
Clostridia, comme Clostridium innocuum et Clostridium ramosum, dont ils partagent la
propriété d’être insensible à la rifampicine (Gadeau et al., 1986). Cette évolution régressive
est marquée notamment par une réduction de la taille de leur génome engendrée par la perte
massive de gènes non essentiels à l’autoréplication.
       Ces études ont également permis de situer les phytoplasmes par rapport aux autres
mollicutes (Woese, 1987). Selon ces critères, les phytoplasmes sont apparentés aux
acholéplasmes.
       De manière plus surprenante, les mycoplasmes du groupe mycoïdes, ainsi que
Mycoplasma capricolum, appartiennent à la même branche phylogénétique que les
spiroplasmes, bien que se trouvant dans des ordres différents dans la classification
taxonomique.
       La classification phylogénétique des mollicutes est représentée figure I.2 où ces
derniers sont regroupés en 4 groupes phylogénétiques distincts : les groupes pneumoniae,
hominis, spiroplasma et phytoplasma/acholeplasma (Sirand-Pugnet et al., 2007).


       3. Evolution et caractéristiques importantes

       Il a été suggéré que les mollicutes évoluent plus rapidement que les autres bactéries
(Woese et al., 1984). Cette vitesse d’évolution rendrait compte de leur positionnement sur les
plus longues branches de l’arbre universel de la vie (Ciccarelli et al., 2006). De plus, leur
évolution par la perte de certains gènes a influencé certaines propriétés particulières
communes à ces bactéries (tableau I.1). En effet, les mollicutes se distinguent en premier lieu
                                              13
Introduction


par l’absence de paroi rigide à peptidoglycane ce qui les rend constitutivement résistants à
tous les antibiotiques ayant pour cible la paroi bactérienne. Ils se caractérisent également par
une taille de génome réduite qui varie de 580 kpb pour Mycoplasma genitalium à 2200 kpb
pour Spiroplasma ixodetis. Ils possèdent un nombre limité de voies métaboliques ce qui
implique que leur culture in vitro ne peut être obtenue que dans un milieu complexe contenant
notamment du sérum d’origine animale. De plus, l’adaptation de ces organismes à des niches
écologiques précises a certainement joué un rôle prépondérant au cours de leur évolution
entraînant notamment la perte de la capacité à synthétiser certains acides aminés (Pollack et
al., 1996) voire la totalité dans le cas de Spiroplasma citri (Chang & Chen, 1981).
       Leur pourcentage de moles de paires de bases G+C est faible, de 23 à 41 % (Razin et
al., 1998). De ce fait, les mollicutes ont développé un biais dans l’utilisation des codons. Pour
un même acide aminé, les codons terminés par A ou T sont utilisés préférentiellement à ceux
terminés par G ou C (Razin et al., 1998). Dans tous les genres, hormis le genre Acholeplasma,
le tryptophane est codé par le codon UGA et, dans une moindre proportion par le codon UGG
(Renaudin et al., 1986; Blanchard, 1990). UGA étant un codon de terminaison dans le code
génétique universel, l’expression de protéines dans un système hétérologue de production
comme Escherichia coli, s’avère impossible sans muter l’ensemble de ces codons dans les
gènes correspondants.


       Les mollicutes sont présents dans des habitats très variés, mais toujours associés à un
hôte vivant, que ce soit l’homme, l’animal (mammifère, poisson, oiseau, insecte) ou la plante
(Razin et al., 1998). En milieu naturel, ces organismes sont des parasites obligatoires et, à ce
titre, peuvent posséder un ou plusieurs hôtes. Les mollicutes phytopathogènes ont, de ce fait,
deux hôtes que sont la plante et l’insecte vecteur par lequel ils sont transmis.


II. Mollicutes phytopathogènes
       C’est en 1967 qu’une équipe japonaise observe pour la première fois, en microscopie
électronique, des organismes ressemblant à des mycoplasmes dans les tubes criblés d’une
plante atteinte de jaunisse (Doi et al., 1967). Ces organismes ont alors été nommés MLO pour
Mycoplasma-Like Organism. Le comité de taxonomie des mycoplasmes a repris, en 1994, la
proposition de Murray et Schleifer (Murray & Schleifer, 1994) de désigner, sous le nom de
genre 'Candidatus Phytoplasma', les différents groupes phylogénétiques des phytoplasmes
(IRPCM., 2004). Le phytoplasme associé à la maladie des balais de sorcières du limettier du
Sultanat d'Oman est le premier phytoplasme pour lequel cette proposition a été retenue. Il
                                                14
Introduction


porte maintenant le nom de 'Candidatus Phytoplasma aurantifolia' (Zreik et al., 1995).
Depuis, 25 autres espèces de Candidatus Phytoplasma ont été décrites (Hogenhout et al.,
2008).


         Les mollicutes phytopathogènes regroupent aujourd’hui les phytoplasmes appartenant
au genre Candidatus phytoplasma et les spiroplasmes appartenant au genre Spiroplasma. Les
phytoplasmes sont les plus nombreux et les plus importants du point de vue économique.
Cependant, ils résistent toujours à la mise en culture. En revanche, trois espèces de
spiroplasmes phytopathogènes sont connues et disponibles en culture pure : Spiroplasma citri,
Spiroplasma kunkelii et Spiroplasma phoeniceum. Parmi ceux-là, S. citri a fait l’objet de
nombreuses études biologiques et biochimiques et est devenu un organisme modèle pour
l’étude des mollicutes phytopathogènes (Garnier et al., 2001; Bove et al., 2003).


         1. Phytoplasmes

         Au niveau mondial, les phytoplasmes sont responsables de plus de 300 maladies de
plantes appartenant à plus de 100 familles botaniques différentes (McCoy et al., 1989).
         Les symptômes provoqués sur les plantes infectées sont variables et incluent des
jaunisses foliaires, un enroulement et/ou une diminution de la taille des feuilles, une
virescence (pétales non segmentés), une phyllodie (morphologie foliaire des sépales), la
prolifération de bourgeons axillaires, un raccourcissement des entre-nœuds, etc….
         Les pertes économiques provoquées par des infections à phytoplasmes sont
importantes dans nos régions françaises lorsque ces infections touchent des cultures pérennes
comme la Flavescence dorée de la vigne (Daire et al., 1993b), la maladie du Stolbur (Daire et
al., 1993a), l’enroulement chlorotique de l’abricotier (Jaraush et al., 1999) et la maladie de la
prolifération du pommier (Lee et al., 2000).
         L’analyse de leur ADN ribosomique 16S a permis de démontrer que ces organismes
sont phylogénétiquement proches des acholéplasmes (Lim & Sears, 1989; Seemüller et al.,
1994) avec lesquels ils partagent l’utilisation du code génétique universel contrairement aux
autres mollicutes (Lim & Sears, 1992). Le séquençage systématique de leurs ARNr 16S,
associé à la mise au point de techniques de RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism), ont permis d’établir une classification des phytoplasmes (Lee et al., 1998).
         Les premières données disponibles sur le génome des phytoplasmes révèlent, en se
basant sur des études d’électrophorèse en champ pulsé, que celui-ci aurait une taille comprise
entre 530 kpb pour le Bermuda grass white leaf phytoplasma, et 1350 kpb pour le Tomato

                                               15
Introduction


Stolbur phytoplasma (Marcone et al., 1999) avec une teneur en G+C de l’ordre de 25 à 30
moles %. Depuis le séquençage, en 2004, de Candidatus Phytoplasma asteris souche Onion
Yellows (OY) (Oshima et al., 2004), trois nouveaux génomes sont disponibles dont celui de
Candidatus Phytoplasma asteris Aster Yellows (AY) (Bai et al., 2006), Candidatus
Phytoplasma australiense (Tran-Nguyen et al., 2008) et Candidatus Phytoplasma mali (Kube
et al., 2008). La taille du génome de Candidatus Phytoplasma australiense est d’environ 20
kpb supérieure à ceux des deux phytoplasmes de l’ordre des Candidatus Phytoplasma asteris
qui atteignent environ 860 kpb. De ce fait, son génome possède environ 200 gènes « souche-
spécifique », qui ne sont pas présents chez les deux autres phytoplasmes séquencés, et qui
codent de nombreuses protéines hypothétiques mais aussi des transposases ou encore des
intégrases (Tran-Nguyen et al., 2008). Le génome de Candidatus Phytoplasma mali a révélé
une caractéristique particulière par rapport aux autres phytoplasmes déjà séquencés. En effet,
son génome de 600 kpb est linéaire. De plus, l’analyse des régions codantes de ce dernier a
révélé que la voie de la glycolyse, principale source d’énergie d’un organisme, est incomplète
et, de plus, aucune ATP synthase de type F n’a été retrouvée (Kube et al., 2008).


         2. Spiroplasmes phytopathogènes

             2.1. Spiroplasma phoeniceum et Spiroplasma kunkelii

         Spiroplasma phoeniceum a été isolé en 1986 de pervenches de Madagascar atteintes de
jaunisse provenant de Syrie (Saillard et al., 1987). Il provoque des symptômes très similaires
à ceux observés sur des plantes infectées par S. citri. Il appartient au sérogroupe I-8 de la
dernière classification des spiroplasmes établie en 1998 (Williamson et al., 1998). Son
génome de 1860 kpb (Carle et al., 1995) possède 26 % de bases G+C (Saillard et al., 1987).
Son optimum de croissance dans un milieu riche en cholestérol est de 32°C.
         S. kunkelii (sérogroupe I-3), observé pour la première fois en 1972, est l’agent
responsable de la maladie du rabougrissement du maïs ou « corn stunt », une maladie qui
s’étend depuis le sud des Etats-Unis jusqu’en Argentine. S. kunkelii, cultivé pour la première
fois en 1975 (Chen & Liao, 1975; Whitcomb & Williamson, 1975) a été caractérisé en 1986
(Whitcomb et al., 1986). Son génome, partiellement séquencé, est constitué d’un chromosome
circulaire de 1610 kpb (Carle et al., 1995) et possède 26 % de bases G+C (Whitcomb et al.,
1986).    Les   séquences    disponibles   sont    accessibles   sur   le   site   web     suivant:
(http://www.genome.ou.edu/ spiro_blast.html).



                                              16
Introduction


            2.2. Spiroplasma citri

                     2.2.1. Description de la maladie et mise en culture

       En 1970, deux équipes observent pour la première fois des organismes de type
mollicute dans les tubes criblés d'orangers atteints de la maladie du stubborn (Igwegbe &
Calavan, 1970; Laflèche & Bové, 1970). Contrairement à un arbre sain dont la forme est
généralement pyramidale, l'arbre très atteint présente un aspect buissonneux provenant d'un
raccourcissement général des entre-noeuds. Les feuilles des arbres malades présentent une
chlorose foliaire. La floraison et la maturation des fruits sont perturbées. La floraison
s'échelonne tout le long de l'année et survient donc à contre saison. Les fruits sont déformés
en forme de glands et les pépins avortés ou nécrosés.
       Obtenu en culture pure en France (Saglio et al., 1971) et en Californie (Fudl-Allah et
al., 1972), la caractérisation biochimique et immunologique du pathogène responsable de la
maladie du stubborn révèle que l'organisme cultivé est bien un mycoplasme du fait de
l'absence de paroi à peptidoglycane (Bébéar et al., 1974) mais, qu’il s'agit d'un mycoplasme
nouveau de par sa morphologie hélicoïdale et sa motilité (Saglio et al., 1973). Il fut nommé
Spiroplasma citri en 1973 (Saglio et al., 1973).
       La transmission de S. citri à l’oranger Citrus sinensis (Markham et al., 1974) par la
cicadelle Euscelis plebejus (Fallen), infectée par micro-injection d’une culture du
spiroplasme, a permis de vérifier les postulats de Koch, démontrant ainsi le rôle de S. citri
comme agent phytopathogène.
       La mise au point d'un milieu de culture de composition définie a permis de connaître
les exigences nutritionnelles de S. citri (Chang & Chen, 1981). Ainsi, il a été établi que sa
culture nécessite l'ajout de cholestérol, d'acides gras, de vitamines, de co-facteurs (acide
folique, acide p-aminobenzoïque, etc...), de source de carbone et d'acides aminés sauf les
acides aspartique et glutamique. Les sucres fermentés par S. citri sont le glucose, le fructose et
le tréhalose; les autres sucres comme le mannose ou le sorbitol ne sont pas utilisés. Le
comportement de S. citri envers le saccharose n'est pas bien défini. Les milieux couramment
utilisés, comme le milieu SP4, contiennent nécessairement du sérum animal (poulain ou veau
foetal) qui apporte les stérols et lipides, ainsi que des sucres, glucose, fructose et saccharose
comme source d'énergie (Tully et al., 1977). Ce milieu possède une pression osmotique
élevée et contrôlée de 600 mOsm du fait de l’absence de paroi du spiroplasme. La
température optimale pour la croissance de S. citri est 32°C (Saglio et al., 1973). Cette
croissance est fortement ralentie à 37°C (Garnier et al., 1984).

                                               17
Introduction


       En plus d’être l’agent du stubborn des agrumes, S. citri est également responsable de
la maladie des racines cassantes du radis noir (Fletcher et al., 1981). Au total, au moins 38
espèces végétales regroupant 12 familles botaniques sont naturellement infectées par S. citri.
La première plante découverte infectée par S. citri en Californie (Granett et al., 1976), en
Arizona (Allen & Donndelinger, 1981) ainsi qu'au Maroc (Bove et al., 1978) n'appartenant
pas à la famille des agrumes (rutacées) est la pervenche de Madagascar (Catharanthus
roseus).
       Par ailleurs, en Californie, S. citri a été isolé de mauvaises herbes comme le plantin
(Plantago sp.), de plantes ornementales comme le souci (Tagetes erecta), la reine-marguerite
(Callistephus chinensis), de plantes cultivées comme la laitue (Lactuca sp.), le radis
(Raphanus sativum), la pastèque (Citrullus vulgaris) et de certains arbres fruitiers, cerisiers,
pêchers et poiriers (Calavan & Bove, 1989). Plus récemment, ce spiroplasme a également été
isolé de la carotte (Mello et al., 2009 ; Cebrian et al., 2010). S. citri a pu être transmis
expérimentalement par greffage ou insecte vecteur à environ 80 espèces végétales différentes.


                     2.2.2. Caractéristiques de S. citri

       Depuis son obtention en culture pure, S. citri est devenu le mollicute phytopathogène
le mieux caractérisé à l’heure actuelle.
       Les premières observations au microscope à fond noir révèlent que S. citri possède une
morphologie hélicoïdale et est doué de motilité malgré l’absence de flagelle ou de filament
axial normalement présent chez les bactéries mobiles (Cole et al., 1973). S. citri doit sa
motilité à deux types de mouvements, un mouvement de flexion du corps cellulaire et un
mouvement de rotation autour de l’hélice (Davis & Worley, 1973; Daniels et al., 1980). Ce
mouvement de rotation associé à sa morphologie hélicoïdale permet au spiroplasme de se
déplacer en milieu visqueux. Sur milieu solide, cette motilité a des répercussions sur l’aspect
des colonies qui sont diffuses et entourées de colonies satellites. Plus récemment, les travaux
de Trachtenberg et collaborateurs ont permis de mettre en évidence l’implication du
cytosquelette de S. citri dans sa motilité (Trachtenberg & Gilad, 2001; Trachtenberg et al.,
2003; Trachtenberg, 2004). Ce cytosquelette est composé de la protéine de fibrille
(Williamson et al., 1991) et de la protéine « actin-like » MreB (Maccheroni et al., 2001). Ce
cytosquelette agirait comme un moteur linéaire capable de se contracter permettant ainsi un
déplacement directionnel contrôlé (Trachtenberg, 2004). Des travaux complémentaires ont
montré que le déplacement du spiroplasme était également dépendant de la propagation d’une


                                              18
Introduction


paire de « kink » le long du corps cellulaire, structures générées par des changements de
l’hélicité du spiroplasme (Shaevitz et al., 2005).
       La croissance de S. citri s’effectue par allongement d’une hélice élémentaire
constituée de 2 tours donnant une hélice parentale à quatre tours. L’hélice parentale se divise
ensuite, par constriction, en deux hélices élémentaires (Garnier et al., 1984).


       Aujourd’hui, 92 % de la séquence du génome de S. citri GII3 sont connus (Carle et al.,
2010). Ce génome se compose d’un chromosome de 1820 kpb avec 26 % de bases G+C et de
sept plasmides (pSciA et pSci1 à 6) qui ne possèdent pas d’homologues connus (Saillard et
al., 2008). La taille de ces plasmides varie de 7,8 kpb pour le pSciA à 35,3 kpb pour le pSci6
et leurs nombres de copies par spiroplasmes ont été estimés entre 10 et 14. L'ADN
plasmidique représenterait ainsi près de 1,6 Mpb soit 47 % de l'ADN total de S. citri GII3. Les
pSci1-6 possèdent un pourcentage en G+C (25,6 à 29 %) proche de celui du chromosome (26
%) alors que le pSciA à un pourcentage plus faible de 21,3 %. De manière intéressante,
aucune des CDS portées par les pSci ne présente d’homologie avec une protéine de
réplication (Saillard et al., 2008). Des travaux récents ont néanmoins pu restreindre l’origine
de réplication des plasmides pSci de S. citri à une région contenant une seule CDS, nommée
pE, et à sa séquence en aval présentant des motifs de fixation à la protéine initiatrice DnaA
(Breton et al., 2008).
       De plus, trois formes réplicatives virales SpV1, SpV2 et SpV3 ont été identifiées dans
le chromosome de S. citri (Renaudin et al., 1990; Renaudin & Bove, 1994). Les virus SpV2 et
SpV3 ressemblent à des bactériophages classiques, alors que le virus SpV1 est filamenteux
avec un ADN monocaténaire circulaire de 8,3 kb (Renaudin et al., 1990). Une des
caractéristiques de ce virus SpV1 est le grand nombre de copies de son ADN, plus ou moins
complètes, réparties dans tout le chromosome (Carle et al., 2010).


                   2.2.3. S. citri, un organisme modèle pour l’élaboration
      d’outils génétiques

       Un des premiers grands challenges concernant l’étude de S. citri fut le développement
de vecteurs d’expression de gènes, outil indispensable à la caractérisation fonctionnelle de ces
derniers. Dès le début, la présence des formes réplicatives virales a été mise à profit. A partir
de la forme réplicative SpV1, un vecteur a été développé parallèlement à une méthode de
transformation par électroporation (Stamburski et al., 1991). Cette première approche de
transfert de gènes chez S. citri n’a pas été jugée satisfaisante car ces vecteurs viraux sont
                                               19
Introduction


instables, dans le sens où des phénomènes de recombinaisons homologues entre le vecteur et
les copies virales portées par le chromosome sont observés (Marais et al., 1996). En 1994, Ye
et collaborateurs clonent l’origine de réplication chromosomique de la souche R8A2 de S.
citri (Ye et al., 1994) qui sera utilisée plus tard pour la construction de vecteurs, tels que le
plasmide pBOT (Renaudin et al., 1995). Ce plasmide navette, dans les cas de
complémentation fonctionnelle in vivo, s’intègre dans le chromosome par simple
recombinaison homologue entre les origines de réplication (Renaudin et al., 1995).
L’ensemble de ces vecteurs navettes, et notamment le plasmide pGOT (Duret et al., 2005),
développés récemment au laboratoire dans le but d’obtenir des mutants par simple
recombinaison homologue, seront détaillés au chapitre 3.
       Parallèlement, une technique de mutagénèse aléatoire par transposition avec le
transposon Tn4001 a également vu le jour au laboratoire (Foissac et al., 1997). Cette approche
a permis d’obtenir plusieurs mutants de S. citri, à savoir un mutant non motile G540 (Jacob et
al., 1997), un mutant déficient pour une ATPase de type P transporteur de calcium, un mutant
non-phytopathogène (Gaurivaud et al., 2000; Gaurivaud et al., 2001) et un mutant affecté
dans sa transmission (Boutareaud et al., 2004).
       Plus récemment, une nouvelle approche basée sur l’incompatibilité plasmidique
permet de modifier le contenu plasmidique de S. citri et d’obtenir des mutants afin de
caractériser l’ensemble des gènes présents sur les plasmides pSci (Breton et al., 2010).


       Ces dernières années, les travaux du laboratoire se sont orientés sur les déterminismes
génétiques impliqués dans la transmission de S. citri. En effet, S. citri est transmis de plante à
plante par des cicadelles, insectes piqueurs suceurs de sève élaborée, selon un mode circulant
multipliant, impliquant des relations étroites avec l’insecte.
       De nombreuses étapes clés, régissant ce mode de transmission par l’insecte, restent à
être élucidées. En revanche, pour de nombreux microorganismes pathogènes (bactéries, virus,
champignons), les mécanismes gouvernant les étapes clefs nécessaires à leur transmission ont
été particulièrement étudiés et sont, à l’heure actuelle, parfaitement décrits.
       La suite de cette introduction fait le point sur les connaissances acquises sur les
relations des spiroplasmes avec leurs insectes vecteurs puis, décrit les différentes étapes ainsi
que les mécanismes mis en jeu au cours de la transmission de pathogènes intracellulaires
qu’ils soient transmis par des insectes vecteurs ou non.




                                                20
Introduction


III. Transmission de microorganismes intracellulaires
           1. Transmission par insecte vecteur

               1.1. Relation entre le microorganisme et son insecte

           Il existe plusieurs types de relation entre un microorganisme et son hôte.


                        1.1.1. Transmission externe

           Lors d’une transmission externe du microorganisme, c’est-à-dire lorsque celui-ci ne se
fixe que sur des parties externes de l’insecte (pattes, thorax, stylet), l’association entre les
deux partenaires est limitée. Aucun des deux partenaires n’influence le comportement de
l’autre.


                        1.1.2. Transmission intracellulaire

           Lorsque l’interaction entre les deux partenaires persiste, comme cela est le cas au
cours d’une transmission intracellulaire, cette relation entre le microorganisme et son hôte se
complexifie et certaines associations peuvent engendrer une modification du comportement
de l’insecte, pouvant aller jusqu’à la mort de ce dernier. Les Baculoviridae sont les
pathogènes d'insectes les plus représentés. Ils infectent notamment les larves de lépidoptères
et d’hyménoptères (Blissard, 1996). L'infection survient une fois que des larves d'insectes
sensibles ont absorbé des aliments contaminés par le virus. Le virus s'attaque alors à
l'hémolymphe, aux tissus adipeux et à l'intestin moyen. L'insecte est ensuite paralysé et meurt.
           Des interactions mutualistes entre les deux partenaires ont également été découvertes ;
le microorganisme, dans ce cas appelé endosymbiote d’insecte, peut être classé en deux
catégories.
           Les endosymbiotes primaires ont été associés avec leur insecte hôte depuis des
millions d'années. Ils ont une forme d'association obligatoire et ils affichent une co-spéciation
avec leur hôte. Cette association, bénéfique aux deux organismes, permet à chacun des deux
partenaires de profiter des avantages de l’autre. Le rôle élémentaire de l’endosymbiote est de
fournir les nutriments, que l'hôte ne pourrait obtenir seul, en catabolisant la nourriture
inassimilable par l'insecte. Parmi ces endosymbiotes primaires des insectes, le plus étudié
reste la bactérie Buchnera qui colonise le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Buchnera est
capable de synthétiser les acides aminés essentiels que le puceron ne peut naturellement

                                                  21
Classe        Ordre           Famille           Genre                 Espèce              Pathogène                  Maladies
                                                                    Aedes aegypti                                      Dengue
                              Culicidae          Aedes                                     Flavivirus
                                                                  Aedes albopictus                                  Chikungunya
                                               Anopheles         Anopheles gambiae Plasmodium falciparum             Paludisme
                                                                    Culex pipiens         Plasmodium              Paludisme aviaire
                                                 Culex
                                                                Culex quinquefasciatus Nématodes parasites            Filariose
               Diptera
                           Psychodidae      Phlebotomus          Phlebotomus major         Leishmania               Leishmaniose
                           Drosophilidae     Drosophila              Drosophila          Non pathogènes
 Insecta                     Muscidae          Musca              Musca domestica       > 100 pathogènes          Typhoïde, choléra,
                                              Glossina
                             Glossinidae                          Glossina palpalis      Trypanosoma brucei      Maladie du Sommeil
                                           Mouche « tsé tsé »
                             Reduviidae       Triatoma            Triatoma infestans      Trypanoma cruzi         Maladie de Chagas
             Hemiptera                                                                   Buchnera aphidicola
                             Aphididae       Acyrthosiphon      Acyrthosiphon pisum
                                                                                             Non pathogène
                                                                                           Yersinia pestis             Peste
            Siphonaptera      Pulicidae        Xenopsylla        Xenopsylla cheopis
                                                                                           Ricketssia typhi        Typhus murin
Arachnida      Ixodida        Ixodidae           Ixodes           Ixodes scapularis      Borrelia burgdorferi     Maladie de Lyme


 Figure I.3: Quelques exemples d’insectes vecteur de l’Embranchement des arthropodes associés à l’organisme qu’ils transportent
 et la maladie provoquée (s’il y a lieu).
Introduction


obtenir par prise de nourriture tandis que ce dernier fournit à la bactérie un milieu riche lui
permettant de se répliquer (Douglas, 1998).
       L’association entre les endosymbiotes secondaires et leurs insectes s’est développée
plus récemment. Ces associations ne sont pas obligatoires et, dans la plupart des cas, on parle
de relations commensales, l’insecte ne tirant aucun bénéfice de leur interaction.


                     1.1.3. Relation entre les spiroplasmes et leurs insectes

       La plupart des espèces de spiroplasmes sont retrouvées dans l’intestin ou
l’hémolymphe de moustiques, mouches (tabanides) ou encore de tiques. De manière plus
surprenante, S. clarkii a été isolé de l’intestin d’une larve de scarabée (Whitcomb et al., 1993)
tandis que S. penaei a lui été retrouvé dans l’hémolymphe de la crevette grise, Penaeus
vannamei (Nunan et al., 2005). Plusieurs espèces de spiroplasmes ont également été
retrouvées infectant au moins 16 espèces différentes de Drosophila (Haselkorn et al., 2009).
       Quelques espèces ont également été décrites influençant le comportement de l’hôte.
Un spiroplasme a été caractérisé chez le puceron du pois. Il provoque une diminution de la
croissance et de la durée de vie du puceron ainsi qu’une baisse de la fertilité (Fukatsu et al.,
2001). S. poulsonii, l’agent du « sex-ratio », supprime la descendance mâle de plusieurs
espèces de drosophiles et se transmet de manière verticale (Williamson et al., 1999). S. apis et
S. melliferum sont des pathogènes de l’abeille Apis mellifera (Mouchès et al., 1982; Mouches
et al., 1984). D’autres encore, comme S. culiciola, S. sabaudiense, S. taiwanense sont
pathogènes pour le moustique Aedes aegypti dont ils réduisent la durée de vie et la fécondité.
De plus, S. taiwanense entraîne aussi un changement du sex-ratio en favorisant la
descendance mâle (Vazeille-Falcoz et al., 1994). La présence intracellulaire de S. mirum a
même été décrite dans des lésions cérébrales d’un patient atteint d’encéphalopathie (Bastian,
1979). Plus récemment, des expériences menées par le même groupe ont également montré
que ce spiroplasme, injecté de manière intracrânienne, produisait des symptômes comparables
avec ceux d’une encéphalopathie spongiforme (Bastian et al., 2007).
       Néanmoins, la plupart des mollicutes phytopathogènes ne semblent pas perturber le
comportement de l’insecte. S. citri ne semble avoir aucun effet sur la cicadelle au cours de son
circuit à l’intérieur de celle-ci. De même, lors de l’infection de Cacopsylla melanoneura par
Candidatus phytoplasma mali, le phytoplasme n’influence pas le développement ou la
longévité de ces insectes cependant il semble avoir quelques effets sur le fitness de ces
derniers (Malagnini et al., 2010).


                                               22
Figure I.4: Phylogénie de l’ordre des Hemiptera basée sur les études de phylogénie moléculaire.
(D’après Campbell et al., 1995 ; Sforza, 1998).
Introduction


            1.2. Insectes vecteurs

       Les insectes vecteurs de microorganismes appartiennent tous à l’embranchement des
arthropodes. Quelques familles d’insectes responsables de la vection de microorganismes, à
l’exception des mollicutes phytopathogènes, sont regroupées dans le tableau I.3.


                     1.2.1. Vecteurs mollicutes phytopathogènes

                              1.2.1.1.        Classification

       Les insectes vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent à l’ordre des
Hemiptera. La classification de ces insectes a longtemps été basée sur des caractères
morphologiques (couleur, taille, ailes antérieures, tête, thorax, abdomen, parties génitales
etc...). Les hemiptères ont un développement du type hémimétabole, c’est à dire que la
nymphe est mobile et ressemble aux larves, et possèdent plusieurs caractéristiques propres
comme des antennes longues, des pièces buccales avec un long rostre et deux paires d’ailes
dont l’une peut être cornée et durcie (hémiélytre).
       Ce n’est qu’en 1995, lors des travaux de Campbell et collaborateurs portant sur la
comparaison de séquences d’ADN ribosomiques 18S de ces insectes, que la classification des
hémiptères a été modifiée et est restée depuis, identique à celle présentée dans le tableau I.4
(Campbell et al., 1995).
       Dès lors, les insectes vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent, au sein
du sous-ordre des Cicadomorpha, à la famille des Cicadellidae (cicadelles) ; au sein de
l’infra-ordre des Fulguromorpha, à la famille des Cixiidae (cixides) et enfin, au sein de
l’ordre des Sternorrhyncha, à la famille des Psyllidae (psylles). Au sein de la famille des
Cicadellidae, les vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent principalement à la
sous-famille des Deltocephalinae.
       Dans la littérature, les membres de la famille des Cicadellidae sont regroupés sous le
terme de « leafhopper » tandis que l’infra-ordre des Fulguromorpha renferme deux familles
principales que sont les Cixiidae et les Delphacidae regroupée sous le terme de
« planthopper ». Quelques exemples de mollicutes phytopathogènes associés à leur insecte
vecteur sont présentés dans le tableau I.5.

                              1.2.1.2.        Vecteurs de S. citri

       Pour sa part, S. citri est transmis naturellement et expérimentalement par plusieurs
insectes (tableau I.5). De toutes les cicadelles précédemment décrites, C. tenellus (figure I.6)
est le vecteur majeur du spiroplasme dans le Sud-ouest des Etats-Unis (Rana et al., 1975; Liu
                                             23
Bactérie                                   Insecte vecteur              Famille taxonomique             Référence
                                                             Circulifer haematoceps                                         Fos et al. , 1986
                                                           Circulifer tenellus (Baker)                                   Oldfield et al. , 1976
                                                        Circulifer opacipennis (Lethierry)                              Sengonca et al. , 1991
                                                          Macrosteles fascifrons (stål)                                  O’Hayer et al ., 1983
                Spiroplasma citri                        Scaphytopius nitridus (DeLong)          Cicadellidae                Oldfield, 1977
                                                      Scaphytopius acutus delongii (Young)                              Kaloostian et al. , 1979
                                                      Scaphytopius coliforniensis (Hepner)                                   Oldfield, 1987
                                                                 Euscelis plebejus                                       Marckam et al ., 1974
                                                             Euscelidius variegatus                                 Marckam & Townsend, 1979
                                                                 Dalbulus maidis                                             Kunkel, 1946
              Spiroplasma kunkelii                                                               Cicadellidae             Chen & Liao, 1975
                                                               Dalbulus elimatus
                                                                                                                    Williamson et Whitcomb, 1975
             Phytoplasma Stolbur                              Hyalesthes obsoletus                 Cixiidae                 Fos et al. , 1992
     Phytoplasme de la Flavescence Dorée                    Scaphoideus titanus Ball            Cicadellidae                Caudwell, 1983
            Phytoplasme de l’ESFY                               Cacopsylla pruni                  Psyllidae              Carraro et al., 1998b
         Phytoplasme du Pear Decline                            Cacopsylla pyri                   Psyllidae              Carraro et al ., 1998a
   Phytoplasme de la proliferation du pommier               Cacopsylla melanoneura                Psyllidae                Alma et al ., 2000
        Candidatus phytoplasma ziziphi                        Hishimonus sellatus              Deltocephalidae             La & Woo, 1980
                                                              Scaphoideus luteolus                                            Baker, 1949
          Candidatus phytoplasma ulmi                                                            Cicadellidae
                                                               Macropsis mendax                                              Carraro, 2004
   Phytoplasme du rabougrissement du roncier                   Macropsis fuscula                 Cicadellidae      De Fluiter & Van der Meer, 1953
Phytoplasme de la jaunisse de la vigne du Palatinat              Oncopsis alni                   Cicadellidae               Maixnert, 2000
      Phytoplasme de la jaunisse de l’aulne                      Oncopsis alni                   Cicadellidae         Maixnert & Reinert, 1999


Figure I.5: Quelques exemples d’insectes vecteurs de Mollicutes phytopathogènes avec leur maladies associées.
Introduction


et al., 1983). Les vecteur identifiés dans le pourtour méditerranéen sont C. haematoceps
(figure I.6) (Fos et al., 1986) et C. tenellus (Rasooly et al., 1994). Ces cicadelles polyphages
se développent principalement sur des hôtes herbacés et sur les agrumes (rutacées) qui,
lorsqu’ils sont infectés par S. citri, présentent des taux d’infection élevés.
       La transmission de plante à plante se déroule selon un mode circulant multipliant. De
ce fait, dans l’insecte, S. citri effectue un circuit au cours duquel il passe successivement du
canal alimentaire, dans l’intestin moyen puis dans l’hémolymphe et gagne les glandes
salivaires de la cicadelle afin d’être excrété avec les sécrétions salivaires.
       La description anatomique de ces tissus nous permettra de mieux appréhender les
mécanismes mis en place par S. citri au cours de son trajet et notamment lors des
franchissements des deux barrières, que sont l’épithélium intestinal et celui des glandes
salivaires, indispensables à sa propagation.


                                1.2.1.3.       Morphologie des cicadelles

       Les pièces buccales des cicadelles sont composées du labrum, du labium et des stylets.
Seul les stylets pénétrent dans la plante lors du repas de l’insecte. Ils sont au nombre de quatre
et sont les vestiges des mandibules et des maxilles. La paire de stylets maxillaires se rejoint
pour former le canal salivaire et le canal alimentaire. Les stylets mandibulaires entourent en
partie les stylets maxillaires. Au niveau de la tête, les deux stylets maxillaires se séparent l’un
de l’autre et les fluides ingérés se retrouvent dans une chambre filtrante appelée precibarium.
Sa fonction est de réguler le flux de liquide avant qu’il n’entre dans le cibarium. Il est
composé d’une valve qui empêche notamment la régurgitation de fluides dans les stylets.
Le cibarium est une sorte de pompe qui constitue un sac situé dans la tête et composé d’une
couche de cellules épithéliales. Les fluides passent alors dans l’intestin antérieur de l’insecte
qui est relativement étroit avec une paroi mince et recouvert de chitine qui s’étend jusqu’au
mésothorax ou bien même jusqu’au premier fragment abdominal. Les cellules intestinales
possèdent des microvillosités à leur surface qui sont recouvertes d’une fine matrice de nature
polysaccharidique, le glycocalyx. L’épithélium intestinal est bordé d’une lame basale
composée d’un assemblage de filaments de collagène et d’une matrice amorphe constituée de
polysaccharides (Gouranton & Folliot, 1970).
       Chez les insectes se nourrissant de xylème et de phloème, une chambre filtrante s’est
formée permettant le passage direct de l’eau ingérée, contenant les substances en solution, de
l’intestin antérieur à l’intestin postérieur dans le but de concentrer la solution nutritive
(Forbes, 1969). A la jonction de l’intestin moyen et postérieur se trouvent les tubes de
                                                 24
Figure I.6: Principaux insectes vecteurs de Spiroplasma citri.
Photographies de Circulifer tenellus (à gauche) et de Circulifer haematoceps (à droite).




 Figure I.7: Représentation schématique de l’appareil salivaire de cicadelles.
 AG: glande salivaire accessoire. I à VIII: types cellulaires différents de la glande salivaire principale. (D’après
 Wayadande & Fletcher, 1995).
Introduction


Malpighi. Ils sont au nombre de quatre chez les cicadelles et sont composés de cellules
épithéliales très minces qui se divisent en deux parties, une partie distale qui servirait à la
sécrétion d’ions et à l’excrétion tandis que la partie proximale aurait une fonction dans la
réabsorption des solutés.
       Les cicadelles possèdent une paire de glandes salivaires situées de part et d’autre de
l’œsophage. De chaque côté, il y a une glande principale et une glande accessoire toutes les
deux composées de cellules conductrices et sécrétrices. Chaque glande salivaire principale est
composée de 8 types cellulaires différents et organisés en lobes concentriques. Ces cellules
sont différenciées en fonction de leur morphologie et de leur densité aux électrons. Elles sont
binucléées et regroupées en deux lobes. Le lobe antérieur est composé de 10 cellules de type
I, 6 cellules de type II, 4 cellules de type III et IV et 2 cellules de type V. Le lobe postérieur
est constitué de 5 cellules de type VI, 3 cellules de type VII et 4 cellules de type VIII (figure
I.7) (Wayadande et al., 1997).
       Les glandes salivaires accessoires sont reliées aux glandes salivaires principales par un
canal lui-même inséré dans le canal faisant la jonction avec le lobe antérieur et le lobe
postérieur des glandes salivaires principales. Ici, les cellules sont uninucléées.
       Les deux principaux canaux formés par chacune des deux glandes s’unissent pour
former un canal salivaire commun qui se dévide dans la pompe salivaire.
       Tous ces organes baignent dans l’hémolymphe, un fluide extracellulaire qui transporte
les métabolites vers les différents tissus de l’insecte. L’osmolarité de l’hémolymphe est
relativement élevée et comprise entre 240 et 600 mOsm. La principale source de carbone est
le tréhalose, sucre non réducteur composé de deux molécules de glucose. Ce fluide contient
également des lipides, des acides aminés libres, des acides inorganiques tel que l’acide
ascorbique et des ions Mg2+ et PO43- (Saglio & Whitcomb, 1979). Cette composition est
relativement proche de la composition du phloème de la plante à l’exception du sucre
majoritaire qui est le saccharose au lieu du tréhalose.


                     1.2.2. Circuit du spiroplasme dans l’insecte

       Après ingestion et un passage dans la pompe alimentaire, les spiroplasmes se
retrouvent dans l’intestin où la plupart sont digérés par les enzymes présentes. Les survivants
poursuivent leur route jusqu’au niveau de l’intestin moyen ou ils pénètrent dans les cellules
constituant l’épithélium intestinal situées dans une région dépourvue de chitine. Chez
Circulifer tenellus, S. citri pénètre dans ces cellules épithéliales en passant entre les
microvillosités (figure I.8A; (Kwon et al., 1999). Le spiroplasme franchit l’épithélium
                                                25
Passage de la barrière intestinale

        A                                                B

A




 A: S. citri pénétrant dans les cellules de l’épithélium intestinal de C. tenellus à travers les
 microvillosités. L: lumière intestinale, MV: microvillosités, S: spiroplasme. B: Zone proche du
 plasmalemme basal montrant les spiroplasmes dans des vacuoles d’endocytose. H: hémolymphe.
 Echelle: 0,5 µm. (Kwon et al., 1999)


 Libération dans l’hémolymphe




                                                                                             D
         C
 C: S. kunkelii franchissant la lame basale des cellules de l’épithélium intestinal de D. maidis (flèche
 avec l’étoile) ou bien libre dans l’hémolymphe de l’insecte (flèche à gauche). Bl: lame basale, Mt:
 tubes de Malpighi, Mi: mitochondrie, Gc: cellule intestinale, Pl: plasmalemme basal. Echelle: 0,5 µm.
 D: Agrandissement de la région encadrée montrant S. kunkelii avec une protubérance en forme de
 « tip » proche de la lame basale. (Ozbek et al., 2003).

 Passage de la barrière des glandes salivaires

            E                                                     F




 E: S. citri franchissant la lame basale des cellules de l’épithélium des glandes salivaires de C. tenellus
 dans une vacule d’endocytose. Bl: lame basale, S: spiroplasme, Er: réticulum endoplasmique. F: S. citri
 libre dans le canaliculus des glandes salivaires de C. tenellus. Echelle: 0,5 µm. (Kwon et al., 1999).



Figure I.8: Etapes clés du cycle des spiroplasmes dans leurs insectes vecteurs.
Introduction


intestinal par un mécanisme d’endocytose/exocytose au cours duquel il se retrouve dans une
vacuole d’endocytose où il adopte une forme ovoïde (figure I.8B ; (Ozbek et al., 2003)). Au
moment du passage dans l’hémolymphe de l’insecte, une protubérance de 70 nm de diamètre
est observée traversant la membrane de la vacuole (figure I.8C et D ; (Ozbek et al., 2003)).
Cette protubérance, non sans rappeler le « tip » observé chez plusieurs mycoplasmes (Rottem,
2003), regrouperait plusieurs protéines qui seraient les premières impliquées dans un rôle de
reconnaissance et de franchissement du plasmalemme intestinal (Ammar et al., 2004). Grâce à
l’intermédiaire de ce « tip », les vésicules d’endocytose fusionnent avec le plasmalemme
basal et les spiroplasmes sont donc libérés par exocytose. Ils se retrouvent alors dans
l’hémolymphe      où    ils   se   multiplient    massivement.     Un       nouveau   mécanisme
d’endocytose/exocytose leur permet de franchir la barrière des glandes salivaires puis, après
une nouvelle multiplication, ils sont expulsés dans le canal salivaire (figure I.8E et F; (Kwon
et al., 1999)).
        En résumé, pour sa transmission, le spiroplasme a besoin de franchir deux barrières, la
barrière intestinale et la barrière des glandes salivaires. Les franchissements de ces barrières
nécessitent des interactions entre S. citri et son insecte vecteur afin de pénétrer à l’intérieur
des cellules de son hôte. Or, les mécanismes moléculaires ainsi que les protéines impliquées
dans ces étapes d’adhésion aux cellules et d’internalisation dans celle-ci, restent encore
inconnus à ce jour.
        Pour d’autres organismes, les descriptions concernant ce processus d’invasion
permettraient de cerner les différents acteurs intervenant au cours de ces étapes et, par
analogie, faire un lien avec ce qui est connu concernant la transmission du spiroplasme.


        2. Cycle cellulaire de la transmission

        Le pouvoir pathogène d’un microorganisme intracellulaire repose sur sa capacité à
coloniser son hôte et, de ce fait, à envahir les cellules de celui-ci afin de s’y multiplier et de
s’y disséminer.
        L’ensemble de ce processus, nommé « invasion » tout au long de ce manuscrit, se
décompose en plusieurs étapes successives. Après avoir été ingéré par leur hôte, les
microorganismes doivent (i) adhérer aux cellules de leur hôte, (ii) pénétrer à l’intérieur de
celles-ci, (iii) se développer tout en évitant les mécanismes de défense mis en place puis (iv)
se disséminer de cellule à cellule afin d’être transmis à un nouvel hôte.



                                                 26
Figure I.9: Représentation des principaux types de pili décrits chez les bactéries   à
Gram-négatif et à Gram-positif.
(D’après Kline et al, 2009).
Introduction


        Le succès d’une invasion réside dans les signaux que les deux acteurs, la cellule et
l’agent pathogène, s’échangent perpétuellement. A chaque étape du processus d’infection,
l’agent pathogène exploite la machinerie cellulaire de l’hôte à son propre profit.


               2.1. Adhésion

        L’adhésion des microorganismes à des cellules eucaryotes est souvent une première
étape essentielle dans la mise en place de la maladie. En effet, étant de manière générale une
étape spécifique, l’adhésion permet au pathogène de se retrouver au niveau de tissus
appropriés, à partir desquels, il peut initier son processus d’entrée.
        De nombreuses molécules et de structures macromoléculaires, regroupées sous le
terme d’adhésines, permettent aux pathogènes d’assurer cette fonction. Ces adhésines peuvent
être divisées en deux familles : les adhésines de type fibrillaire et les adhésines de type non-
fibrillaire.


                        2.1.1. Adhésines de type fibrillaire

        Les adhésines de type fibrillaire sont des structures filamenteuses visibles à la surface
des bactéries. Ces structures ont été pour la première fois observées dans le début des années
50 par deux équipes. La première, dirigée par James Duguid, appela ces structures fimbriae
(« frange ») (Duguid et al., 1955), tandis que la seconde, dirigée par Charles Brinton, décida
de les nommer pili (« cheveux ») (Brinton, 1965). Bien que les deux termes soient
synonymes, et toujours d’actualité, le terme de pili sera préféré au cours de ce manuscrit. Les
principaux types de pili, décrits aussi bien chez les bactéries à Gram-négatif qu’à Gram-
positif, sont représentés sur la figure I.9.


                                2.1.1.1.       Bactéries à Gram-négatif

        Les pili ont été, pour la première fois, décrits chez les bactéries à Gram-négatif. Ce
sont des structures de 1 à 2 µm de long, formées par l’association de plusieurs sous-unités,
généralement regroupées sous le terme de « pilines », formant des structures polymériques qui
permettent d’éviter la répulsion des charges négatives présentes à la surface des cellules de la
bactérie et de celles de l’hôte, retardant ainsi l’activation du système immunitaire de l’hôte
(Kline et al., 2009).
        Trois principaux types de pili sont connus et se distinguent essentiellement par leurs
structures, mais aussi par leurs mécanismes de formation et de régulation qui, bien
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  • 1. Université Victor Segalen Bordeaux 2 Année 2010 Thèse n° THÈSE pour le DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 Mention : Sciences Biologiques et Médicales Option : Biologie-Santé Présentée et soutenue publiquement Le 20 Décembre 2010 Par Fabien LABROUSSAA Né le 15 Mars 1984 à Pau (Pyrénées-Atlantiques) INTERACTIONS ENTRE SPIROPLASMA CITRI ET SON INSECTE VECTEUR CIRCULIFER HAEMATOCEPS La phosphoglycérate kinase de S. citri : une « actin-binding protein » impliquée dans la transmission du spiroplasme par la cicadelle Membres du Jury M. BONNEU M., Professeur à l’IPB ENSTBB de Bordeaux ............................ Président Mme. BRAULT V., Directrice de Recherche à l’INRA de Colmar ................... Rapporteur M. HEDDI A., Professeur à l’INSA de Lyon ..................................................... Rapporteur Mme. MARZACHI C., Chercheur à l’Institut de Virologie Végétale de Turin . Examinateur M. LANDRY M., Professeur à l’Université de Bordeaux 2 ............................... Examinateur Mme. SAILLARD C., Maître de Conférence à l’Université de Bordeaux 2 Directrice de thèse
  • 2.
  • 3. THÈSE pour le DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 Mention : Sciences Biologiques et Médicales Option : Biologie-Santé Présentée et soutenue publiquement Le 20 Décembre 2010 Par Fabien LABROUSSAA Né le 15 Mars 1984 à Pau (Pyrénées-Atlantiques) INTERACTIONS ENTRE SPIROPLASMA CITRI ET SON INSECTE VECTEUR CIRCULIFER HAEMATOCEPS La phosphoglycérate kinase de S. citri : une « actin-binding protein » impliquée dans la transmission du spiroplasme par la cicadelle
  • 4.
  • 6.
  • 7. Remerciements Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de l’Unité Mixte de Recherche 1090 Génomique et Diversité du Pouvoir Pathogène (Institut National de la Recherche Agronomique et Université Victor Ségalen Bordeaux 2), dirigé par Mr Alain Blanchard, sous la direction de Mme Colette Saillard. Je tiens tout d’abord à remercier Mr Blanchard pour m’avoir permis de réaliser ma thèse, ainsi que mes précédents stages de Master 1 et 2, dans son laboratoire. Je souhaite également remercier Mr Bonneu de me faire l’honneur de présider ce jury. Je tiens à adresser mes plus sincères remerciements à Mme V. Brault et Mr A. Heddi d’avoir accepté d’examiner et de juger ce manuscrit. Je remercie également Mme C. Marzachi et Mr M. Landry d’avoir accepté de participer à ce jury de thèse. Un grand merci à Colette pour m’avoir accompagné pendant ces quatre dernières années. Merci pour son encadrement de chaque instant, pour m’avoir laissé la liberté de m’exprimer pleinement dans mon travail. Merci également pour les nombreuses heures passées à la correction de ce manuscrit et aussi lors de chacune de mes présentations orales. Si ces années de thèse ont été un réel plaisir pour moi, c’est en grande partie grâce à elle. J’espère que si j’avais à être le dernier thésard de ta carrière, j’aurais été à la hauteur de mes prédécesseurs. J’adresse aussi un grand merci à Joël et Sybille pour leur encadrement pendant mon stage de M1. Merci à Joël pour toutes les discussions scientifiques ou non, très utiles tout au long de ces années. Merci à Sybille pour son encadrement et sa rigueur qui m’ont apporté toutes les bases indispensables au travail de laboratoire. Merci à vous deux pour votre soutien. Je tiens à remercier Marie-Pierre pour sa formidable gentillesse et sa disponibilité sans failles. Merci pour m’avoir formé à toutes les techniques de Protéomique. Merci aussi pour m’avoir épargné de nombreuses taches chronophages (commandes, micro-injections des insectes, solutions, etc…). J’adresse un grand merci à Nathalie, ma nouvelle voisine de bureau, pour tout ce temps consacré aux manips de microscopie confocale. Merci aussi pour les cellules de Circulifer haematoceps. Mon travail n’aurait pas été le même sans le tien. Promis ! A la fin de ma thèse, je te donne mon bureau que tu jalouses depuis ces derniers mois ! Je remercie énormément Laure, une des rares personnes au monde à se battre pour faire des tests statistiques ! Merçi d’avoir consacrer du temps à l’éveil d’un néo-biochimiste. Je remercie ici une source intarissable d’idées, de conseils et de connaissances dans de nombreux domaines scientifiques. Je tiens également à remercier Michel Castroviejo pour avoir accepté de me prêter pour quelques heures tous ses appareils de chromato mais aussi pour sa gentillesse au cours de chacune de mes visites. Un grand Merci collectif et sincère à tout le labo « Molli ». Aux « IPPistes », Pascal SP, Claire et Guillaume et pour le travail sur Mycoplasma mycoïdes. A toute l’équipe « Phyto » au sens large : Xavier, Sylvie, Delphine, Anne, Gulnara, Sandrine, Christophe, Jam, Pascal S et Jean-Luc. A Jacqueline pour ces conseils et pour tous les autoclavages réalisés en « urgence ». 3
  • 8.
  • 9. Aux « serristes », Kaelig et Denis, pour s’occuper de toutes nos bizarreries, pour leurs connaissances pour le secours et le dépannage d’appareils défectueux, sans oublier leurs talents pour le barbecue ! Vous êtes dignes de votre illustre prédécesseur, Patrick, que je remercie également sincèrement pour son travail et sa personnalité. Aux secrétaires, Evelyne et Isa, pour leurs disponibilités et leurs sourires. Peut-être que j’arriverais un jour à vous pardonner pour les pérégrinations italiennes…. Merci aussi à Marc, Laure, Clothilde et Cédric pour les moments « détente » : pause-café, Sodexo et quelques soirées. Je me souviendrais encore longtemps des discussions non-scientifiques improbables et variées qui animaient ces moments-là. Merci à Marc pour m’avoir enseigné tous les secrets du « Bob Whitcomb Award » ! J’ai une pleine bacholle de souvenirs, y’en aura de reste ! Je tiens à remercier Suzann pour avoir mis à ma disposition ses indéniables talents artistiques pour le dessin de Circulifer haematoceps. J’espère arriver à le mettre aussi bien en valeur que ce qu’il le mérite. Toutes les brèves discussions de fin d’après-midi étaient un réel plaisir. Je remercie également Lise et Laura pour leur travail au cours de leurs stages de M1. Bonne chance à vous pour la suite. Anne, Claire et Jam, compagnons de thèse, une pensée spéciale pour vous. Bonne chance pour la suite et j’espère qu’on aura la chance de se revoir plus tard dans quelques congrès sur quelques îles paradisiaques…. En résumé, un grand merci à vous tous qui m’avait permis d’évoluer dans un cadre agréable et propice au travail et fait de ma thèse une superbe expérience et un tremplin pour ma carrière. Assez parlé travail ! Je remercie, du fond du cœur, mes parents qui m’ont toujours permis d’étudier en toute sérénité. Merci pour l’intérêt que vous avez toujours porté à mes études. Je vous en serais éternellement reconnaissant. Je remercie toute ma « famille ». Merci de votre soutien pendant toutes ces années et de m’avoir permis de m’échapper du monde de la Recherche à chaque fois. Yves, Marie-Lucienne, Ben, Carole, Arnaud (compagnon de galère…Courage !) et Poys, merci de m’avoir accueilli dans votre tribu et fait partager de si bons moments. Un grand merci à tous mes amis et plus particulièrement Flo, Céc, David, Camille et Lio. Que ce soit à Paris, Brive, Seignosse ou Pau, il y avait toujours une bonne excuse pour fêter quelque chose ! Bonne nouvelle, voilà une nouvelle raison de faire la fête ! Même si mes recherches restent relativement floues et obscures pour beaucoup d’entre vous, je n’aurais rien réussi sans vous ! Une dernière pensée toute particulière pour Marie qui m’a supporté avant la thèse, pendant ma thèse (miracle !) et qui, j’espère, me supportera encore de longues années après. 4
  • 10.
  • 11. Liste des publications et des communications à des congrès Labroussaa, F.; Dubrana, M.P., Béven, L., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C. A minimal actin-binding region of the S.citri phosphoglycerate kinase is implicated in the transmission process by the insect vector Circulifer haematoceps. Soumis à publication à Applied and Environmental Microbiology . Labroussaa, F. ; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C. Entry of Spiroplasma citri into Circulifer haematoceps cells involves interaction between spiroplasma phosphoglycerate kinase and leafhopper actin. Applied and Environmental Microbiology. 2010, 76(6); 1879-1886. Labroussaa, F., Arricau-Bouvery, N., Breton, M., Dubrana, M.P., Duret, S., Bové, J.M., Renaudin, J. & Saillard, C*. Transmission of the phytopathogenic mollicute “Spiroplasma citri” by its leafhopper vector “Circulifer haematoceps” involves plasmid-encoded determinants and phosphoglycerate kinase protein from the spiroplasma. 18th Conference of the International Oraganization of Citrus Virologists (IOCV), 8-12/11/2010, Campiñas (Brésil). COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P., Béven, L., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C. Deciphering the role of the Spiroplasma citri phosphoglycerate kinase in the internalization into its insect vector cells. 16ème colloque Biologie de l’Insecte, 18-20/09/2010, Lyon. COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C. Interactions between Spiroplasma citri and its insect vector Circulifer haematoceps: the dual role of the phosphoglycerate kinase. 18ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM), 11-16/07/2010, Chianciano (Italie). COMMUNICATION ORALE récompensée par le prix Robert Whitcomb. Béven, L., Bouyssou, G., Charenton, C., Dautant, A., Labroussaa, F., Sköllermo, A., Perrson, A., Blanchard, A. & Sirand-Pugnet, P. Putative membrane ATPase of mycoplasmas: a specific evolution of ATP synthase F1 subunit. 18ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM), 11-16/07/2010, Chianciano (Italie). POSTER. Labroussaa, F.*; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C. Transmission de S.citri par son insecte vecteur: rôle de la phosphoglycérate kinase dans l’invasion des cellules de l’hôte. 10ème Journée scientifique de l'Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé; 28/04/2010; Arcachon. POSTER. Labroussaa, F.*; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C. Interactions entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur, la cicadelle Circulifer haematoceps : le double jeu de la phosphoglycérate kinase. 9ème Rencontres Plantes-Bactéries ; 18-22/01/2010, Aussois. COMMUNICATION ORALE. 5
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  • 13. Labroussaa, F. ; Arricau-Bouvery, N.*; Dubrana, M.P. & Saillard, C. La phosphoglycérate kinase inhibe l'internalisation de Spiroplasma citri dans les cellules en culture de son insecte vecteur Circulifer haematoceps. Congrès IMMUNINV; 21-23/10/2009; Poitiers. COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P. ; Saillard, C. & Arricau-Bouvery, N. Interactions protéine-protéine entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps. 1ère Journées des doctorants du Département SPE, 2-3/09/2009, Rennes. COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F. ; Dubrana, M.P. ; Saillard, C. & Arricau-Bouvery, N*. La phosphoglycérate kinase de Spiroplasma citri, une actin-binding protein impliquée dans l'internalisation du spiroplasme dans les cellules de son insecte vecteur. 7ème Colloque national de la Société Française de Phytopathologie (SFP); 08-11/06/2009; Lyon. COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F.*; Dubrana-Ourabah, M.P. ; Bouvery, N. & Saillard, C. Interaction protéines-protéines entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps : identification de protéines d'insectes potentiellement impliquées dans la transmission. 9ème Journée scientifique de l'Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé; 08/04/2009; Arcachon. POSTER. Labroussaa, F.*; Dubrana-Ourabah, M.P. ; Bouvery, N. & Saillard, C. Mise en évidence chez la cicadelle Circulifer haematoceps, de protéines potentiellement impliquées dans la transmission de Spiroplasma citri. 8ème Rencontres Plantes-Bactéries ; 14-18/01/2008; Aussois. COMMUNICATION ORALE récompensée par le prix de la meilleure communication orale. Labroussaa, F. ; Bouvery, N. ; Dubrana-Ourabah, M.P. & Saillard, C*. Interaction between Spiroplasma citri and the actin cytoskeleton of its insect vector's salivary gland cells. 17ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM); 06-11/07/2008; Tianjin (Chine). COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F. ; Dubrana-Ourabah, M.P.*; Bouvery, N. & Saillard, C. Interaction protéines-protéines entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps : identification de protéines d'insectes potentiellement impliquées dans la transmission. 7ème Rencontre francophone de Mycoplasmologie; 17-18/07/2007; Lyon. COMMUNICATION ORALE. Bouvery, N.*; Labroussaa, F. ; Martin, E. ; Dubrana, M.P. ; Renaudin, J. & Saillard, C. Interaction entre les protéines de Spiroplasma citri et celles du cytosquelette des cellules des glandes salivaires de son insecte vecteur Circulifer haematoceps. 15ème Colloque Physiologie de l'Insecte; 09-11/07/2007; Rennes. COMMUNICATION ORALE. * auteur qui a présenté la communication ou le poster. 6
  • 14.
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  • 17. INTRODUCTION I. Les mollicutes .................................................................................................................. 12 1. Taxonomie......................................................................................................................... 12 2. Phylogénie......................................................................................................................... 13 3. Evolution et caractéristiques importantes ......................................................................... 13 II. Mollicutes phytopathogènes............................................................................................. 14 1. Phytoplasmes..................................................................................................................... 15 2. Spiroplasmes phytopathogènes ......................................................................................... 16 2.1. Spiroplasma phoeniceum et Spiroplasma kunkelii.................................................... 16 2.2. Spiroplasma citri ....................................................................................................... 17 2.2.1. Description de la maladie et mise en culture..................................................... 17 2.2.2. Caractéristiques de S. citri................................................................................. 18 2.2.3. S. citri, un organisme modèle pour l’élaboration d’outils génétiques............... 19 III. Transmission de microorganismes intracellulaires .......................................................... 21 1. Transmission par insecte vecteur ...................................................................................... 21 1.1. Relation entre le microorganisme et son insecte ....................................................... 21 1.1.1. Transmission externe......................................................................................... 21 1.1.2. Transmission intracellulaire .............................................................................. 21 1.1.3. Relation entre les spiroplasmes et leurs insectes............................................... 22 1.2. Insectes vecteurs........................................................................................................ 23 1.2.1. Vecteurs mollicutes phytopathogènes ............................................................... 23 1.2.1.1. Classification................................................................................................. 23 1.2.1.2. Vecteurs de S. citri ........................................................................................ 23 1.2.1.3. Morphologie des cicadelles ........................................................................... 24 1.2.2. Circuit du spiroplasme dans l’insecte................................................................ 25 2. Cycle cellulaire de la transmission.................................................................................... 26 2.1. Adhésion.................................................................................................................... 27 2.1.1. Adhésines de type fibrillaire ............................................................................. 27 2.1.1.1. Bactéries à Gram-négatif............................................................................... 27 2.1.1.2. Bactéries à Gram-positif................................................................................ 29 2.1.2. Adhésines de type non-fibrillaire ...................................................................... 30 2.1.2.1. Autotransporteurs .......................................................................................... 30 2.1.2.2. Effecteur Tir (translocated intimin receptor) ................................................ 30 2.1.2.3. Hémagglutinine filamenteuse (FHA) ............................................................ 31 2.1.2.4. Système de sécrétion de type 3 (SSTT) ........................................................ 31 2.1.3. Adhésion chez les mollicutes ............................................................................ 33 2.1.3.1. Mycoplasmes................................................................................................. 33 2.1.3.2. Phytoplasmes................................................................................................. 33 2.1.3.3. Spiroplasmes ................................................................................................. 35 2.2. Internalisation............................................................................................................ 35 2.2.1. Voie clathrine-dépendante................................................................................. 35 2.2.2. Phagocytose....................................................................................................... 36 2.2.2.1. « Zipper » mécanisme ................................................................................... 36 2.2.2.2. « Trigger » mécanisme.................................................................................. 37 2.2.2.3. Voie dépendante des microtubules................................................................ 37 2.2.3. Mycoplasmes..................................................................................................... 38 2.2.4. Virus .................................................................................................................. 39 2.2.5. Franchissement de la barrière des glandes salivaires ........................................ 40 2.3. Echappement à la machinerie lysosomiale................................................................ 41 2.3.1. Arrêt de la maturation des phagosomes ............................................................ 41 7
  • 18.
  • 19. 2.3.2. Libération de la vacuole .................................................................................... 42 2.3.3. Détournement du système lysosomial............................................................... 42 2.4. Dissémination dans l’hôte ......................................................................................... 42 3. Déterminants génétiques de la transmission de Spiroplasma citri.................................... 43 3.1. Transmission expérimentale de S. citri ..................................................................... 43 3.2. Identification de protéines chez S. citri candidates dans la transmission.................. 44 IV. Situation du sujet et objectifs de recherche ...................................................................... 46 CHAPITRE 1: Interactions protéine-protéine entre S. citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps I. Introduction et objectifs ................................................................................................... 48 II. Résultats et discussion...................................................................................................... 51 1. Publication 1...................................................................................................................... 51 2. Résultats supplémentaires ................................................................................................. 52 2.1. Identification de protéines d’insectes impliquées dans une interaction avec S. citri 52 2.1.1. Comparaison des far Western monodimensionnels (1-D) réalisés avec les protéines totales et de glandes salivaires d’insectes.......................................................... 52 2.1.2. Far Western bi-dimensionnel (2-D) avec les protéines totales et celles des glandes salivaires d’insectes.............................................................................................. 53 2.1.3. Identification des protéines d’insectes impliquées par spectrométrie de masse 54 2.1.3.1. Signaux d’interaction communs aux deux far Western. ........................... 54 Signal d’interaction à 42 kDa : l’actine..................................................................... 54 Signal d’interaction à 50 kDa : la tubuline................................................................ 55 Signal d’interaction à 25 kDa : Rab GTPases ........................................................... 56 2.1.3.2. Signal spécifique du far Western réalisé avec les protéines des glandes salivaires d’insectes....................................................................................................... 57 Signal d’interaction à 27 kDa : la protéine 14-3-3 .................................................... 57 2.2. Recherche et identification du partenaire de l’actine chez S. citri ............................ 57 2.2.1.1. Transmembrane conserved hypothetical lipoprotein (SPICI 03-098)........... 58 2.2.1.2. La phosphoglycérate kinase (PGK)............................................................... 59 III. Conclusion........................................................................................................................ 59 CHAPITRE 2: Caractérisation de la région minimale de liaison à l’actine de la PGK de S. citri et implication dans la transmission I. Introduction et objectifs ................................................................................................... 62 II. Résultats et discussion...................................................................................................... 64 1. Publication 2...................................................................................................................... 64 2. Résultats supplémentaires et discussion............................................................................ 74 2.1. Recherche du mécanisme d’interaction entre la PGK et l’actine.............................. 74 2.2. Recherche d’homologie de séquences chez la PGK d’autres organismes. ............... 76 2.3. Localisation de la PGK ............................................................................................. 77 III. Conclusion........................................................................................................................ 78 CHAPITRE 3: Réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de phosphoglycérate kinase I. Introduction ...................................................................................................................... 80 II. Résultats ........................................................................................................................... 81 1. Construction du vecteur pGOTpgk ................................................................................... 81 2. Obtention et sélection des clones délétés dans le gène pgk............................................... 82 8
  • 20.
  • 21. 3.Recherche du site d’intégration du pGOTpgk dans le chromosome de S. citri ................ 83 3.1. Approche par PCR pour détecter une intégration au niveau de l’OriC ou du promoteur de la spiraline....................................................................................................... 84 3.2. Approche par PCR « aléatoire »................................................................................ 84 4. Identification des gènes dans le chromosome de S. citri ayant subi l’intégration ............ 85 III. Discussion et conclusion .................................................................................................. 86 CHAPITRE 4: Étude préliminaire de complexes protéiques impliqués dans la transmission de S.citri par l’insecte vecteur I. Introduction et objectifs ................................................................................................... 88 II. Résultats et discussion...................................................................................................... 90 1. Recherche de complexes par la technique de BN-PAGE chez S. citri. ............................ 90 1.1. Extraction et analyse des complexes membranaires. ................................................ 91 1.2. Extraction et analyse des complexes cytosoliques. ................................................... 92 2. Recherche chez S. citri des complexes impliquant la PGK .............................................. 94 2.1. Protéines associées à la PGK dans des complexes connus ....................................... 96 III. Discussion et conclusion .................................................................................................. 99 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES I. Hypothèses concernant le cycle de S. citri dans l'insecte C. haematoceps .................... 102 1. Franchissement de la barrière de l'épithélium intestinal ................................................. 102 2. Franchissement de la barrière des glandes salivaires ...................................................... 102 2.1. Franchissement de la lame basale des glandes salivaires........................................ 102 2.2. Adhésion au plasmalemme des glandes salivaires .................................................. 103 2.3. Internalisation dans les cellules des glandes salivaires ........................................... 104 2.4. Devenir des vésicules d'endocytose contenant S. citri ............................................ 105 2.5. Libération dans le canal salivaire ............................................................................ 105 II. Perspectives .................................................................................................................... 106 MATERIELS ET METHODES I. Matériel biologique ........................................................................................................ 109 1. Spiroplasma citri : souches et conditions de culture....................................................... 109 2. Escherichia coli : souches et utilisation .......................................................................... 109 3. L’insecte vecteur : la cicadelle Circulifer haematoceps ................................................. 110 3.1. Origine et conditions d’élevage............................................................................... 110 3.2. Capture et dissection des cicadelles ........................................................................ 110 3.3. Obtention d’une lignée cellulaire ............................................................................ 111 II. Plasmides........................................................................................................................ 111 1. Commerciaux .................................................................................................................. 111 1.1. pBS .......................................................................................................................... 111 1.2. pET28a(+) ............................................................................................................... 112 2. Obtenus au laboratoire .................................................................................................... 112 2.1. pGOT1..................................................................................................................... 112 III. Méthodes d’analyse d’ADN........................................................................................... 113 1. Purification de l’ADN génomique de S. citri.................................................................. 113 2. Purification de l’ADN plasmidique................................................................................. 113 3. Purification de fragments d’ADN à partir de gel d’agarose............................................ 113 4. Hydrolyse par les endonucléases de restriction............................................................... 114 9
  • 22.
  • 23. 5. Analyse des fragments d’ADN sur gel d’agarose ........................................................... 114 6. Amplification d’ADN par PCR....................................................................................... 114 7. Mutagénèse dirigée ......................................................................................................... 115 8. Clonage de fragment d’ADN amplifié par PCR ............................................................. 115 8.1. Préparation du fragment PCR ................................................................................. 115 8.2. Préparation du vecteur............................................................................................. 116 8.3. Ligation du fragment PCR et de son vecteur .......................................................... 116 9. Transformation des bactéries .......................................................................................... 116 9.1. E. coli ...................................................................................................................... 116 9.1.1. Electrocompétentes ......................................................................................... 116 9.1.2. Chimiocompétentes......................................................................................... 117 9.2. S. citri ...................................................................................................................... 118 10. Marche sur le chromosome ......................................................................................... 118 IV. Méthodes d’analyse des protéines.................................................................................. 119 1. Extraction des protéines .................................................................................................. 119 1.1. Préparation des protéines de S. citri ........................................................................ 119 1.1.1. Protéines pour l’électrophorèse mono-dimensionnelle ................................... 119 1.1.2. Protéines pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle ......................................... 120 1.1.3. Fractionnement des protéines membranaires .................................................. 120 1.2. Préparation des protéines de C. haematoceps ......................................................... 120 1.2.1. Totales ............................................................................................................. 120 1.2.2. Glandes salivaires............................................................................................ 121 1.2.3. Pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle......................................................... 121 2. Production de protéines recombinantes tagguées His6 .................................................... 121 2.1. His6-PGK................................................................................................................. 121 2.2. His6 PGK FL1, 2, 3, 4, 5 ......................................................................................... 122 3. Purification des protéines par chromatographie liquide.................................................. 123 3.1. Colonne de protein A Sépharose CL-4B................................................................. 123 3.2. Purification de protéines recombinantes ................................................................. 124 3.2.1. IMAC (immobilized metal affinity chromatography)..................................... 124 3.2.2. Chromatographie d’exclusion ......................................................................... 125 3.2.3. Fractionnement sur colonne échangeuse d’ions.............................................. 126 4. Dosage des protéines ....................................................................................................... 126 4.1. Bradford .................................................................................................................. 126 4.2. Bradford modifié ..................................................................................................... 126 5. Séparation des protéines en gel d’électrophorèse ........................................................... 127 5.1. Electrophorèse mono-dimensionnelle ..................................................................... 127 5.1.1. Gels de polyacrylamide à concentration constante ......................................... 127 5.1.2. Gels en gradient de polyacrylamide 4-15 % ................................................... 127 5.2. Electrophorèse bi-dimensionnelle ........................................................................... 128 6. Visualisation des protéines après électrophorèse ............................................................ 129 6.1. Coloration au bleu colloïdal .................................................................................... 129 6.2. Coloration au nitrate d’argent classique.................................................................. 129 6.3. Coloration au nitrate d’argent compatible avec la spectrométrie de masse ............ 130 6.3.1. Méthode O’Connell et al, 1997....................................................................... 130 6.3.2. Kit Proteosilver™ Silver Stain........................................................................ 130 7. Transfert des protéines et détection immunologique ...................................................... 131 7.1. Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose............................... 131 7.2. Détection immunologique des protéines sur membrane ......................................... 131 8. Etude d’interaction protéine-protéine par la technique de far Western .......................... 132 9. Identification des protéines par spectrométrie en masse................................................. 132 10
  • 24.
  • 25. 10. Etude des complexes protéines chez S. citri ............................................................... 133 10.1. Technique de Blue-Native PAGE ....................................................................... 133 10.1.1. Préparation des protéines ................................................................................ 133 10.1.2. Electrophorèse des protéines ........................................................................... 133 10.1.2.1. 1ère dimension ............................................................................................ 133 10.1.2.2. 2ème dimension........................................................................................... 134 10.2. Pontage des complexes protéiques associant la PGK chez S. citri ..................... 134 10.2.1. Préparation des protéines ................................................................................ 134 10.2.2. Purification sur colonne de Nickel .................................................................. 135 V. Etude de la transmission expérimentale de S. citri......................................................... 135 1. Transmission à la pervenche de Madagascar Catharanthus roseus................................ 135 1.1. Insectes .................................................................................................................... 135 1.2. Les pervenches de Madagascar ............................................................................... 135 1.3. Micro-injection intra-abdominale des cicadelles .................................................... 135 1.4. Transmission à la pervenche de Madagascar .......................................................... 136 1.5. Symptomatologie .................................................................................................... 136 2. « Recrachage » à travers une membrane de Parafilm® .................................................. 137 2.1. Injection de la culture de S. citri GII3 dans l’insecte .............................................. 137 2.2. Injection des protéines recombinantes dans l’insecte ............................................. 137 2.3. Transmission à travers une membrane de Parafilm® ............................................. 137 2.4. Mise en culture des spiroplasmes à partir des insectes ........................................... 137 3. Effet de la PGK et des peptides sur l’adhésion et/ou l’internalisation............................ 138 3.1. Adhésion.................................................................................................................. 138 3.2. Internalisation.......................................................................................................... 138 4. Observations au microscope confocal............................................................................. 139 4.1. Glandes salivaires de C. haematoceps infectées ..................................................... 139 4.2. Cellules de C. haematoceps incubées avec la His6-PGK ........................................ 140 REFERENCES………………………………………………………………………………….141 11
  • 26.
  • 28. Classification Guanine+Cytosine Taille du génome Besoin en (moles %) (kpb) Cholestérol Tween 80 Ordre I: MYCOPLASMATALES Famille I: MYCOPLASMATACEAE Genre I: Mycoplasma 23-40 580-1350 Oui Non Genre II: Ureaplasma 27-30 760-1170 Oui Non Ordre II: ENTOMOPLASMATALES Famille I: ENTOMOPLASMATACEAE Genre I: Entomoplasma 27-29 790-1140 Oui Non Genre II: Mesoplasma 27-30 870-1100 Non Oui Famille II: SPIROPLASMATACEAE Genre I: Spiroplasma 25-30 780-2220 Oui∗ ∗ Non Ordre III: ACHOLEPLASMATALES Famille: ACHOLEPLASMATACEAE Genre: Acholeplasma 26-36 1500-2085 Non Non Candidatus Phytoplasma 25-30 600-1240 Ordre IV: ANAEROPLASMATALES Famille: ANAEROPLASMATACEAE Genre I: Anaeroplasma 29-34 1500-1600 Oui Non Genre II: Asteroleplasma 40 1500 Non Non Tableau I.1: Classification des membres de l’ordre des Mollicutes. ∗: S. floricola, S. apis, S. chinense, et les spiroplasmes du groupe XII peuvent se multiplier dans un milieu sans sérum. (Rose et al., 1993)
  • 29. Introduction Introduction I. Les mollicutes Les mollicutes sont des eubactéries sans paroi présents chez l’homme, les animaux, les insectes et les plantes. Leur découverte date de la fin du 19ème siècle lorsque Nocard et Roux cultivèrent pour la première fois l’agent de la péripneumonie contagieuse bovine, Mycoplasma mycoïdes (Nocard & Roux, 1898). Ce nom de mycoplasme ne sera donné qu’en 1929 par Nowak, à la suite de l’apparition de filaments évoquant des formes mycéliennes qui apparaissent au cours de la culture de cette bactérie. Ce n’est qu’en 1967 que l’ensemble des mycoplasmes fut regroupé dans la classe des Mollicutes (Edward & Freundt, 1967). 1. Taxonomie La classe des Mollicutes est constituée de plusieurs centaines d’espèces réparties en 4 ordres, eux-mêmes répartis en 5 familles et 8 genres (Tableau 1.1 ; (Tully et al., 1993; Razin et al., 1998)). L’ordre des Mycoplasmatales est constitué d’une seule famille, la famille des Mycoplasmataceae comprenant deux genres: le genre Mycoplasma et le genre Ureaplasma. Dans cet ordre, les organismes ont besoin de cholestérol pour leur croissance et sont majoritairement aérobies. Les mollicutes du genre Ureaplasma ont la capacité d’hydrolyser l’urée. Leurs hôtes sont préférentiellement l’homme et les animaux. L’ordre des Acholeplasmatales comprend une seule famille, les Acholeplasmataceae, ne contenant que le genre Acholeplasma dont les organismes n’ont pas besoin de cholestérol pour leur croissance. Ces organismes sont quant à eux présents chez les mammifères, les insectes et les plantes. L’ordre Anaeroplasmatales regroupe des bactéries, anaérobies, isolées uniquement de la panse des ruminants et classées en une famille, les Anaeroplasmataceae, comprenant deux genres. Les membres du genre Anaeroplasma ont besoin de cholestérol pour leur croissance contrairement aux membres du genre Asteroleplasma. Les Entomoplasmatales sont des mollicutes isolés de la surface de plantes et d’arthropodes. Cet ordre est scindé en deux familles : la famille des Entomoplasmataceae, constituée des deux genres Mesoplasma et Entomoplasma, et celle des Spiroplasmataceae, représentée par un seul genre, le genre Spiroplasma. Les spiroplasmes sont caractérisés par 12
  • 30. Figure I.2: Arbre phylogénétique basé sur les séquences d’ADNr des Mollicutes. (D’après Sirand-Pugnet, 2007.)
  • 31. Introduction leur morphologie hélicoïdale et leur motilité. Ils sont plus ou moins exigeants en stérols. Les habitats des spiroplasmes sont les invertébrés, la surface des plantes mais également, pour trois d’entre eux uniquement, les tubes criblés du phloème. De nombreux mollicutes n’ont pas encore été cultivés en milieu acellulaire. De ce fait, leur statut taxonomique n’a pu être établi selon les standards minimaux de définition d’espèce. C’est en particulier le cas des phytoplasmes qui se multiplient dans les insectes et les tubes criblés du phloème. 2. Phylogénie Des études phylogénétiques basées sur l’ADN 16S de ces bactéries ont montré que les mollicutes ont évolué de manière régressive à partir d’un ancêtre bactérien à Gram-positif et à faible pourcentage en base G+C (Woese, 1987). Cet ancêtre serait commun avec certaines Clostridia, comme Clostridium innocuum et Clostridium ramosum, dont ils partagent la propriété d’être insensible à la rifampicine (Gadeau et al., 1986). Cette évolution régressive est marquée notamment par une réduction de la taille de leur génome engendrée par la perte massive de gènes non essentiels à l’autoréplication. Ces études ont également permis de situer les phytoplasmes par rapport aux autres mollicutes (Woese, 1987). Selon ces critères, les phytoplasmes sont apparentés aux acholéplasmes. De manière plus surprenante, les mycoplasmes du groupe mycoïdes, ainsi que Mycoplasma capricolum, appartiennent à la même branche phylogénétique que les spiroplasmes, bien que se trouvant dans des ordres différents dans la classification taxonomique. La classification phylogénétique des mollicutes est représentée figure I.2 où ces derniers sont regroupés en 4 groupes phylogénétiques distincts : les groupes pneumoniae, hominis, spiroplasma et phytoplasma/acholeplasma (Sirand-Pugnet et al., 2007). 3. Evolution et caractéristiques importantes Il a été suggéré que les mollicutes évoluent plus rapidement que les autres bactéries (Woese et al., 1984). Cette vitesse d’évolution rendrait compte de leur positionnement sur les plus longues branches de l’arbre universel de la vie (Ciccarelli et al., 2006). De plus, leur évolution par la perte de certains gènes a influencé certaines propriétés particulières communes à ces bactéries (tableau I.1). En effet, les mollicutes se distinguent en premier lieu 13
  • 32.
  • 33. Introduction par l’absence de paroi rigide à peptidoglycane ce qui les rend constitutivement résistants à tous les antibiotiques ayant pour cible la paroi bactérienne. Ils se caractérisent également par une taille de génome réduite qui varie de 580 kpb pour Mycoplasma genitalium à 2200 kpb pour Spiroplasma ixodetis. Ils possèdent un nombre limité de voies métaboliques ce qui implique que leur culture in vitro ne peut être obtenue que dans un milieu complexe contenant notamment du sérum d’origine animale. De plus, l’adaptation de ces organismes à des niches écologiques précises a certainement joué un rôle prépondérant au cours de leur évolution entraînant notamment la perte de la capacité à synthétiser certains acides aminés (Pollack et al., 1996) voire la totalité dans le cas de Spiroplasma citri (Chang & Chen, 1981). Leur pourcentage de moles de paires de bases G+C est faible, de 23 à 41 % (Razin et al., 1998). De ce fait, les mollicutes ont développé un biais dans l’utilisation des codons. Pour un même acide aminé, les codons terminés par A ou T sont utilisés préférentiellement à ceux terminés par G ou C (Razin et al., 1998). Dans tous les genres, hormis le genre Acholeplasma, le tryptophane est codé par le codon UGA et, dans une moindre proportion par le codon UGG (Renaudin et al., 1986; Blanchard, 1990). UGA étant un codon de terminaison dans le code génétique universel, l’expression de protéines dans un système hétérologue de production comme Escherichia coli, s’avère impossible sans muter l’ensemble de ces codons dans les gènes correspondants. Les mollicutes sont présents dans des habitats très variés, mais toujours associés à un hôte vivant, que ce soit l’homme, l’animal (mammifère, poisson, oiseau, insecte) ou la plante (Razin et al., 1998). En milieu naturel, ces organismes sont des parasites obligatoires et, à ce titre, peuvent posséder un ou plusieurs hôtes. Les mollicutes phytopathogènes ont, de ce fait, deux hôtes que sont la plante et l’insecte vecteur par lequel ils sont transmis. II. Mollicutes phytopathogènes C’est en 1967 qu’une équipe japonaise observe pour la première fois, en microscopie électronique, des organismes ressemblant à des mycoplasmes dans les tubes criblés d’une plante atteinte de jaunisse (Doi et al., 1967). Ces organismes ont alors été nommés MLO pour Mycoplasma-Like Organism. Le comité de taxonomie des mycoplasmes a repris, en 1994, la proposition de Murray et Schleifer (Murray & Schleifer, 1994) de désigner, sous le nom de genre 'Candidatus Phytoplasma', les différents groupes phylogénétiques des phytoplasmes (IRPCM., 2004). Le phytoplasme associé à la maladie des balais de sorcières du limettier du Sultanat d'Oman est le premier phytoplasme pour lequel cette proposition a été retenue. Il 14
  • 34.
  • 35. Introduction porte maintenant le nom de 'Candidatus Phytoplasma aurantifolia' (Zreik et al., 1995). Depuis, 25 autres espèces de Candidatus Phytoplasma ont été décrites (Hogenhout et al., 2008). Les mollicutes phytopathogènes regroupent aujourd’hui les phytoplasmes appartenant au genre Candidatus phytoplasma et les spiroplasmes appartenant au genre Spiroplasma. Les phytoplasmes sont les plus nombreux et les plus importants du point de vue économique. Cependant, ils résistent toujours à la mise en culture. En revanche, trois espèces de spiroplasmes phytopathogènes sont connues et disponibles en culture pure : Spiroplasma citri, Spiroplasma kunkelii et Spiroplasma phoeniceum. Parmi ceux-là, S. citri a fait l’objet de nombreuses études biologiques et biochimiques et est devenu un organisme modèle pour l’étude des mollicutes phytopathogènes (Garnier et al., 2001; Bove et al., 2003). 1. Phytoplasmes Au niveau mondial, les phytoplasmes sont responsables de plus de 300 maladies de plantes appartenant à plus de 100 familles botaniques différentes (McCoy et al., 1989). Les symptômes provoqués sur les plantes infectées sont variables et incluent des jaunisses foliaires, un enroulement et/ou une diminution de la taille des feuilles, une virescence (pétales non segmentés), une phyllodie (morphologie foliaire des sépales), la prolifération de bourgeons axillaires, un raccourcissement des entre-nœuds, etc…. Les pertes économiques provoquées par des infections à phytoplasmes sont importantes dans nos régions françaises lorsque ces infections touchent des cultures pérennes comme la Flavescence dorée de la vigne (Daire et al., 1993b), la maladie du Stolbur (Daire et al., 1993a), l’enroulement chlorotique de l’abricotier (Jaraush et al., 1999) et la maladie de la prolifération du pommier (Lee et al., 2000). L’analyse de leur ADN ribosomique 16S a permis de démontrer que ces organismes sont phylogénétiquement proches des acholéplasmes (Lim & Sears, 1989; Seemüller et al., 1994) avec lesquels ils partagent l’utilisation du code génétique universel contrairement aux autres mollicutes (Lim & Sears, 1992). Le séquençage systématique de leurs ARNr 16S, associé à la mise au point de techniques de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), ont permis d’établir une classification des phytoplasmes (Lee et al., 1998). Les premières données disponibles sur le génome des phytoplasmes révèlent, en se basant sur des études d’électrophorèse en champ pulsé, que celui-ci aurait une taille comprise entre 530 kpb pour le Bermuda grass white leaf phytoplasma, et 1350 kpb pour le Tomato 15
  • 36.
  • 37. Introduction Stolbur phytoplasma (Marcone et al., 1999) avec une teneur en G+C de l’ordre de 25 à 30 moles %. Depuis le séquençage, en 2004, de Candidatus Phytoplasma asteris souche Onion Yellows (OY) (Oshima et al., 2004), trois nouveaux génomes sont disponibles dont celui de Candidatus Phytoplasma asteris Aster Yellows (AY) (Bai et al., 2006), Candidatus Phytoplasma australiense (Tran-Nguyen et al., 2008) et Candidatus Phytoplasma mali (Kube et al., 2008). La taille du génome de Candidatus Phytoplasma australiense est d’environ 20 kpb supérieure à ceux des deux phytoplasmes de l’ordre des Candidatus Phytoplasma asteris qui atteignent environ 860 kpb. De ce fait, son génome possède environ 200 gènes « souche- spécifique », qui ne sont pas présents chez les deux autres phytoplasmes séquencés, et qui codent de nombreuses protéines hypothétiques mais aussi des transposases ou encore des intégrases (Tran-Nguyen et al., 2008). Le génome de Candidatus Phytoplasma mali a révélé une caractéristique particulière par rapport aux autres phytoplasmes déjà séquencés. En effet, son génome de 600 kpb est linéaire. De plus, l’analyse des régions codantes de ce dernier a révélé que la voie de la glycolyse, principale source d’énergie d’un organisme, est incomplète et, de plus, aucune ATP synthase de type F n’a été retrouvée (Kube et al., 2008). 2. Spiroplasmes phytopathogènes 2.1. Spiroplasma phoeniceum et Spiroplasma kunkelii Spiroplasma phoeniceum a été isolé en 1986 de pervenches de Madagascar atteintes de jaunisse provenant de Syrie (Saillard et al., 1987). Il provoque des symptômes très similaires à ceux observés sur des plantes infectées par S. citri. Il appartient au sérogroupe I-8 de la dernière classification des spiroplasmes établie en 1998 (Williamson et al., 1998). Son génome de 1860 kpb (Carle et al., 1995) possède 26 % de bases G+C (Saillard et al., 1987). Son optimum de croissance dans un milieu riche en cholestérol est de 32°C. S. kunkelii (sérogroupe I-3), observé pour la première fois en 1972, est l’agent responsable de la maladie du rabougrissement du maïs ou « corn stunt », une maladie qui s’étend depuis le sud des Etats-Unis jusqu’en Argentine. S. kunkelii, cultivé pour la première fois en 1975 (Chen & Liao, 1975; Whitcomb & Williamson, 1975) a été caractérisé en 1986 (Whitcomb et al., 1986). Son génome, partiellement séquencé, est constitué d’un chromosome circulaire de 1610 kpb (Carle et al., 1995) et possède 26 % de bases G+C (Whitcomb et al., 1986). Les séquences disponibles sont accessibles sur le site web suivant: (http://www.genome.ou.edu/ spiro_blast.html). 16
  • 38.
  • 39. Introduction 2.2. Spiroplasma citri 2.2.1. Description de la maladie et mise en culture En 1970, deux équipes observent pour la première fois des organismes de type mollicute dans les tubes criblés d'orangers atteints de la maladie du stubborn (Igwegbe & Calavan, 1970; Laflèche & Bové, 1970). Contrairement à un arbre sain dont la forme est généralement pyramidale, l'arbre très atteint présente un aspect buissonneux provenant d'un raccourcissement général des entre-noeuds. Les feuilles des arbres malades présentent une chlorose foliaire. La floraison et la maturation des fruits sont perturbées. La floraison s'échelonne tout le long de l'année et survient donc à contre saison. Les fruits sont déformés en forme de glands et les pépins avortés ou nécrosés. Obtenu en culture pure en France (Saglio et al., 1971) et en Californie (Fudl-Allah et al., 1972), la caractérisation biochimique et immunologique du pathogène responsable de la maladie du stubborn révèle que l'organisme cultivé est bien un mycoplasme du fait de l'absence de paroi à peptidoglycane (Bébéar et al., 1974) mais, qu’il s'agit d'un mycoplasme nouveau de par sa morphologie hélicoïdale et sa motilité (Saglio et al., 1973). Il fut nommé Spiroplasma citri en 1973 (Saglio et al., 1973). La transmission de S. citri à l’oranger Citrus sinensis (Markham et al., 1974) par la cicadelle Euscelis plebejus (Fallen), infectée par micro-injection d’une culture du spiroplasme, a permis de vérifier les postulats de Koch, démontrant ainsi le rôle de S. citri comme agent phytopathogène. La mise au point d'un milieu de culture de composition définie a permis de connaître les exigences nutritionnelles de S. citri (Chang & Chen, 1981). Ainsi, il a été établi que sa culture nécessite l'ajout de cholestérol, d'acides gras, de vitamines, de co-facteurs (acide folique, acide p-aminobenzoïque, etc...), de source de carbone et d'acides aminés sauf les acides aspartique et glutamique. Les sucres fermentés par S. citri sont le glucose, le fructose et le tréhalose; les autres sucres comme le mannose ou le sorbitol ne sont pas utilisés. Le comportement de S. citri envers le saccharose n'est pas bien défini. Les milieux couramment utilisés, comme le milieu SP4, contiennent nécessairement du sérum animal (poulain ou veau foetal) qui apporte les stérols et lipides, ainsi que des sucres, glucose, fructose et saccharose comme source d'énergie (Tully et al., 1977). Ce milieu possède une pression osmotique élevée et contrôlée de 600 mOsm du fait de l’absence de paroi du spiroplasme. La température optimale pour la croissance de S. citri est 32°C (Saglio et al., 1973). Cette croissance est fortement ralentie à 37°C (Garnier et al., 1984). 17
  • 40.
  • 41. Introduction En plus d’être l’agent du stubborn des agrumes, S. citri est également responsable de la maladie des racines cassantes du radis noir (Fletcher et al., 1981). Au total, au moins 38 espèces végétales regroupant 12 familles botaniques sont naturellement infectées par S. citri. La première plante découverte infectée par S. citri en Californie (Granett et al., 1976), en Arizona (Allen & Donndelinger, 1981) ainsi qu'au Maroc (Bove et al., 1978) n'appartenant pas à la famille des agrumes (rutacées) est la pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus). Par ailleurs, en Californie, S. citri a été isolé de mauvaises herbes comme le plantin (Plantago sp.), de plantes ornementales comme le souci (Tagetes erecta), la reine-marguerite (Callistephus chinensis), de plantes cultivées comme la laitue (Lactuca sp.), le radis (Raphanus sativum), la pastèque (Citrullus vulgaris) et de certains arbres fruitiers, cerisiers, pêchers et poiriers (Calavan & Bove, 1989). Plus récemment, ce spiroplasme a également été isolé de la carotte (Mello et al., 2009 ; Cebrian et al., 2010). S. citri a pu être transmis expérimentalement par greffage ou insecte vecteur à environ 80 espèces végétales différentes. 2.2.2. Caractéristiques de S. citri Depuis son obtention en culture pure, S. citri est devenu le mollicute phytopathogène le mieux caractérisé à l’heure actuelle. Les premières observations au microscope à fond noir révèlent que S. citri possède une morphologie hélicoïdale et est doué de motilité malgré l’absence de flagelle ou de filament axial normalement présent chez les bactéries mobiles (Cole et al., 1973). S. citri doit sa motilité à deux types de mouvements, un mouvement de flexion du corps cellulaire et un mouvement de rotation autour de l’hélice (Davis & Worley, 1973; Daniels et al., 1980). Ce mouvement de rotation associé à sa morphologie hélicoïdale permet au spiroplasme de se déplacer en milieu visqueux. Sur milieu solide, cette motilité a des répercussions sur l’aspect des colonies qui sont diffuses et entourées de colonies satellites. Plus récemment, les travaux de Trachtenberg et collaborateurs ont permis de mettre en évidence l’implication du cytosquelette de S. citri dans sa motilité (Trachtenberg & Gilad, 2001; Trachtenberg et al., 2003; Trachtenberg, 2004). Ce cytosquelette est composé de la protéine de fibrille (Williamson et al., 1991) et de la protéine « actin-like » MreB (Maccheroni et al., 2001). Ce cytosquelette agirait comme un moteur linéaire capable de se contracter permettant ainsi un déplacement directionnel contrôlé (Trachtenberg, 2004). Des travaux complémentaires ont montré que le déplacement du spiroplasme était également dépendant de la propagation d’une 18
  • 42.
  • 43. Introduction paire de « kink » le long du corps cellulaire, structures générées par des changements de l’hélicité du spiroplasme (Shaevitz et al., 2005). La croissance de S. citri s’effectue par allongement d’une hélice élémentaire constituée de 2 tours donnant une hélice parentale à quatre tours. L’hélice parentale se divise ensuite, par constriction, en deux hélices élémentaires (Garnier et al., 1984). Aujourd’hui, 92 % de la séquence du génome de S. citri GII3 sont connus (Carle et al., 2010). Ce génome se compose d’un chromosome de 1820 kpb avec 26 % de bases G+C et de sept plasmides (pSciA et pSci1 à 6) qui ne possèdent pas d’homologues connus (Saillard et al., 2008). La taille de ces plasmides varie de 7,8 kpb pour le pSciA à 35,3 kpb pour le pSci6 et leurs nombres de copies par spiroplasmes ont été estimés entre 10 et 14. L'ADN plasmidique représenterait ainsi près de 1,6 Mpb soit 47 % de l'ADN total de S. citri GII3. Les pSci1-6 possèdent un pourcentage en G+C (25,6 à 29 %) proche de celui du chromosome (26 %) alors que le pSciA à un pourcentage plus faible de 21,3 %. De manière intéressante, aucune des CDS portées par les pSci ne présente d’homologie avec une protéine de réplication (Saillard et al., 2008). Des travaux récents ont néanmoins pu restreindre l’origine de réplication des plasmides pSci de S. citri à une région contenant une seule CDS, nommée pE, et à sa séquence en aval présentant des motifs de fixation à la protéine initiatrice DnaA (Breton et al., 2008). De plus, trois formes réplicatives virales SpV1, SpV2 et SpV3 ont été identifiées dans le chromosome de S. citri (Renaudin et al., 1990; Renaudin & Bove, 1994). Les virus SpV2 et SpV3 ressemblent à des bactériophages classiques, alors que le virus SpV1 est filamenteux avec un ADN monocaténaire circulaire de 8,3 kb (Renaudin et al., 1990). Une des caractéristiques de ce virus SpV1 est le grand nombre de copies de son ADN, plus ou moins complètes, réparties dans tout le chromosome (Carle et al., 2010). 2.2.3. S. citri, un organisme modèle pour l’élaboration d’outils génétiques Un des premiers grands challenges concernant l’étude de S. citri fut le développement de vecteurs d’expression de gènes, outil indispensable à la caractérisation fonctionnelle de ces derniers. Dès le début, la présence des formes réplicatives virales a été mise à profit. A partir de la forme réplicative SpV1, un vecteur a été développé parallèlement à une méthode de transformation par électroporation (Stamburski et al., 1991). Cette première approche de transfert de gènes chez S. citri n’a pas été jugée satisfaisante car ces vecteurs viraux sont 19
  • 44.
  • 45. Introduction instables, dans le sens où des phénomènes de recombinaisons homologues entre le vecteur et les copies virales portées par le chromosome sont observés (Marais et al., 1996). En 1994, Ye et collaborateurs clonent l’origine de réplication chromosomique de la souche R8A2 de S. citri (Ye et al., 1994) qui sera utilisée plus tard pour la construction de vecteurs, tels que le plasmide pBOT (Renaudin et al., 1995). Ce plasmide navette, dans les cas de complémentation fonctionnelle in vivo, s’intègre dans le chromosome par simple recombinaison homologue entre les origines de réplication (Renaudin et al., 1995). L’ensemble de ces vecteurs navettes, et notamment le plasmide pGOT (Duret et al., 2005), développés récemment au laboratoire dans le but d’obtenir des mutants par simple recombinaison homologue, seront détaillés au chapitre 3. Parallèlement, une technique de mutagénèse aléatoire par transposition avec le transposon Tn4001 a également vu le jour au laboratoire (Foissac et al., 1997). Cette approche a permis d’obtenir plusieurs mutants de S. citri, à savoir un mutant non motile G540 (Jacob et al., 1997), un mutant déficient pour une ATPase de type P transporteur de calcium, un mutant non-phytopathogène (Gaurivaud et al., 2000; Gaurivaud et al., 2001) et un mutant affecté dans sa transmission (Boutareaud et al., 2004). Plus récemment, une nouvelle approche basée sur l’incompatibilité plasmidique permet de modifier le contenu plasmidique de S. citri et d’obtenir des mutants afin de caractériser l’ensemble des gènes présents sur les plasmides pSci (Breton et al., 2010). Ces dernières années, les travaux du laboratoire se sont orientés sur les déterminismes génétiques impliqués dans la transmission de S. citri. En effet, S. citri est transmis de plante à plante par des cicadelles, insectes piqueurs suceurs de sève élaborée, selon un mode circulant multipliant, impliquant des relations étroites avec l’insecte. De nombreuses étapes clés, régissant ce mode de transmission par l’insecte, restent à être élucidées. En revanche, pour de nombreux microorganismes pathogènes (bactéries, virus, champignons), les mécanismes gouvernant les étapes clefs nécessaires à leur transmission ont été particulièrement étudiés et sont, à l’heure actuelle, parfaitement décrits. La suite de cette introduction fait le point sur les connaissances acquises sur les relations des spiroplasmes avec leurs insectes vecteurs puis, décrit les différentes étapes ainsi que les mécanismes mis en jeu au cours de la transmission de pathogènes intracellulaires qu’ils soient transmis par des insectes vecteurs ou non. 20
  • 46.
  • 47. Introduction III. Transmission de microorganismes intracellulaires 1. Transmission par insecte vecteur 1.1. Relation entre le microorganisme et son insecte Il existe plusieurs types de relation entre un microorganisme et son hôte. 1.1.1. Transmission externe Lors d’une transmission externe du microorganisme, c’est-à-dire lorsque celui-ci ne se fixe que sur des parties externes de l’insecte (pattes, thorax, stylet), l’association entre les deux partenaires est limitée. Aucun des deux partenaires n’influence le comportement de l’autre. 1.1.2. Transmission intracellulaire Lorsque l’interaction entre les deux partenaires persiste, comme cela est le cas au cours d’une transmission intracellulaire, cette relation entre le microorganisme et son hôte se complexifie et certaines associations peuvent engendrer une modification du comportement de l’insecte, pouvant aller jusqu’à la mort de ce dernier. Les Baculoviridae sont les pathogènes d'insectes les plus représentés. Ils infectent notamment les larves de lépidoptères et d’hyménoptères (Blissard, 1996). L'infection survient une fois que des larves d'insectes sensibles ont absorbé des aliments contaminés par le virus. Le virus s'attaque alors à l'hémolymphe, aux tissus adipeux et à l'intestin moyen. L'insecte est ensuite paralysé et meurt. Des interactions mutualistes entre les deux partenaires ont également été découvertes ; le microorganisme, dans ce cas appelé endosymbiote d’insecte, peut être classé en deux catégories. Les endosymbiotes primaires ont été associés avec leur insecte hôte depuis des millions d'années. Ils ont une forme d'association obligatoire et ils affichent une co-spéciation avec leur hôte. Cette association, bénéfique aux deux organismes, permet à chacun des deux partenaires de profiter des avantages de l’autre. Le rôle élémentaire de l’endosymbiote est de fournir les nutriments, que l'hôte ne pourrait obtenir seul, en catabolisant la nourriture inassimilable par l'insecte. Parmi ces endosymbiotes primaires des insectes, le plus étudié reste la bactérie Buchnera qui colonise le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Buchnera est capable de synthétiser les acides aminés essentiels que le puceron ne peut naturellement 21
  • 48. Classe Ordre Famille Genre Espèce Pathogène Maladies Aedes aegypti Dengue Culicidae Aedes Flavivirus Aedes albopictus Chikungunya Anopheles Anopheles gambiae Plasmodium falciparum Paludisme Culex pipiens Plasmodium Paludisme aviaire Culex Culex quinquefasciatus Nématodes parasites Filariose Diptera Psychodidae Phlebotomus Phlebotomus major Leishmania Leishmaniose Drosophilidae Drosophila Drosophila Non pathogènes Insecta Muscidae Musca Musca domestica > 100 pathogènes Typhoïde, choléra, Glossina Glossinidae Glossina palpalis Trypanosoma brucei Maladie du Sommeil Mouche « tsé tsé » Reduviidae Triatoma Triatoma infestans Trypanoma cruzi Maladie de Chagas Hemiptera Buchnera aphidicola Aphididae Acyrthosiphon Acyrthosiphon pisum Non pathogène Yersinia pestis Peste Siphonaptera Pulicidae Xenopsylla Xenopsylla cheopis Ricketssia typhi Typhus murin Arachnida Ixodida Ixodidae Ixodes Ixodes scapularis Borrelia burgdorferi Maladie de Lyme Figure I.3: Quelques exemples d’insectes vecteur de l’Embranchement des arthropodes associés à l’organisme qu’ils transportent et la maladie provoquée (s’il y a lieu).
  • 49. Introduction obtenir par prise de nourriture tandis que ce dernier fournit à la bactérie un milieu riche lui permettant de se répliquer (Douglas, 1998). L’association entre les endosymbiotes secondaires et leurs insectes s’est développée plus récemment. Ces associations ne sont pas obligatoires et, dans la plupart des cas, on parle de relations commensales, l’insecte ne tirant aucun bénéfice de leur interaction. 1.1.3. Relation entre les spiroplasmes et leurs insectes La plupart des espèces de spiroplasmes sont retrouvées dans l’intestin ou l’hémolymphe de moustiques, mouches (tabanides) ou encore de tiques. De manière plus surprenante, S. clarkii a été isolé de l’intestin d’une larve de scarabée (Whitcomb et al., 1993) tandis que S. penaei a lui été retrouvé dans l’hémolymphe de la crevette grise, Penaeus vannamei (Nunan et al., 2005). Plusieurs espèces de spiroplasmes ont également été retrouvées infectant au moins 16 espèces différentes de Drosophila (Haselkorn et al., 2009). Quelques espèces ont également été décrites influençant le comportement de l’hôte. Un spiroplasme a été caractérisé chez le puceron du pois. Il provoque une diminution de la croissance et de la durée de vie du puceron ainsi qu’une baisse de la fertilité (Fukatsu et al., 2001). S. poulsonii, l’agent du « sex-ratio », supprime la descendance mâle de plusieurs espèces de drosophiles et se transmet de manière verticale (Williamson et al., 1999). S. apis et S. melliferum sont des pathogènes de l’abeille Apis mellifera (Mouchès et al., 1982; Mouches et al., 1984). D’autres encore, comme S. culiciola, S. sabaudiense, S. taiwanense sont pathogènes pour le moustique Aedes aegypti dont ils réduisent la durée de vie et la fécondité. De plus, S. taiwanense entraîne aussi un changement du sex-ratio en favorisant la descendance mâle (Vazeille-Falcoz et al., 1994). La présence intracellulaire de S. mirum a même été décrite dans des lésions cérébrales d’un patient atteint d’encéphalopathie (Bastian, 1979). Plus récemment, des expériences menées par le même groupe ont également montré que ce spiroplasme, injecté de manière intracrânienne, produisait des symptômes comparables avec ceux d’une encéphalopathie spongiforme (Bastian et al., 2007). Néanmoins, la plupart des mollicutes phytopathogènes ne semblent pas perturber le comportement de l’insecte. S. citri ne semble avoir aucun effet sur la cicadelle au cours de son circuit à l’intérieur de celle-ci. De même, lors de l’infection de Cacopsylla melanoneura par Candidatus phytoplasma mali, le phytoplasme n’influence pas le développement ou la longévité de ces insectes cependant il semble avoir quelques effets sur le fitness de ces derniers (Malagnini et al., 2010). 22
  • 50. Figure I.4: Phylogénie de l’ordre des Hemiptera basée sur les études de phylogénie moléculaire. (D’après Campbell et al., 1995 ; Sforza, 1998).
  • 51. Introduction 1.2. Insectes vecteurs Les insectes vecteurs de microorganismes appartiennent tous à l’embranchement des arthropodes. Quelques familles d’insectes responsables de la vection de microorganismes, à l’exception des mollicutes phytopathogènes, sont regroupées dans le tableau I.3. 1.2.1. Vecteurs mollicutes phytopathogènes 1.2.1.1. Classification Les insectes vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent à l’ordre des Hemiptera. La classification de ces insectes a longtemps été basée sur des caractères morphologiques (couleur, taille, ailes antérieures, tête, thorax, abdomen, parties génitales etc...). Les hemiptères ont un développement du type hémimétabole, c’est à dire que la nymphe est mobile et ressemble aux larves, et possèdent plusieurs caractéristiques propres comme des antennes longues, des pièces buccales avec un long rostre et deux paires d’ailes dont l’une peut être cornée et durcie (hémiélytre). Ce n’est qu’en 1995, lors des travaux de Campbell et collaborateurs portant sur la comparaison de séquences d’ADN ribosomiques 18S de ces insectes, que la classification des hémiptères a été modifiée et est restée depuis, identique à celle présentée dans le tableau I.4 (Campbell et al., 1995). Dès lors, les insectes vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent, au sein du sous-ordre des Cicadomorpha, à la famille des Cicadellidae (cicadelles) ; au sein de l’infra-ordre des Fulguromorpha, à la famille des Cixiidae (cixides) et enfin, au sein de l’ordre des Sternorrhyncha, à la famille des Psyllidae (psylles). Au sein de la famille des Cicadellidae, les vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent principalement à la sous-famille des Deltocephalinae. Dans la littérature, les membres de la famille des Cicadellidae sont regroupés sous le terme de « leafhopper » tandis que l’infra-ordre des Fulguromorpha renferme deux familles principales que sont les Cixiidae et les Delphacidae regroupée sous le terme de « planthopper ». Quelques exemples de mollicutes phytopathogènes associés à leur insecte vecteur sont présentés dans le tableau I.5. 1.2.1.2. Vecteurs de S. citri Pour sa part, S. citri est transmis naturellement et expérimentalement par plusieurs insectes (tableau I.5). De toutes les cicadelles précédemment décrites, C. tenellus (figure I.6) est le vecteur majeur du spiroplasme dans le Sud-ouest des Etats-Unis (Rana et al., 1975; Liu 23
  • 52. Bactérie Insecte vecteur Famille taxonomique Référence Circulifer haematoceps Fos et al. , 1986 Circulifer tenellus (Baker) Oldfield et al. , 1976 Circulifer opacipennis (Lethierry) Sengonca et al. , 1991 Macrosteles fascifrons (stål) O’Hayer et al ., 1983 Spiroplasma citri Scaphytopius nitridus (DeLong) Cicadellidae Oldfield, 1977 Scaphytopius acutus delongii (Young) Kaloostian et al. , 1979 Scaphytopius coliforniensis (Hepner) Oldfield, 1987 Euscelis plebejus Marckam et al ., 1974 Euscelidius variegatus Marckam & Townsend, 1979 Dalbulus maidis Kunkel, 1946 Spiroplasma kunkelii Cicadellidae Chen & Liao, 1975 Dalbulus elimatus Williamson et Whitcomb, 1975 Phytoplasma Stolbur Hyalesthes obsoletus Cixiidae Fos et al. , 1992 Phytoplasme de la Flavescence Dorée Scaphoideus titanus Ball Cicadellidae Caudwell, 1983 Phytoplasme de l’ESFY Cacopsylla pruni Psyllidae Carraro et al., 1998b Phytoplasme du Pear Decline Cacopsylla pyri Psyllidae Carraro et al ., 1998a Phytoplasme de la proliferation du pommier Cacopsylla melanoneura Psyllidae Alma et al ., 2000 Candidatus phytoplasma ziziphi Hishimonus sellatus Deltocephalidae La & Woo, 1980 Scaphoideus luteolus Baker, 1949 Candidatus phytoplasma ulmi Cicadellidae Macropsis mendax Carraro, 2004 Phytoplasme du rabougrissement du roncier Macropsis fuscula Cicadellidae De Fluiter & Van der Meer, 1953 Phytoplasme de la jaunisse de la vigne du Palatinat Oncopsis alni Cicadellidae Maixnert, 2000 Phytoplasme de la jaunisse de l’aulne Oncopsis alni Cicadellidae Maixnert & Reinert, 1999 Figure I.5: Quelques exemples d’insectes vecteurs de Mollicutes phytopathogènes avec leur maladies associées.
  • 53. Introduction et al., 1983). Les vecteur identifiés dans le pourtour méditerranéen sont C. haematoceps (figure I.6) (Fos et al., 1986) et C. tenellus (Rasooly et al., 1994). Ces cicadelles polyphages se développent principalement sur des hôtes herbacés et sur les agrumes (rutacées) qui, lorsqu’ils sont infectés par S. citri, présentent des taux d’infection élevés. La transmission de plante à plante se déroule selon un mode circulant multipliant. De ce fait, dans l’insecte, S. citri effectue un circuit au cours duquel il passe successivement du canal alimentaire, dans l’intestin moyen puis dans l’hémolymphe et gagne les glandes salivaires de la cicadelle afin d’être excrété avec les sécrétions salivaires. La description anatomique de ces tissus nous permettra de mieux appréhender les mécanismes mis en place par S. citri au cours de son trajet et notamment lors des franchissements des deux barrières, que sont l’épithélium intestinal et celui des glandes salivaires, indispensables à sa propagation. 1.2.1.3. Morphologie des cicadelles Les pièces buccales des cicadelles sont composées du labrum, du labium et des stylets. Seul les stylets pénétrent dans la plante lors du repas de l’insecte. Ils sont au nombre de quatre et sont les vestiges des mandibules et des maxilles. La paire de stylets maxillaires se rejoint pour former le canal salivaire et le canal alimentaire. Les stylets mandibulaires entourent en partie les stylets maxillaires. Au niveau de la tête, les deux stylets maxillaires se séparent l’un de l’autre et les fluides ingérés se retrouvent dans une chambre filtrante appelée precibarium. Sa fonction est de réguler le flux de liquide avant qu’il n’entre dans le cibarium. Il est composé d’une valve qui empêche notamment la régurgitation de fluides dans les stylets. Le cibarium est une sorte de pompe qui constitue un sac situé dans la tête et composé d’une couche de cellules épithéliales. Les fluides passent alors dans l’intestin antérieur de l’insecte qui est relativement étroit avec une paroi mince et recouvert de chitine qui s’étend jusqu’au mésothorax ou bien même jusqu’au premier fragment abdominal. Les cellules intestinales possèdent des microvillosités à leur surface qui sont recouvertes d’une fine matrice de nature polysaccharidique, le glycocalyx. L’épithélium intestinal est bordé d’une lame basale composée d’un assemblage de filaments de collagène et d’une matrice amorphe constituée de polysaccharides (Gouranton & Folliot, 1970). Chez les insectes se nourrissant de xylème et de phloème, une chambre filtrante s’est formée permettant le passage direct de l’eau ingérée, contenant les substances en solution, de l’intestin antérieur à l’intestin postérieur dans le but de concentrer la solution nutritive (Forbes, 1969). A la jonction de l’intestin moyen et postérieur se trouvent les tubes de 24
  • 54. Figure I.6: Principaux insectes vecteurs de Spiroplasma citri. Photographies de Circulifer tenellus (à gauche) et de Circulifer haematoceps (à droite). Figure I.7: Représentation schématique de l’appareil salivaire de cicadelles. AG: glande salivaire accessoire. I à VIII: types cellulaires différents de la glande salivaire principale. (D’après Wayadande & Fletcher, 1995).
  • 55. Introduction Malpighi. Ils sont au nombre de quatre chez les cicadelles et sont composés de cellules épithéliales très minces qui se divisent en deux parties, une partie distale qui servirait à la sécrétion d’ions et à l’excrétion tandis que la partie proximale aurait une fonction dans la réabsorption des solutés. Les cicadelles possèdent une paire de glandes salivaires situées de part et d’autre de l’œsophage. De chaque côté, il y a une glande principale et une glande accessoire toutes les deux composées de cellules conductrices et sécrétrices. Chaque glande salivaire principale est composée de 8 types cellulaires différents et organisés en lobes concentriques. Ces cellules sont différenciées en fonction de leur morphologie et de leur densité aux électrons. Elles sont binucléées et regroupées en deux lobes. Le lobe antérieur est composé de 10 cellules de type I, 6 cellules de type II, 4 cellules de type III et IV et 2 cellules de type V. Le lobe postérieur est constitué de 5 cellules de type VI, 3 cellules de type VII et 4 cellules de type VIII (figure I.7) (Wayadande et al., 1997). Les glandes salivaires accessoires sont reliées aux glandes salivaires principales par un canal lui-même inséré dans le canal faisant la jonction avec le lobe antérieur et le lobe postérieur des glandes salivaires principales. Ici, les cellules sont uninucléées. Les deux principaux canaux formés par chacune des deux glandes s’unissent pour former un canal salivaire commun qui se dévide dans la pompe salivaire. Tous ces organes baignent dans l’hémolymphe, un fluide extracellulaire qui transporte les métabolites vers les différents tissus de l’insecte. L’osmolarité de l’hémolymphe est relativement élevée et comprise entre 240 et 600 mOsm. La principale source de carbone est le tréhalose, sucre non réducteur composé de deux molécules de glucose. Ce fluide contient également des lipides, des acides aminés libres, des acides inorganiques tel que l’acide ascorbique et des ions Mg2+ et PO43- (Saglio & Whitcomb, 1979). Cette composition est relativement proche de la composition du phloème de la plante à l’exception du sucre majoritaire qui est le saccharose au lieu du tréhalose. 1.2.2. Circuit du spiroplasme dans l’insecte Après ingestion et un passage dans la pompe alimentaire, les spiroplasmes se retrouvent dans l’intestin où la plupart sont digérés par les enzymes présentes. Les survivants poursuivent leur route jusqu’au niveau de l’intestin moyen ou ils pénètrent dans les cellules constituant l’épithélium intestinal situées dans une région dépourvue de chitine. Chez Circulifer tenellus, S. citri pénètre dans ces cellules épithéliales en passant entre les microvillosités (figure I.8A; (Kwon et al., 1999). Le spiroplasme franchit l’épithélium 25
  • 56. Passage de la barrière intestinale A B A A: S. citri pénétrant dans les cellules de l’épithélium intestinal de C. tenellus à travers les microvillosités. L: lumière intestinale, MV: microvillosités, S: spiroplasme. B: Zone proche du plasmalemme basal montrant les spiroplasmes dans des vacuoles d’endocytose. H: hémolymphe. Echelle: 0,5 µm. (Kwon et al., 1999) Libération dans l’hémolymphe D C C: S. kunkelii franchissant la lame basale des cellules de l’épithélium intestinal de D. maidis (flèche avec l’étoile) ou bien libre dans l’hémolymphe de l’insecte (flèche à gauche). Bl: lame basale, Mt: tubes de Malpighi, Mi: mitochondrie, Gc: cellule intestinale, Pl: plasmalemme basal. Echelle: 0,5 µm. D: Agrandissement de la région encadrée montrant S. kunkelii avec une protubérance en forme de « tip » proche de la lame basale. (Ozbek et al., 2003). Passage de la barrière des glandes salivaires E F E: S. citri franchissant la lame basale des cellules de l’épithélium des glandes salivaires de C. tenellus dans une vacule d’endocytose. Bl: lame basale, S: spiroplasme, Er: réticulum endoplasmique. F: S. citri libre dans le canaliculus des glandes salivaires de C. tenellus. Echelle: 0,5 µm. (Kwon et al., 1999). Figure I.8: Etapes clés du cycle des spiroplasmes dans leurs insectes vecteurs.
  • 57. Introduction intestinal par un mécanisme d’endocytose/exocytose au cours duquel il se retrouve dans une vacuole d’endocytose où il adopte une forme ovoïde (figure I.8B ; (Ozbek et al., 2003)). Au moment du passage dans l’hémolymphe de l’insecte, une protubérance de 70 nm de diamètre est observée traversant la membrane de la vacuole (figure I.8C et D ; (Ozbek et al., 2003)). Cette protubérance, non sans rappeler le « tip » observé chez plusieurs mycoplasmes (Rottem, 2003), regrouperait plusieurs protéines qui seraient les premières impliquées dans un rôle de reconnaissance et de franchissement du plasmalemme intestinal (Ammar et al., 2004). Grâce à l’intermédiaire de ce « tip », les vésicules d’endocytose fusionnent avec le plasmalemme basal et les spiroplasmes sont donc libérés par exocytose. Ils se retrouvent alors dans l’hémolymphe où ils se multiplient massivement. Un nouveau mécanisme d’endocytose/exocytose leur permet de franchir la barrière des glandes salivaires puis, après une nouvelle multiplication, ils sont expulsés dans le canal salivaire (figure I.8E et F; (Kwon et al., 1999)). En résumé, pour sa transmission, le spiroplasme a besoin de franchir deux barrières, la barrière intestinale et la barrière des glandes salivaires. Les franchissements de ces barrières nécessitent des interactions entre S. citri et son insecte vecteur afin de pénétrer à l’intérieur des cellules de son hôte. Or, les mécanismes moléculaires ainsi que les protéines impliquées dans ces étapes d’adhésion aux cellules et d’internalisation dans celle-ci, restent encore inconnus à ce jour. Pour d’autres organismes, les descriptions concernant ce processus d’invasion permettraient de cerner les différents acteurs intervenant au cours de ces étapes et, par analogie, faire un lien avec ce qui est connu concernant la transmission du spiroplasme. 2. Cycle cellulaire de la transmission Le pouvoir pathogène d’un microorganisme intracellulaire repose sur sa capacité à coloniser son hôte et, de ce fait, à envahir les cellules de celui-ci afin de s’y multiplier et de s’y disséminer. L’ensemble de ce processus, nommé « invasion » tout au long de ce manuscrit, se décompose en plusieurs étapes successives. Après avoir été ingéré par leur hôte, les microorganismes doivent (i) adhérer aux cellules de leur hôte, (ii) pénétrer à l’intérieur de celles-ci, (iii) se développer tout en évitant les mécanismes de défense mis en place puis (iv) se disséminer de cellule à cellule afin d’être transmis à un nouvel hôte. 26
  • 58. Figure I.9: Représentation des principaux types de pili décrits chez les bactéries à Gram-négatif et à Gram-positif. (D’après Kline et al, 2009).
  • 59. Introduction Le succès d’une invasion réside dans les signaux que les deux acteurs, la cellule et l’agent pathogène, s’échangent perpétuellement. A chaque étape du processus d’infection, l’agent pathogène exploite la machinerie cellulaire de l’hôte à son propre profit. 2.1. Adhésion L’adhésion des microorganismes à des cellules eucaryotes est souvent une première étape essentielle dans la mise en place de la maladie. En effet, étant de manière générale une étape spécifique, l’adhésion permet au pathogène de se retrouver au niveau de tissus appropriés, à partir desquels, il peut initier son processus d’entrée. De nombreuses molécules et de structures macromoléculaires, regroupées sous le terme d’adhésines, permettent aux pathogènes d’assurer cette fonction. Ces adhésines peuvent être divisées en deux familles : les adhésines de type fibrillaire et les adhésines de type non- fibrillaire. 2.1.1. Adhésines de type fibrillaire Les adhésines de type fibrillaire sont des structures filamenteuses visibles à la surface des bactéries. Ces structures ont été pour la première fois observées dans le début des années 50 par deux équipes. La première, dirigée par James Duguid, appela ces structures fimbriae (« frange ») (Duguid et al., 1955), tandis que la seconde, dirigée par Charles Brinton, décida de les nommer pili (« cheveux ») (Brinton, 1965). Bien que les deux termes soient synonymes, et toujours d’actualité, le terme de pili sera préféré au cours de ce manuscrit. Les principaux types de pili, décrits aussi bien chez les bactéries à Gram-négatif qu’à Gram- positif, sont représentés sur la figure I.9. 2.1.1.1. Bactéries à Gram-négatif Les pili ont été, pour la première fois, décrits chez les bactéries à Gram-négatif. Ce sont des structures de 1 à 2 µm de long, formées par l’association de plusieurs sous-unités, généralement regroupées sous le terme de « pilines », formant des structures polymériques qui permettent d’éviter la répulsion des charges négatives présentes à la surface des cellules de la bactérie et de celles de l’hôte, retardant ainsi l’activation du système immunitaire de l’hôte (Kline et al., 2009). Trois principaux types de pili sont connus et se distinguent essentiellement par leurs structures, mais aussi par leurs mécanismes de formation et de régulation qui, bien 27