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Pourquoi un diagnostic
du paludisme ?

 Bénéfice pour le malade
 Bénéfice pour la communauté
 Adaptation du traitement
 Maîtrise des résistances
Comment ?

Diagnostic de présomption
Diagnostic direct
  Microscopie
  QBC
  Test rapide ou «dipstick»
  PCR
Diagnostic indirect ou sérologique
1 . Diagnostic présomptif

   Circonstances
   Eléments d’orientation
     Epidémiologiques
     Cliniques
     Biologiques
   Avantages
   Inconvénients
2. Diagnostic direct

 Se fait à partir du sang

  Quand effectuer le prélèvement ?
  Combien de prélèvements ?
  Procédure et précautions
    Au moment du prélèvement : gants,
    matériel jetable, etc.
    Transport des prélèvements
    Traitement au laboratoire
2. Diagnostic direct

1 Mise en évidence du parasite :
      Microscopie
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2 Mise en évidence d’ag parasitaire
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      ELISA, RIA
3 Mise en évidence d’ADN parasitaire
      PCR
      Sondes nucléiques
2.1.a Microscopie


  La goutte épaisse et le frottis
    Réalisation pratique
  La coloration
    Giemsa
    Autres colorations
  Points techniques importants
2.1.a Microscopie

       La lecture au microscope
              Sensibilité de la méthode et
              expression de la densité parasitaire
      Pour 100 champs de microscope soit 10 min. de lecture
                    nb de GR nb de GB volume examiné            sensibilité

    Frottis            5x 10 4         60           0,01 µl   100-200 para /µl
Goutte épaisse         1x 10 6       1200            0,2 µl    10-20 para /µl

1 µl de sang il y a environ 5 000 000 de GR et 6000 GB
2.1.a Microscopie

La lecture au microscope
  Les formes parasitaires
2.1.a   Microscopie


   La lecture au microscope
    Les espèces parasitaires Pf, Pv, Po, Pm
    Distribution hétérogène
    Diagnostic d’espèce sur la base de
    critères morphologiques
2.1.a Microscopie

   Avantages
    Faible coût
    Morphologie (stades, espèces)
    Bonne sensibilité
    Quantitatif
    Lecture rétrospective
2.1.a Microscopie

   Inconvénients
    Délai
    Personnel expérimenté
    Equipement
    Problème des infections mixtes
2.1.b QBC

Principe
Sang au bout du doigt
Tube capillaire+Acridine O
Centrifugation
Lecture microscope UV
 FLUORESCENCE

Sensibilité
Volume examiné : 60 µl vs 0.2 µl GE
Sensibilité 1 para/µl
2.1.b QBC

                      P vivax      P falciparum




P falciparum   P vivax+ granulocytes   Pf gametocyte
2.1.b QBC

 Avantages
 Rapidité
 Bonne sensibilité

 Inconvénients
 Toxicité de l’acridine, coût élevé
 Equipements
 Personnel expérimenté
 Pas approprié au terrain
 Pas quantitatif, espèces ?
2.1.c Cytométrie

Marquage des cellules avec un colorant
fluorescent : Hoechst ou thiazole orange
Tri des cellules en fonction de la
fluorescence et de la taille
Evaluation de la parasitémie. Très bonne
sensibilité mais bruit de fond important dû
aux réticulocytes
Utilisée couplée avec immunofluorescence
de surface pour analyse phénotypique GRP
2.2.a Test Rapid «Dipstick»


 Principe : Détection d’antigènes
 parasitaires par immunochromatographie

   Récolte du sang au bout du doigt
   Lyse du sang
   Migration des antigènes libérés
   Détection avec un ou plusieurs Acmx
   marqués
2.2.a Test Rapid «Dipstick»
2.2.a Test Rapid «Dipstick»

Quels antigènes ?
  HRPII
      P.falciparum (ICT, ParaSight, ParaCheck)
      Trophozoites et jeunes gamétocytes
      Fonction de détoxification de l’hème ?
 pLDH
       Antigène non spécifique (OptiMal)
       Tous les stades
 Autres utilisations
      Alternative aux méthodes isotopiques
2.2.a Test Rapid «Dipstick»


  Sensibilité

     >95% (comparé à la microscopie
    100%)
     100 % pour Pf pour des densités >300
    p/µl
     Sensibilité moindre pour Pv (autres
    espèces ?)
2.2.a Test Rapid «Dipstick»


  Spécificité
    Autour de 90%
    Faux positifs (HRPII essentiellement)
2.2.a Test Rapid «Dipstick»

  Avantages

    Rapide : 5 min.
    Peut être réalisé sans expérience
    Bonne sensibilité et bonne spécificité
    Ne nécessite pas d’équipements
   spécifiques
    Adapté au terrain
2.2.a Test Rapid «Dipstick»

  Inconvénients
   Coût : 1-2 USD.
   Pas quantitatif
   Ne distingue pas Pv des autres espèces
   Stabilité des réactifs sur le terrain ?
   Nombre important de faux positifs
    Ne donne pas d’indication sur la
   viabilité des parasites
2.2.a Test Rapid«Dipstick»
2.2.b RIA et ELISA

 Principe : Détection d’antigènes para-
 sitaires

      Utilisation d’anticorps monoclonaux
      Technique en « sandwich »
      Pas d’intérêt réel pour le diagnostic
      Utilisables pour la détection de
     sporozoites chez les vecteurs
2.3 Diagnostic Moléculaire

   Principe

     ADN du parasite
     PCR et /ou hybridation
     Choix de séquences cibles avec
   régions polymorphes et conservées
     Analyse
2.3.a Diagnostic Moléculaire

         DIAGNOSTIC PAR PCR
               SSUrRNA genes

                  PRIMAIRE


                SECONDAIRES       Spécifiques
     1                            de genre
                     P. sp


                 P . falciparum

     2           P. vivax         Spécifiques
                 P. malariae      d’espèces

                 P. ovale
2.3.a Diagnostic Moléculaire

  1. Amplification spécifique de genre
      1    2     3   4     5    6
                Pf   Pv   Po   PM




          Pri
          Sec
2.3.a Diagnostic Moléculaire

  2. Amplifications spécifiques d’espèce
                 V M F O
2.3.a Diagnostic Moléculaire

  Avantages
   Petit prélèvement : «blood spot»
   ADN utilisable pour génotypage, clonage …
   Caractérisation fine par séquençage
   Bonne sensibilité : 1-3 parasites par µl
   Bonne spécificité : proche de 100 %
   Détection de formes parasitaires atypiques
   Etudes rétrospectives
   Partiellement automatisable
   Semi-quantitatif
2.3.a Diagnostic Moléculaire

  Inconvénients
    Temps nécessaire pour l’analyse
    Coût
    Equipement
    Bonne technicité (contaminations)
2.3.b Sondes Moléculaires
   Principe
     Extraction ADN
     «Spotting »
     Dénaturation / neutralisation
     Hybridation avec des sondes
   marquées
     Lecture
   Commentaires
     Séquences répétées SSurRNA, rep 20
   ou Tel
      Quantités importantes d’ADN
Comparaison des méthodes

                         Parasites                  Ag parasitaires        ADN
Méthodes             Microscopie        QBC         HRPII     pLDH         PCR
Expertise                +++             ++            -          -        ++++
Equipement                 +            +++            -          -        ++++
Temps                     ++               +           -          -        ++++
Diagnostic d'espèce       +++             +          Pf      Pf /non Pf     ++++
Adaptation terrain         +               -        ++++        ++++         -
Enquêtes                 +++               -           -           -        ++++
Quantification           ++++             +            -           -         ++
Sensibilité              +++            +++          ++          ++         ++++
Spécificité              +++              +           +          ++         ++++
Standardisation Meth      +++            ++          ++          ++           +
Coût (USD)               0,05          2,0-4,0        2           2          2

        Points forts               Points faibles                Intermédiaire
3. Diagnostic sérologique


  Principe :
  Recherche d’anticorps spécifiques
  Détection du complexe ag/ac par
    1 . Immunofluorescence indirecte
    2 . Elisa
    3 . Radioimmunoanalyse
    4 . Test sérologique sur bandelette
3.1 IF indirecte


  Parasites fixés à l’air
ou à l’acétone
  Dilutions du sérum
   Anti-anticorps
fluorescent
   Mesure de l’extinction
de la fluorescence :
titre en Ac spécifiques
3.2    ELISA

  Ag parasitaire brut, ou fraction purifiée,
ou peptide synthétique
  Dilutions du sérum
  Anti-anticorps marqué par un enzyme
  Révélation de l’activité enzymatique
  Mesure des DO
 Titre en anticorps spécifiques par
 rapport à un seuil.
3. 3 ELISA

             Exemple d’inhibition
             de la réactivité
             d’anticorps
             spécifiques
             Anti-CSP par le
             peptide
             synthétique
             homologue
             Pf et par le peptide
             hétérologue Pm
             correspondant
3. 3 RIA

  Comparable aux autres tests dans la
conception :

   Gamme de dilutions des sérums
   Anti-anticorps marqué avec isotope *
   Mesure des cpm
   Titre en Ac spécifiques par rapport
   à un seuil
3.3 Dipsticks pour sérologie


   Format « dipstick »
    Détection qualitative des Ac spécifiques
  dans le sang, plasma ou sérum.
    Spécifique pour Pv et Pf
   Sensibilisation du support avec les Ag
  CSP et MSP1
   Enquêtes épidémiologiques
3.4 Utilité de la sérologie ?

   Pas d’intérêt pour le diagnostic
  sauf :
   Criblage des donneurs de sang
   Complément d’information chez un
  patient suspecté de paludisme mais
  avec gouttes épaisses négatives
   Diagnostic d’espèce rétrospectif
PISTES DE RECHERCHE

Améliorations possibles
  Tests rapides
   Lecture quantitative
   Caractérisation des espèces
   Améliorer la sensibilité et la spécificité
   Instaurer un contrôle qualité
   Développer une banque de réactifs pour
  tester la qualité des « dispticks »
   Combiner sur la même bandelette un
  diagnostic paludisme et Dengue
PISTES DE RECHERCHE

Améliorations possibles

  PCR

   Standardiser la méthode
   Développer un kit PCR de diagnostic
   Automatiser la méthode pour des
  études à grande échelle
PISTES DE RECHERCHE

Recherche
  Tests rapides
   Etudier la persistances des antigènes
  HRPII et pLDH après le traitement.
   Etudier le polymorphisme HRPII et pLDH
  chez des parasites sauvages.
   Développer d’autres systèmes
  antigéniques pour la détection spécifique
  des stades asexués et sexués
PISTES DE RECHERCHE

Recherche

 Tests rapides
  Evaluer la possibilité de mise au point
 d’un test rapide pour déterminer la
 sensibilité d’un isolats à un médicament
  Etudier la durée de validité des
 « dipsticks » dans les conditions du
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Pourquoi un diagnostic du paludisme ?

  • 1. Pourquoi un diagnostic du paludisme ? Bénéfice pour le malade Bénéfice pour la communauté Adaptation du traitement Maîtrise des résistances
  • 2. Comment ? Diagnostic de présomption Diagnostic direct Microscopie QBC Test rapide ou «dipstick» PCR Diagnostic indirect ou sérologique
  • 3. 1 . Diagnostic présomptif Circonstances Eléments d’orientation Epidémiologiques Cliniques Biologiques Avantages Inconvénients
  • 4. 2. Diagnostic direct Se fait à partir du sang Quand effectuer le prélèvement ? Combien de prélèvements ? Procédure et précautions Au moment du prélèvement : gants, matériel jetable, etc. Transport des prélèvements Traitement au laboratoire
  • 5. 2. Diagnostic direct 1 Mise en évidence du parasite : Microscopie Quantitative Buffy Coat (QBC) Cytométrie de flux 2 Mise en évidence d’ag parasitaire Test rapide sur bandelette (dipstick) ELISA, RIA 3 Mise en évidence d’ADN parasitaire PCR Sondes nucléiques
  • 6. 2.1.a Microscopie La goutte épaisse et le frottis Réalisation pratique La coloration Giemsa Autres colorations Points techniques importants
  • 7. 2.1.a Microscopie La lecture au microscope Sensibilité de la méthode et expression de la densité parasitaire Pour 100 champs de microscope soit 10 min. de lecture nb de GR nb de GB volume examiné sensibilité Frottis 5x 10 4 60 0,01 µl 100-200 para /µl Goutte épaisse 1x 10 6 1200 0,2 µl 10-20 para /µl 1 µl de sang il y a environ 5 000 000 de GR et 6000 GB
  • 8. 2.1.a Microscopie La lecture au microscope Les formes parasitaires
  • 9. 2.1.a Microscopie La lecture au microscope Les espèces parasitaires Pf, Pv, Po, Pm Distribution hétérogène Diagnostic d’espèce sur la base de critères morphologiques
  • 10.
  • 11.
  • 12. 2.1.a Microscopie Avantages Faible coût Morphologie (stades, espèces) Bonne sensibilité Quantitatif Lecture rétrospective
  • 13. 2.1.a Microscopie Inconvénients Délai Personnel expérimenté Equipement Problème des infections mixtes
  • 14. 2.1.b QBC Principe Sang au bout du doigt Tube capillaire+Acridine O Centrifugation Lecture microscope UV FLUORESCENCE Sensibilité Volume examiné : 60 µl vs 0.2 µl GE Sensibilité 1 para/µl
  • 15. 2.1.b QBC P vivax P falciparum P falciparum P vivax+ granulocytes Pf gametocyte
  • 16. 2.1.b QBC Avantages Rapidité Bonne sensibilité Inconvénients Toxicité de l’acridine, coût élevé Equipements Personnel expérimenté Pas approprié au terrain Pas quantitatif, espèces ?
  • 17. 2.1.c Cytométrie Marquage des cellules avec un colorant fluorescent : Hoechst ou thiazole orange Tri des cellules en fonction de la fluorescence et de la taille Evaluation de la parasitémie. Très bonne sensibilité mais bruit de fond important dû aux réticulocytes Utilisée couplée avec immunofluorescence de surface pour analyse phénotypique GRP
  • 18. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Principe : Détection d’antigènes parasitaires par immunochromatographie Récolte du sang au bout du doigt Lyse du sang Migration des antigènes libérés Détection avec un ou plusieurs Acmx marqués
  • 19. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»
  • 20. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Quels antigènes ? HRPII P.falciparum (ICT, ParaSight, ParaCheck) Trophozoites et jeunes gamétocytes Fonction de détoxification de l’hème ? pLDH Antigène non spécifique (OptiMal) Tous les stades Autres utilisations Alternative aux méthodes isotopiques
  • 21. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Sensibilité >95% (comparé à la microscopie 100%) 100 % pour Pf pour des densités >300 p/µl Sensibilité moindre pour Pv (autres espèces ?)
  • 22. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Spécificité Autour de 90% Faux positifs (HRPII essentiellement)
  • 23. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Avantages Rapide : 5 min. Peut être réalisé sans expérience Bonne sensibilité et bonne spécificité Ne nécessite pas d’équipements spécifiques Adapté au terrain
  • 24. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Inconvénients Coût : 1-2 USD. Pas quantitatif Ne distingue pas Pv des autres espèces Stabilité des réactifs sur le terrain ? Nombre important de faux positifs Ne donne pas d’indication sur la viabilité des parasites
  • 26. 2.2.b RIA et ELISA Principe : Détection d’antigènes para- sitaires Utilisation d’anticorps monoclonaux Technique en « sandwich » Pas d’intérêt réel pour le diagnostic Utilisables pour la détection de sporozoites chez les vecteurs
  • 27. 2.3 Diagnostic Moléculaire Principe ADN du parasite PCR et /ou hybridation Choix de séquences cibles avec régions polymorphes et conservées Analyse
  • 28. 2.3.a Diagnostic Moléculaire DIAGNOSTIC PAR PCR SSUrRNA genes PRIMAIRE SECONDAIRES Spécifiques 1 de genre P. sp P . falciparum 2 P. vivax Spécifiques P. malariae d’espèces P. ovale
  • 29. 2.3.a Diagnostic Moléculaire 1. Amplification spécifique de genre 1 2 3 4 5 6 Pf Pv Po PM Pri Sec
  • 30. 2.3.a Diagnostic Moléculaire 2. Amplifications spécifiques d’espèce V M F O
  • 31. 2.3.a Diagnostic Moléculaire Avantages Petit prélèvement : «blood spot» ADN utilisable pour génotypage, clonage … Caractérisation fine par séquençage Bonne sensibilité : 1-3 parasites par µl Bonne spécificité : proche de 100 % Détection de formes parasitaires atypiques Etudes rétrospectives Partiellement automatisable Semi-quantitatif
  • 32. 2.3.a Diagnostic Moléculaire Inconvénients Temps nécessaire pour l’analyse Coût Equipement Bonne technicité (contaminations)
  • 33. 2.3.b Sondes Moléculaires Principe Extraction ADN «Spotting » Dénaturation / neutralisation Hybridation avec des sondes marquées Lecture Commentaires Séquences répétées SSurRNA, rep 20 ou Tel Quantités importantes d’ADN
  • 34. Comparaison des méthodes Parasites Ag parasitaires ADN Méthodes Microscopie QBC HRPII pLDH PCR Expertise +++ ++ - - ++++ Equipement + +++ - - ++++ Temps ++ + - - ++++ Diagnostic d'espèce +++ + Pf Pf /non Pf ++++ Adaptation terrain + - ++++ ++++ - Enquêtes +++ - - - ++++ Quantification ++++ + - - ++ Sensibilité +++ +++ ++ ++ ++++ Spécificité +++ + + ++ ++++ Standardisation Meth +++ ++ ++ ++ + Coût (USD) 0,05 2,0-4,0 2 2 2 Points forts Points faibles Intermédiaire
  • 35. 3. Diagnostic sérologique Principe : Recherche d’anticorps spécifiques Détection du complexe ag/ac par 1 . Immunofluorescence indirecte 2 . Elisa 3 . Radioimmunoanalyse 4 . Test sérologique sur bandelette
  • 36. 3.1 IF indirecte Parasites fixés à l’air ou à l’acétone Dilutions du sérum Anti-anticorps fluorescent Mesure de l’extinction de la fluorescence : titre en Ac spécifiques
  • 37. 3.2 ELISA Ag parasitaire brut, ou fraction purifiée, ou peptide synthétique Dilutions du sérum Anti-anticorps marqué par un enzyme Révélation de l’activité enzymatique Mesure des DO Titre en anticorps spécifiques par rapport à un seuil.
  • 38. 3. 3 ELISA Exemple d’inhibition de la réactivité d’anticorps spécifiques Anti-CSP par le peptide synthétique homologue Pf et par le peptide hétérologue Pm correspondant
  • 39. 3. 3 RIA Comparable aux autres tests dans la conception : Gamme de dilutions des sérums Anti-anticorps marqué avec isotope * Mesure des cpm Titre en Ac spécifiques par rapport à un seuil
  • 40. 3.3 Dipsticks pour sérologie Format « dipstick » Détection qualitative des Ac spécifiques dans le sang, plasma ou sérum. Spécifique pour Pv et Pf Sensibilisation du support avec les Ag CSP et MSP1 Enquêtes épidémiologiques
  • 41. 3.4 Utilité de la sérologie ? Pas d’intérêt pour le diagnostic sauf : Criblage des donneurs de sang Complément d’information chez un patient suspecté de paludisme mais avec gouttes épaisses négatives Diagnostic d’espèce rétrospectif
  • 42. PISTES DE RECHERCHE Améliorations possibles Tests rapides Lecture quantitative Caractérisation des espèces Améliorer la sensibilité et la spécificité Instaurer un contrôle qualité Développer une banque de réactifs pour tester la qualité des « dispticks » Combiner sur la même bandelette un diagnostic paludisme et Dengue
  • 43. PISTES DE RECHERCHE Améliorations possibles PCR Standardiser la méthode Développer un kit PCR de diagnostic Automatiser la méthode pour des études à grande échelle
  • 44. PISTES DE RECHERCHE Recherche Tests rapides Etudier la persistances des antigènes HRPII et pLDH après le traitement. Etudier le polymorphisme HRPII et pLDH chez des parasites sauvages. Développer d’autres systèmes antigéniques pour la détection spécifique des stades asexués et sexués
  • 45. PISTES DE RECHERCHE Recherche Tests rapides Evaluer la possibilité de mise au point d’un test rapide pour déterminer la sensibilité d’un isolats à un médicament Etudier la durée de validité des « dipsticks » dans les conditions du terrain