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CARACTÉRISATION
DE MÉTHODES
D’ANALYSES SUR
LES PRODUITS
LAITIERS
LABORATOIRE
DÉPARTEMENTAL
VÉTÉRINAIRE DU
FINISTÈRE
• Création en 1961
• Accrédité COFRAC
• Une centaine d’employés
• Locaux de 4300m2
LES DIFFÉRENTS SECTEURS
D’ACTIVITÉ
• Santé Animale
• Microbiologie des aliments et de l’eau
• Chimie Alimentaire, eau, environnement
• Administratif
LE SERVICE
CHROMATOGRAPHIE
Analyses pour la qualité des :
• Eaux naturelles et de
traitement
• Animaux d’élevage
• Produits laitiers

Les principaux clients :
• DDASS
• DSV
• Industriels privés
ANALYSES SUR LES
PRODUITS LAITIERS
• Teneur en eau
• Matière sèche non grasse
• pH
• Acidité oléique
• Indice de peroxyde
• Dosage carotène, acide énantique, sitostérol
LES TRACEURS DANS LES
PRODUITS LAITIERS
• La CE vend des produits à prix réduits
• Marque de reconnaissance : ajout de traceurs
• Il existe 2 catégories :
 Chimique : acide énantique (B0)
sitostérol (B1)
 Physique : vanilline (A0)
carotène (A2)
LES MÉTHODES
D’ANALYSES
ÉTUDIÉES
DOSAGE DU CAROTÈNE
•

Détermination de la pureté du carotène

• Gamme d’étalon
• Mesure des échantillons par un spectrophotomètre à
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PRINCIPE DU DOSAGE
• Mesure de l’absorbance
• Loi de Beer Lambert :
A=ElC
Avec E le coefficient d’extinction
DOSAGE DE LA VANILLINE

Principe :
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Conditions chromato :
 Pompe : débit 1.0mL/min
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LES DIFFÉRENTS TYPES DE
HPLC
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HPLC en phase inversée
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PHASE MOBILE
Deux possibilité :
Gradient d’élution : variation de la
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VALIDATION ET
CARACTÉRISATION
DE MÉTHODES
• Méthode validation basée sur
la Norme XPT 90-210 AFNOR de décembre 1999
« Protocole d’évaluation d’une méthode alternative
d’analyse physico-chimique quantitative par rapport à
une méthode de référence »
• Trois plans à suivre de type A, B et C
PLAN DE TYPE A
Il permet de caractériser :
La linéarité
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LA LINÉARITÉ
• Connaître jusqu’où la mesure est linéaire
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0,5

1

1,5
Concentration A2 (µg/mL)

2

2,5

3
LA VANILLINE
Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par
chromatographie

•Linéarité de l’appareil:

1500000
Aire du pic

Gamme d’étalons de 0.25
à 2 µg/mL

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500000

0
0

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0,5

1

1,5

Concentration A0 (µg/mL)

2

2,5
•

Limites de détection et de quantification :

1) Essais à 0.2µg/mL
Limite non vérifiée
2) Essais à 0.25µg/mL
Limite de quantification à 0.25µg/mL validée
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2000000

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• Répétabilité et
reproductibilité :
10 échantillons mesuré
avec 2 répétitions pour
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• Linéarité de la
manipulation :
Gamme de 0.25 à 2 µg/mL
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beurre

1000000

500000

0
0

0,5

1

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  • 2. LABORATOIRE DÉPARTEMENTAL VÉTÉRINAIRE DU FINISTÈRE • Création en 1961 • Accrédité COFRAC • Une centaine d’employés • Locaux de 4300m2
  • 3. LES DIFFÉRENTS SECTEURS D’ACTIVITÉ • Santé Animale • Microbiologie des aliments et de l’eau • Chimie Alimentaire, eau, environnement • Administratif
  • 4. LE SERVICE CHROMATOGRAPHIE Analyses pour la qualité des : • Eaux naturelles et de traitement • Animaux d’élevage • Produits laitiers Les principaux clients : • DDASS • DSV • Industriels privés
  • 5. ANALYSES SUR LES PRODUITS LAITIERS • Teneur en eau • Matière sèche non grasse • pH • Acidité oléique • Indice de peroxyde • Dosage carotène, acide énantique, sitostérol
  • 6. LES TRACEURS DANS LES PRODUITS LAITIERS • La CE vend des produits à prix réduits • Marque de reconnaissance : ajout de traceurs • Il existe 2 catégories :  Chimique : acide énantique (B0) sitostérol (B1)  Physique : vanilline (A0) carotène (A2)
  • 8. DOSAGE DU CAROTÈNE • Détermination de la pureté du carotène • Gamme d’étalon • Mesure des échantillons par un spectrophotomètre à 440nm
  • 9. PRINCIPE DU DOSAGE • Mesure de l’absorbance • Loi de Beer Lambert : A=ElC Avec E le coefficient d’extinction
  • 10. DOSAGE DE LA VANILLINE Principe : • Extraction • Détermination RP-HPLC Conditions chromato :  Pompe : débit 1.0mL/min  Injecteur : 20µL  Détecteur : UV à 306nm  Colonne : RP18 (merck 5µm)  Phase mobile : eau (dont 3%acide acétique) -méthanol (70:30, v/v)
  • 11. PRINCIPE DE LA HPLC • Séparation des constituants d’un mélange
  • 12. LES DIFFÉRENTS TYPES DE HPLC 1 - chromatographie d'adsorption 2 - chromatographie de partage (en phase directe(2A) ou inverse(2B)) 3 - chromatographie d'échange d'ions (+ chromatographie ionique) 4 - chromatographie de paires d'ions 5 - chromatographie d'exclusion 6 - chromatographie d'affinité 7 - chromatographie adaptée à la séparation d'énantiomères
  • 13. HPLC en phase inversée • En phase inverse l’éluant est plus polaire que la phase stationnaire • Donc silice greffée dans la colonne
  • 14. PHASE MOBILE Deux possibilité : Gradient d’élution : variation de la concentration de l’éluant (utilisé pour les mélanges complexes) Mode isocratique : concentration constante
  • 16. • Méthode validation basée sur la Norme XPT 90-210 AFNOR de décembre 1999 « Protocole d’évaluation d’une méthode alternative d’analyse physico-chimique quantitative par rapport à une méthode de référence » • Trois plans à suivre de type A, B et C
  • 17. PLAN DE TYPE A Il permet de caractériser : La linéarité La limite de quantification La limite de détection
  • 18. LA LINÉARITÉ • Connaître jusqu’où la mesure est linéaire • Caractérisation de l’étalonnage • Réalisation d’un plan à 5 niveaux de concentration et 5 répétitions • Vérification par des calculs statistiques
  • 19. LIMITES DE QUANTIFICATION ET DE DÉTECTION • Il existe 3 méthodes :  Issue de l’étude de la linéarité  Issue de l’étude du blanc de matrice  Par vérification d’une limite choisie : Une concentration choisie 10 prises d’essais identiques Dans des conditions de répétabilité Vérification par calculs statistiques • Limite de détection = LQ/3
  • 20. PLAN DE TYPE B • Il permet de contrôler les effets de la matrice sur la mesure • Réalisation d’ajouts dosés • Vérification de la présence d’interférences • C’est la spécificité de la méthode
  • 21. PLAN DE TYPE C • Il permet d’estimer la répétabilité et la justesse de la méthode • Comparaison méthode de référence/méthode alternative
  • 22. LA CARACTÉRISATION • Valider une méthode de référence • Les étapes à suivre :  Linéarité  Limites de détection et de quantification  Répétabilité et reproductibilité • Les facteurs étudiés dépendent de la manipulation
  • 24. LE CAROTÈNE • La linéarité de l’appareil: Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par spectroscopie 1,000 Gamme d’essais de 0.55 à 2.75 µg/mL en étalon de carotène 0,900 0,800 Absorbance 0,700 0,600 y = 0,3061x R2 = 0,9977 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 0,5 1 1,5 Concentration A2 (µg/mL) La linéarité est validée 2 2,5 3
  • 25. • Limites de détection et de quantification : 1) Essais à 0.1µg/mL Limite non vérifiée 2) Essais à 0.2µg/mL Limite de quantification à 0.2µg/mL validée Limite de détection est 0.067µg/mL
  • 26. • Répétabilité : Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par spectroscopie 10 mesures avec des ajouts de 21µg de carotène dans le beurre non tracé • Linéarité de la manipulation : Gamme de 0.55 à 2.75 µg/mL par ajouts 1,100 1,000 0,900 0,800 0,700 Absorbance Rendement de 99% 1,200 0,600 y = 0,334x R2 = 0,9369 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 0,5 1 1,5 Concentration A2 (µg/mL) 2 2,5 3
  • 27. LA VANILLINE Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par chromatographie •Linéarité de l’appareil: 1500000 Aire du pic Gamme d’étalons de 0.25 à 2 µg/mL 2000000 1000000 y = 819571x R2 = 0,9901 500000 0 0 La linéarité est validée 0,5 1 1,5 Concentration A0 (µg/mL) 2 2,5
  • 28. • Limites de détection et de quantification : 1) Essais à 0.2µg/mL Limite non vérifiée 2) Essais à 0.25µg/mL Limite de quantification à 0.25µg/mL validée Limite de détection est 0.083µg/mL
  • 29. Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par chromatographie 2000000 y = 610624x R2 = 0,9712 1500000 Aire du pic • Répétabilité et reproductibilité : 10 échantillons mesuré avec 2 répétitions pour une concentration de 0.5µg/mL Rendement de 107% • Linéarité de la manipulation : Gamme de 0.25 à 2 µg/mL avec des ajouts dans le beurre 1000000 500000 0 0 0,5 1 1,5 Concentration A0 (µg/mL) 2 2,5
  • 30. CONCLUSION Les méthodes d’analyses du carotène et de la vanilline sont caractérisées