1. La genetica delle
amiloidosi familiari
Gabriella Restagno
SS Diagnostica e Consulenza genetica
AO OIRM-S.Anna
E-mail: gabriella.restagno@oirmsantanna.piemonte.it
Conferenze Patologico-cliniche 2008

2. Le amiloidosi familiari:
eterogeneità genetica
Gruppo di differenti malattie ognuna
risultante da mutazioni in una
proteina specifica
La più comune: transtiretina
Più rare: apolipoproteina AI,
cistatina C, lisozima, catena Aα del
fibrinogeno, apolipoproteina AII

3. Basi genetiche “semplici” e basi genetiche
“complesse”
Ereditarietà “semplice”, correlazione
Genotipo-fenotipo Caratteri Complessi: interazione
Geni + ambiente

6. L’utilizzo dei test genetici è un intervento
complesso
Sospetto diagnostico, informazione e
preparazione al test (consulenza pre-
test)
Strategie di esecuzione del test genetico
di laboratorio: quali tecnologie
Interpretazione dei risultati
Comunicazione al paziente (consulenza
post-test)
Supporto a chi ha ricevuto un test
positivo

7. Non indicato il cariotipo
Prepared from chromosome
metaphase spreads
Requires dividing cells
Each chromosome has its
unique staining pattern
Results need to be read and
interpreted by a certified
cytogeneticist
Resolution of technique is ~5
Mb

8. Indicata l’analisi del DNA
Le molecole di DNA sono a
doppia elica, connesse da ponti
idrogeno
Le varie combinazioni di
questi quattro nucleotidi
creano un codice unico per il
DNA chiamato sequenza ( o
genotipo, gene, allele)
Cambiamenti nella sequenza
del DNA sono detti mutazioni
(se causa di malattia) o
polimorfismi (se varianti
“neutre”)
Un Dna è un lungo polimero
formato da quattro basi
azotate (nucleotidi).

9. La diagnosi genetica può essere eseguita con la
ricerca di mutazioni sulla sequenza dei diversi geni
Perché eseguire l’analisi del DNA
(Analisi di un gene specifico allo scopo di accertare o escludere
un’alterazione associata ad una malattia ereditaria, nelle
amiloidosi TTR, apolipoproteina AI, cistatina C, lisozima,
catena Aa del fibrinogeno, apolipoproteina AII, MEFV )
•Conferma diagnostica
•Identificazione degli eterozigoti (“carrier”)
•Test presintomatici e predittivi
•Test di “suscettibilità” o “predisposizione”

10. Come di esegue l’analisi del DNA
Il DNA viene estratto generalmente da un prelievo
di sangue (in edta). L’analisi si effettua in tre passaggi:
1) Preparazione del campione
2) Amplificazione (PCR)
3) Rivelazione della mutazione (o del polimorfismo)
con differenti metodiche

11. Mutazioni del DNA
Mutazione
puntiforme Duplicazione
Delezione Inserzione
Varianti di uno stesso gene possono causare
sintomi clinici noti (mutazioni) o non dare
sintomi clinici (polimorfismi)

12. Le amiloidosi ereditarie :
autosomiche dominanti (AD)

13. Le amiloidosi ereditarie :
da transtiretina (A TTR)
Mutazioni nella plasma proteina tetramerica
transtiretina, composta da 127 aminoacidi
trasporta ormone tiroideo e VitA attraverso un
complesso con RBP in siero e liquor

14. TTR: il locus
OMIM: *107680, 18q11.2 q
- 12.1

15. TTR: il gene 4 esoni, 615 bp (147
aminoacidi)

16. A TTR: Eterogeneità allelica e
fenotipica

17. A TTR: Eterogeneità allelica e
fenotipica

18. A TTR: la stessa mutazione può dare
fenotipi differenti
V30M: variabilità dei sintomi clinici in soggetti di origine
etnica differente
V30M: penetranza (% di portatori della mutazione che
sviluppano la malattia) inferiore al 50%
Ile84Ser: penetranza circa 100%

19. Mutazioni in altri geni non TTR

20. Amiloidosi da ApoAI: il locus
OMIM: *107680, 11q23

21. ApoAI: 4 esoni, 897 bp, 267 aminoacidi
•Gly26Arg (ggc>cgc): NP, nefropatia
• Trp50Arg (tgg>agg): A sistemica, non NP
•Leu90Pro (cta>cca): A cardiaca e cutanea
•Arg173Pro (cga>cca): A cardiaca, cutanea, laringea
•Leu174Ser (ttg>tcg): A sistemica, non NP
•Ala175Pro ( gcg>ccg): A sistemica, nefropatia, laringea
•del60-71 insVal/Thr: A epatica
•del70-72: nefropatia

22. Amiloidosi da gelsolina: il locus
OMIM: *137350, 9q34

23. Amiloidosi da gelsolina: il gene / le mutazioni
17 esoni, 2657 bp, 782 aminoacidi, splicing alternativi
Asp187Asn: A sistemica, NP
Asp187Tyr : A sistemica, NP

24. Una forma autosomica recessiva: il gene
MEFV
OMIM: *6081107, 16p13
10 esoni, 3677 bp, 781 aminoacidi
splicing alternativi tessuto specifici

25. il gene MEFV: mutazioni in omozigosi con
frequenza differente in diverse popolazioni
M694V: più frequente in
popolazioni con amiloidosi
sistemica (penetranza 99%, 20-
65% dei cromosomi FMF in
Arabi, Armeni, Turchi)
E148Q (penetranza 55%)
V726A: più frequente in
popolazioni in cui l’amiloidosi è
meno comune
tre mutazioni hotspot ai codoni
148, 680 e 694

26. I geni delle amiloidosi: metodi
d’indagine molecolare
Per le mutazioni frequenti
Per le mutazioni rare
Analisi con primers allele- DGGE
specifici (ARMS)
SSCP
Analisi con sonde
oligonucleotidiche allele-
specifiche (dot blot, DHPLC
reverse dot blot, kit...)
Sequenziamento
Microchip
Pyrosequencing

27. 1953: doppia elica del DNA ( Watson e Crick )
1955: 46 cromosomi
1961: mRNA
1966: codice genetico
1968: primo enzima di restrizione
1975-1977: sequenza del DNA (Sanger)
1983: mappato il primo gene-malattia
INVENTATA LA PCR
2 4 8 16 32 64 128 etc.

28. Amplificazione del DNA tramite PCR
(Polymerase Chain Reaction)
La Polymerase Chain Reaction (PCR) è un
processo di amplificazione del DNA che, a
partire da una sequenza DNA “bersaglio”, ne
consente l’amplificazione selettiva e rapida.
Ingredienti:
DNA da analizzare
Oligonucleotidi 20 µL
(primer)
Nucleotidi
Mg, buffer
Taq Polimerasi

29. DHPLC (Denaturing high performance liquid
chromatography)
•Tecnica di screening che permette di identificare variazioni nella sequenza
del DNA in eterozigosi senza uso di gel, fluorescenti ecc., su una speciale
colonna cromatografica
• Dopo la PCR si esegue una denaturazione (94°C) e un
re-annealing (56°C) in cui si formano gli omoduplici originali di filamenti
complementari e gli eteroduplici generati dalla combinazione di un
filamento wild type e di uno mutato
wild type mutato eteroduplici omoduplici

30. Profilo cromatografico in DHPLC dell’esone 2 del
gene TTR in soggetto eterozigote V30M / wt
V30M
wild-type

31. Sequenza diretta gene TTR
mutazione V30M/wt, esone 2

32. Profilo cromatografico in DHPLC dell’esone 2 del
gene TTR in soggetto eterozigote E89Q / wt
E89Q
wild-type

33. Sequenza diretta gene TTR
E89Q / wt, esone 3

34. Interpretazione delle mutazioni
Database
pubblicazioni
esperienza dei centri

35. Problemi aperti : interpretazione prognostica
del significato delle mutazioni
Database
Anamnesi familiare
Mutazioni “de novo”
Penetranza incompleta
Espressione variabile (geni modificatori,
eterogeneità allelica o di locus, fattori ambientali)

36. Il punto più critico: i tempi di risposta
dei test molecolari
•Dati i costi delle analisi sul DNA
(purificazione, DHPLC, sequenze, ecc.) in
genere si segue una procedura a passaggi
successivi : essenziale una consulenza
genetica pre test
-
•i tempi di risposta possono variare da una
settimana a vari mesi
•in una percentuale variabile di casi non si
evidenziano mutazioni

37. PROSPETTIVE :
LE NUOVE TECNOLOGIE
Messa a punto di pannelli per l’analisi rapida
delle mutazioni più frequenti, determinate
su basi epidemiologiche
Analisi contemporanea di un elevato numero
di mutazioni note, anche in geni diversi:
(multiplex PCR)
•Sequenziamento in tempo reale
•Analisi con microarray (microchip)

38. Next-generation sequencing
Trends in Genetics, Vol 24, marzo 2008

39. Essenziale
•Necessità di una stretta collaborazione tra
clinici, genetisti e laboratoristi
•utilizzo di strumentazione ad elevato throughput
per l’analisi molecolare contemporanea di un
elevato numero di geni/mutazioni
•attenta valutazione dei risultati dei test
molecolari insieme ai dati clinici e di laboratorio
• consulenza genetica