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Plan• Introduction• Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade de l’infestation duparasite (malaria)• Reproduction in...
1IntroductionImmunité cellulaire:1- Lymphocyte T détecte & reconnaît l’Ag immédiatement2- Plusieurs populations de lymphoc...
Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade del’infestation du parasite2
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• Les cellules NK purifiées des donneurs de sang n’ayant eu aucune exposition préalable au paludisme avantle prélèvement s...
Technique in vitroPréparation des cellules effectrices:- PBMC : Peripheral blood mononuclear Cells; Monocytes et lymphocytes
L’obtention des cellules NK humainesEn utilisant le système de purification MACS (Magnetic Activated Cell Sorter).1- Sélec...
2- Sélection négative est basée sur le même principe, mais dans ce cas, ce sont tous les autrestypes cellulaires, autre qu...
Stimulation des PBMC par des hématies parasitées par Plasmodium falciparum.Mesure de la prolifération des lymphocytes T, d...
Test de prolifération(CFDA)Phénotypages etstimulations cellulairesStimulation…LyT α/β et γ/δLyT Helper, Cytotox. et Reg.DC...
IntérêtCompréhension des mécanisme in vivoRelation hôte/parasiteEssais vaccinaux
GRAND MERCI A LA CULTURE IN VITRO QUI NOUS PERMETD’AVOIR UNE BANQUE CELLULAIRE*********MERCI DE VOTRE AIMABLE ATTENTION***...
Références Bibliographiques1- http//www.ifmt.auf.org/IMG/pdf/IFMT MB1 Immunité anti-infectieuse.pdf2- Olivier Silvie, Domi...
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La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro

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La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro - Présentation de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Hamma Ibrahim MAIGA - Chercheur - Université Faculté de Médecine,Malaria Research center - Bamako, Mali - hmaiga@MRTCBKO.org

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La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro

  1. 1. LA REPONSE IMMUNITAIRE CELLULAIREET LES MESURES IN VITROHAMMA IBRAHIM MAIGA, MDMalaria Research & Training Center/Département D’Épidémiologie des Affections Parasitaires/Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontostomatologie.Bamako, Mali (Afrique de l’Ouest).BP: 1805 TEL: 223 222 81 09EVALUATIONpar les FACILITATEURS
  2. 2. Plan• Introduction• Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade de l’infestation duparasite (malaria)• Reproduction in vitro de la réponse cellulaire• Intérêt
  3. 3. 1IntroductionImmunité cellulaire:1- Lymphocyte T détecte & reconnaît l’Ag immédiatement2- Plusieurs populations de lymphocytes T CD4 – CD83- La cible n’est pas directement l’Ag mais la cellule qui le porte et alorsreconnue comme non-soiIn vitro : Qualifie un processus biologique observé/étudié enéprouvette ou en laboratoire, dans des conditions artificielles, paropposition à in vivo.
  4. 4. Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade del’infestation du parasite2
  5. 5. Lhépatocyte au sein duquel se développe Plasmodium est la seule cible vis à vis de laquellepeuvent opérer des cellules T CD8[+] et T CD4[+].Cela implique que ces cellules peuvent reconnaître des peptides dérivés de protéines parasitairesprésentés en surface de lhépatocyte parasité en association avec les molécules du ComplexeMajeur dHistocompatibilité (CMH).Une séquence peptidique leurs a conduit à lidentification dun peptide présentant des motifsdancrage de lhaplotype H-2K[d]Ce peptide est capable dinduire des mécanismes de cytotoxicité dépendant des cellules T CD8[+]dirigés contre lhépatocyte infecté in vitro.Phase hépatique [Pétour Pascal ; Mazier Dominique] 3
  6. 6. • Les cellules NK purifiées des donneurs de sang n’ayant eu aucune exposition préalable au paludisme avantle prélèvement sanguin, inhibent la croissance des parasites après 48h de co-culture en présence de sérumde sujets semi immuns.• Cette situation est abolie lorsque les cellules NK sont préalablement incubées avec un anticorp monoclonalanti-CD95 (anti-fas) humain ou avec la protéine chimère composé par la fusion de la molécule fas et dufragment Fc d’immunoglobuline humaine soluble.- le niveau de l’inhibition de la croissance des parasites est également substantiellement réduit par leprétraitement des cellules avec un anticorp anti-CD56.• D’autre part la destruction direct des érythrocytes parasités par les cellules NK, en l’absence de tout séruma été observée par le test standard de mesure de cytotoxicité par la libération de chrome radioactif.Phase Érythrocytaire [Pr Elie Mavoungou] 4
  7. 7. Technique in vitroPréparation des cellules effectrices:- PBMC : Peripheral blood mononuclear Cells; Monocytes et lymphocytes
  8. 8. L’obtention des cellules NK humainesEn utilisant le système de purification MACS (Magnetic Activated Cell Sorter).1- Sélection positive, les cellules NK contenues dans le mélange de PBMCs sont reconnues par leurmarqueur majeur, l’antigène CD56. Cette reconnaissance sélective est réalisée par l’utilisationd’anticorps dirigés contre cet antigène. L’anticorps est artificiellement couplé aux billesmagnétiques.Le mélange cellulaire est ensuite passé dans un champ magnétique qui va piéger les billesmagnétiques et donc le couplage anticorps CD56-cellules NK.Après lavage des cellules dans du milieu complet frais, les cellules sont placées dans un incubateurà CO2 réglé à 37°C pendant environ 16 heures afin de permettre le détachement des billesmagnétiques.
  9. 9. 2- Sélection négative est basée sur le même principe, mais dans ce cas, ce sont tous les autrestypes cellulaires, autre que les cellules NK,Toutes ces cellules sont retenues dans le champ magnétique à l’exception des cellules NK quisont recueillies librement. Les anticorps spécifiques utilisés dans ce cas sontessentiellement :• l’anticorps anti-CD3, marqueur sélectif de tous les lymphocytes T,• l’anticorps anti-CD4, lymphocytes T helper, les monocytes et les macrophages,• l’anticorps anti-CD14, monocytes,• l’anticorps anti-CD15 marqueur des neutrophiles et des éosinophiles,
  10. 10. Stimulation des PBMC par des hématies parasitées par Plasmodium falciparum.Mesure de la prolifération des lymphocytes T, de la stimulation des sous populations, et activation des CPApar cytométrie en flux.PrélèvementsHéparinesodium FicollPBMCPlasmaAjuster à1.106¢/ml dans duRPMI-0Répartition…600µl pour0,6.106¢6ml pour6.106¢Le plasma servirapour la mise enculture en systèmeautologue…Centrifugation pourmettre enculotIncubation avecle CFDARe-centrifugationpour mettre enculotAjouter 360µlde RPIM-0 +240µl de plasmaautologueAjouter 3,6mlde RPIM-0 +2,4ml de plasmaautologueRBCPRBC6 puits avec100µl/puit3 puitsavec2ml/puit+100µl/puit deRBC ou PRBC+ 2ml/puit deRBC ou PRBC…voir leprotocole pourles plans deplaques…Préparation dessuspensions deglobules rouges demanière à avoir1.106PRBC/mlPrélèvementsHéparinesodium FicollPBMCPlasmaAjuster à1.106¢/ml dans duRPMI-0Répartition…600µl pour0,6.106¢6ml pour6.106¢Le plasma servirapour la mise enculture en systèmeautologue…Centrifugation pourmettre enculotIncubation avecle CFDARe-centrifugationpour mettre enculotAjouter 360µlde RPIM-0 +240µl de plasmaautologueAjouter 3,6mlde RPIM-0 +2,4ml de plasmaautologueRBCPRBC6 puits avec100µl/puit3 puitsavec2ml/puit+100µl/puit deRBC ou PRBC+ 2ml/puit deRBC ou PRBC…voir leprotocole pourles plans deplaques…Préparation dessuspensions deglobules rouges demanière à avoir1.106PRBC/ml5
  11. 11. Test de prolifération(CFDA)Phénotypages etstimulations cellulairesStimulation…LyT α/β et γ/δLyT Helper, Cytotox. et Reg.DC, MØ et LyBPBMC + RBCPBMC + PRBCPBMCPRBCPBMCPRBCmonensinPBMCRBCmonensinProlifération…Ratio PRBC/RBCProfil…Th1/Th2Test de prolifération(CFDA)Phénotypages etstimulations cellulairesStimulation…LyT α/β et γ/δLyT Helper, Cytotox. et Reg.DC, MØ et LyBPBMC + RBCPBMC + PRBCPBMCPRBCPBMCPRBCmonensinPBMCRBCmonensinProlifération…Ratio PRBC/RBCProfil…Th1/Th2
  12. 12. IntérêtCompréhension des mécanisme in vivoRelation hôte/parasiteEssais vaccinaux
  13. 13. GRAND MERCI A LA CULTURE IN VITRO QUI NOUS PERMETD’AVOIR UNE BANQUE CELLULAIRE*********MERCI DE VOTRE AIMABLE ATTENTION*******QUESTIONS
  14. 14. Références Bibliographiques1- http//www.ifmt.auf.org/IMG/pdf/IFMT MB1 Immunité anti-infectieuse.pdf2- Olivier Silvie, Dominique Mazier, Eric Rubinstein et Claude Boucheix« CD81: une tétraspanine impliquée dans l’infection par Plasmodium ». M/S médecine sciences Volume 19,numéro 2, Février 20033- Pétour Pascal ; Mazier DominiqueIsolement et identification de nouveaux épitopes exprimés en surface de lhépatocyte infecté par desPlasmodies : modèle de la souris BALB/c infectée par Plasmodium yoelii (Isolation and identification ofnews epitopes expressed at the surface of the infected hepatocytes by Plasmodium spp : model of theBABL/c mice infected by Plasmodium yoelii) 1997, [Note(s) : , 173] (341 ref.) Travaux universitaires(Année de soutenance : 1997) (No : 97 PA06 6503) Université de Paris 06, Paris, FRANCE4- Elie MavoungouLa cytolyse des érythrocytes au cours du paludisme: L’implication des cellules NKIn European cytokine network vol. 14, N°3, pp. 134-142, 2003.5- Olivier Domarle (Anonyme).Protocole de recherche de l’unité d’immunologie, Institut Pasteur de Madagascar.

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