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Caractérisation de chitinases
chez les nématodes
Parole de Junior
Dr Muriel Nirina MAEDER
Suisse
Introduction
 Second composant naturel le plus
abondant après la cellulose
(1x1013kg/an)
 Polysaccharide composé de résidus
N-acétylglucosamine (GlcNAc)
formant une chaîne
 Constituant principal de la carapace
des insectes, des crustacés et de la
paroi des champignons
Chitine
GlcNAc
Introduction
 Enzymes spécifiques qui coupent la chitine
 Impliquées dans les mécanismes de défense, de
nutrition ou de morphogenèse (en particulier les mues)
ainsi que dans la transmission de certains parasites
 Tous les organismes possèdent des chitinases
Chitinases
Introduction
 2 familles principales: Famille * et Famille *
 Famille * retrouvée chez tous les organismes
 Famille * jusqu’à présent spécifique aux plantes et retrouvées
dernièrement également chez certaines bactéries
Chitinases
Les chitinases et les animaux
 Chitinases trouvées chez tous les organismes et donc
chez tous les animaux
 Etudes ciblées sur les chitinases présentes chez les
nématodes
Nématodes
 Appelés aussi vers ronds
 Cosmopolites
 Vers libres et vers parasites
 4 mues obligatoires: œuf → L1 → L2 → L3 → L4 → adulte
Nématodes
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en établissant une interaction durable avec un hôte
 Qu’est-ce qu’un vecteur?
un vecteur est un organisme qui ne provoque pas lui-même une maladie
mais qui disperse l’infection en transportant les agents pathogènes d'un
hôte à l'autre
 Les nématodes peuvent être des parasites de plantes,
d’insectes, d’animaux y compris l’Homme
Nématodes parasites
 Pertes économiques importantes
imputables aux nématodes
parasites
 Dégâts aux récoltes estimés chaque
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Nématodes parasites et l’Homme
 Baisse de rendement notamment au niveau de la viande et
du lait pour les animaux de rente
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l’Homme
Caenorhabditis elegans
Nématode libre: Caenorhabditis elegans
 Ver utilisé comme modèle
biologique: cycle de vie
court, multiplication rapide,
simplicité anatomique
 Ver utilisé comme modèle
génétique: organisme
totalement séquencé
Ascaris suum
Nématode parasite: Ascaris suum
 Hôte définitif: cochon
 Différents organes touchés:
intestin, foie, système
respiratoire
 1 million d’œufs pondus par
jour
Heterorhabditis megidis
 Ver entomopathogène avec
pour hôte définitif le charançon
 Utilisation dans la lutte
biologique
 Commercialement exploité
Nématode parasite: Heterorhabditis megidis
Brugia malayi et Brugia pahangi
 Hôte définitif: Homme
Hôte intermédiaire: moustique
 Responsable de l’éléphantiasis
(filariose lymphatique)
 120 millions de personnes
infectées chaque année dans
80 pays
Nématodes parasites: Brugia malayi
Brugia pahangi (modèle de laboratoire)
Présence des chitinases chez les
nématodes?
 La présence des chitinases a déjà été démontrée chez
différents nématodes (C. elegans et certaines filaires)
 Les chitinases ont déjà fait l’objet de plusieurs thèses du
laboratoire de parasitologie
 Les chitinases de certains nématodes parasites ont été
proposées comme cible pour des vaccins
Hypothèses
1. Des chitinases sont présentes chez C. elegans et
doivent avoir des rôles différents que le seul
supposé dans la transmission des nématodes
parasites par les vecteurs
2. Des chitinases spécifiques des plantes sont – elles
présentes chez C. elegans? si oui, il s'agit d'une
nouvelle découverte
Objectifs
 Rechercher les chitinases de la Famille * et de la
Famille * chez le nématode libre appelé C. elegans et
caractériser les chitinases de la Famille *, spécifiques
aux plantes
 Identifier les chitinases de la Famille * chez les vers
parasites Ascaris suum, Heterorhabditis megidis,
Brugia malayi et B. pahangi
Méthodologie
Base de données (traitement par ordinateur des informations disponibles)
Comparaison des séquences disponibles
Clonage pGEM-T
Clonage pPIC/pGEXProtéine recombinante Digestion
Séquençage
PurificationAmorces PCR
Méthodologie
 Où se trouve l’ADN?
Ver Cellule
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Résultats
 40 gènes de chitinases trouvés pour C. elegans
 34 gènes pour la Famille *
 6 gènes pour la Famille *
(jusqu’à maintenant spécifique aux plantes)
Analyse des bases de données
Résultats
 Identification de la présence des chitinases de la Famille *
chez C. elegans
Présence confirmée
par séquençage

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 Identification de la présence des chitinases de la Famille *
chez A. suum
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Confirmation de ces résultats par une publication
(Geng, 2002)
Résultats
 Identification de la présence de chitinase de la Famille * chez
H. megidis
Présence confirmée
par séquençage

Résultats
 Identification de la présence de chitinases de la Famille * chez
B. pahangi et B. malayi
Présence confirmée
par séquençage

Résultats
 Séquençage
H.megidis KRDLAAFFAHAIQETRENNNYLYT--ALPDQEASNCFYRGGFYNWFEGGPSSNFLNPETP
||||||||||||||| ||||||||--||||||||||||||||||||||||||||||||||
C.elegans KRDLAAFFAHAIQETGENNNYLYT--ALPDQEASNCFYRGGFYNWFEGGPSSNFLNPETP
H.megidis GHSPTDGNSCTSAGRYCSASDQITFFYPCSNSTISNPAAPYKGCYFGRGGIQISYNYNY
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
C.elegans GHSPTDGNSCTSAGRYCSASDQITFFYPCSNSTISNPAAPYKGCYFGRGGIQISYNYNY
B.malayi : KRDVATFFAHALQETGENDASVY--NNTDLTLEQAHECFYRGGFYNWFERGPNSTFLSPAA-
|||||||||||||||||||||||--||||||||||||||||||||||||||||||||||||-
C.elegans : KRDVATFFAHALQETGENDASVY--NNTDLTLEQAHECFYRGGFYNWFERGPNSTFLSPAA-
B.malayi : -PGFSPFDGKRCTDEGRYCKSDPIIDFWYPCNSDIESHSDKEYHKGYYFGRGALQLSWNYNY
-||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||
C.elegans : -PGFSPFDGKRCTDEGRYCKSDPIIDFWYPCNSDIESHSDKEYHKGCYFGRGALQLSWNYNY
Résultats
 Alignements conservés pour les chitinases de la
Famille *
 Séquences de nématodes plus longues que celles de plantes
ou bactérie
 Différences dans les résidus conservés
Synthèse des résultats
Recherche informations dans les bases de données
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Clonage des gènes d’intérêt
Séquençage
Expression des protéines recombinantes
(système bactérien et de levure) à poursuivre
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Conclusion
1. Vue que des chitinases sont présentes chez C. elegans, les
chitinases doivent avoir des rôles différents
→ La présence confirmée de nombreuses chitinases souligne que les chitinases
sont des molécules importantes pour des fonctions diverses
2. Si des chitinases de la Famille * sont effectivement présentes
chez C. elegans, il s'agit d'une nouvelle découverte
→ La présence de ces chitinases a été confirmée et élargie chez C. elegans. Ces
chitinases sont aussi présentes chez A. suum, H. megidis, B. malayi et B. pahangi
3. Les chitinases de la Famille * deviennent ainsi de nouvelles cibles
possibles pour l’élaboration de vaccin contre les nématodes
parasites
Perspectives
→Acquisition des chitinases de la Famille * chez les
nématodes par transfert génétique horizontal (HGT)?
→ Présence des chitinases de la Famille * chez les vers
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Caractérisation de chitinases chez les nématodes

  • 1. Caractérisation de chitinases chez les nématodes Parole de Junior Dr Muriel Nirina MAEDER Suisse
  • 2. Introduction  Second composant naturel le plus abondant après la cellulose (1x1013kg/an)  Polysaccharide composé de résidus N-acétylglucosamine (GlcNAc) formant une chaîne  Constituant principal de la carapace des insectes, des crustacés et de la paroi des champignons Chitine GlcNAc
  • 3. Introduction  Enzymes spécifiques qui coupent la chitine  Impliquées dans les mécanismes de défense, de nutrition ou de morphogenèse (en particulier les mues) ainsi que dans la transmission de certains parasites  Tous les organismes possèdent des chitinases Chitinases
  • 4. Introduction  2 familles principales: Famille * et Famille *  Famille * retrouvée chez tous les organismes  Famille * jusqu’à présent spécifique aux plantes et retrouvées dernièrement également chez certaines bactéries Chitinases
  • 5. Les chitinases et les animaux  Chitinases trouvées chez tous les organismes et donc chez tous les animaux  Etudes ciblées sur les chitinases présentes chez les nématodes
  • 6. Nématodes  Appelés aussi vers ronds  Cosmopolites  Vers libres et vers parasites  4 mues obligatoires: œuf → L1 → L2 → L3 → L4 → adulte Nématodes
  • 7. Nématodes parasites  Qu’est-ce qu’un parasite? un parasite est un organisme vivant qui se nourrit, s'abrite et se reproduit en établissant une interaction durable avec un hôte  Qu’est-ce qu’un vecteur? un vecteur est un organisme qui ne provoque pas lui-même une maladie mais qui disperse l’infection en transportant les agents pathogènes d'un hôte à l'autre  Les nématodes peuvent être des parasites de plantes, d’insectes, d’animaux y compris l’Homme
  • 8. Nématodes parasites  Pertes économiques importantes imputables aux nématodes parasites  Dégâts aux récoltes estimés chaque année à plus de 10% Nématodes parasites et l’Homme  Baisse de rendement notamment au niveau de la viande et du lait pour les animaux de rente  Responsables des maladies les plus invalidantes pour l’Homme
  • 9. Caenorhabditis elegans Nématode libre: Caenorhabditis elegans  Ver utilisé comme modèle biologique: cycle de vie court, multiplication rapide, simplicité anatomique  Ver utilisé comme modèle génétique: organisme totalement séquencé
  • 10. Ascaris suum Nématode parasite: Ascaris suum  Hôte définitif: cochon  Différents organes touchés: intestin, foie, système respiratoire  1 million d’œufs pondus par jour
  • 11. Heterorhabditis megidis  Ver entomopathogène avec pour hôte définitif le charançon  Utilisation dans la lutte biologique  Commercialement exploité Nématode parasite: Heterorhabditis megidis
  • 12. Brugia malayi et Brugia pahangi  Hôte définitif: Homme Hôte intermédiaire: moustique  Responsable de l’éléphantiasis (filariose lymphatique)  120 millions de personnes infectées chaque année dans 80 pays Nématodes parasites: Brugia malayi Brugia pahangi (modèle de laboratoire)
  • 13. Présence des chitinases chez les nématodes?  La présence des chitinases a déjà été démontrée chez différents nématodes (C. elegans et certaines filaires)  Les chitinases ont déjà fait l’objet de plusieurs thèses du laboratoire de parasitologie  Les chitinases de certains nématodes parasites ont été proposées comme cible pour des vaccins
  • 14. Hypothèses 1. Des chitinases sont présentes chez C. elegans et doivent avoir des rôles différents que le seul supposé dans la transmission des nématodes parasites par les vecteurs 2. Des chitinases spécifiques des plantes sont – elles présentes chez C. elegans? si oui, il s'agit d'une nouvelle découverte
  • 15. Objectifs  Rechercher les chitinases de la Famille * et de la Famille * chez le nématode libre appelé C. elegans et caractériser les chitinases de la Famille *, spécifiques aux plantes  Identifier les chitinases de la Famille * chez les vers parasites Ascaris suum, Heterorhabditis megidis, Brugia malayi et B. pahangi
  • 16. Méthodologie Base de données (traitement par ordinateur des informations disponibles) Comparaison des séquences disponibles Clonage pGEM-T Clonage pPIC/pGEXProtéine recombinante Digestion Séquençage PurificationAmorces PCR
  • 17. Méthodologie  Où se trouve l’ADN? Ver Cellule Chromosome ADN de nématodes
  • 18. Résultats  40 gènes de chitinases trouvés pour C. elegans  34 gènes pour la Famille *  6 gènes pour la Famille * (jusqu’à maintenant spécifique aux plantes) Analyse des bases de données
  • 19. Résultats  Identification de la présence des chitinases de la Famille * chez C. elegans Présence confirmée par séquençage 
  • 20. Résultats  Identification de la présence des chitinases de la Famille * chez A. suum Présence confirmée Confirmation de ces résultats par une publication (Geng, 2002)
  • 21. Résultats  Identification de la présence de chitinase de la Famille * chez H. megidis Présence confirmée par séquençage 
  • 22. Résultats  Identification de la présence de chitinases de la Famille * chez B. pahangi et B. malayi Présence confirmée par séquençage 
  • 23. Résultats  Séquençage H.megidis KRDLAAFFAHAIQETRENNNYLYT--ALPDQEASNCFYRGGFYNWFEGGPSSNFLNPETP ||||||||||||||| ||||||||--|||||||||||||||||||||||||||||||||| C.elegans KRDLAAFFAHAIQETGENNNYLYT--ALPDQEASNCFYRGGFYNWFEGGPSSNFLNPETP H.megidis GHSPTDGNSCTSAGRYCSASDQITFFYPCSNSTISNPAAPYKGCYFGRGGIQISYNYNY ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C.elegans GHSPTDGNSCTSAGRYCSASDQITFFYPCSNSTISNPAAPYKGCYFGRGGIQISYNYNY B.malayi : KRDVATFFAHALQETGENDASVY--NNTDLTLEQAHECFYRGGFYNWFERGPNSTFLSPAA- |||||||||||||||||||||||--||||||||||||||||||||||||||||||||||||- C.elegans : KRDVATFFAHALQETGENDASVY--NNTDLTLEQAHECFYRGGFYNWFERGPNSTFLSPAA- B.malayi : -PGFSPFDGKRCTDEGRYCKSDPIIDFWYPCNSDIESHSDKEYHKGYYFGRGALQLSWNYNY -||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| C.elegans : -PGFSPFDGKRCTDEGRYCKSDPIIDFWYPCNSDIESHSDKEYHKGCYFGRGALQLSWNYNY
  • 24. Résultats  Alignements conservés pour les chitinases de la Famille *  Séquences de nématodes plus longues que celles de plantes ou bactérie  Différences dans les résidus conservés
  • 25. Synthèse des résultats Recherche informations dans les bases de données Dessin des amorces Optimisation des conditions de PCR Clonage des gènes d’intérêt Séquençage Expression des protéines recombinantes (système bactérien et de levure) à poursuivre Alignement des séquences
  • 26. Conclusion 1. Vue que des chitinases sont présentes chez C. elegans, les chitinases doivent avoir des rôles différents → La présence confirmée de nombreuses chitinases souligne que les chitinases sont des molécules importantes pour des fonctions diverses 2. Si des chitinases de la Famille * sont effectivement présentes chez C. elegans, il s'agit d'une nouvelle découverte → La présence de ces chitinases a été confirmée et élargie chez C. elegans. Ces chitinases sont aussi présentes chez A. suum, H. megidis, B. malayi et B. pahangi 3. Les chitinases de la Famille * deviennent ainsi de nouvelles cibles possibles pour l’élaboration de vaccin contre les nématodes parasites
  • 27. Perspectives →Acquisition des chitinases de la Famille * chez les nématodes par transfert génétique horizontal (HGT)? → Présence des chitinases de la Famille * chez les vers parasites de plantes? Expression chez les deux sexes? Dans tous les stades de développement? → Système d’expression des chitinases de la Famille *? Rôles et fonctions de ces chitinases? Implication dans la pathogénicité?