O documento resume os resultados de um projeto de extração, caracterização e imobilização da enzima invertase. Os alunos extraíram a enzima de fermento comercial e a imobilizaram em alginato de cálcio. Eles caracterizaram a enzima livre e imobilizada, determinando os pH e temperaturas ótimos. A imobilização aumentou a estabilidade da enzima às variações de pH e temperatura, mas reduziu sua atividade. Testes em reatores em batelada e contínuo mostraram que a conversão poderia

1. EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E IMOBILIZAÇÃO DA ENZIMA
INVERTASE
RESULTADOS OBTIDOS
Alunos:
Cauê Machado
Euclides Formica
Guilherme Missumi
Karen Aguilera
Professora: Ariela
Veloso
Dezembro de 2015

2. DADOS EXPERIMENTAIS DA CURVA DE
CALIBRAÇÃO POR MÉTODO DE LOWRY
 Padrão: BSA (Soro Albumina Bovina)

3. CURVA DE CALIBRAÇÃO PELO MÉTODO DE LOWRY
 R² = 0,9608 (alta correlação)

4. DADOS EXPERIMENTAIS DA CURVA DE CALIBRAÇÃO DE
AÇÚCARES REDUTORES POR DNS

5. CURVA DE CALIBRAÇÃO PELO MÉTODO DNS
 Alta correlação (R² = 0,9993)

6. RENDIMENTO DA EXTRAÇÃO
 Extração com éter e água por meio de trituração mecânica;
 Utilização de fermento comercial;
 Após o termino do processo de extração se obteve os seguintes resultados:

7. QUANTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS DO
EXTRATO BRUTO
 Com base no método de Lowry;
 Concentração média de 6,0 mg/mL.

8. ABSORBÂNCIA MÉDIA USANDO DIFERENTES
VOLUMES E DILUIÇÕES DA ENZIMA

9. PRODUTO OBTIDO EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES
DE ENZIMA LIVRE
t=20 min
pH=5,0
T=37ºC

10. INTERPOLAÇÃO DAS CURVAS DE 400ΜL E 800 ΜL,
POR 1/DILUIÇÃO

11. DILUIÇÃO IDEAL DA ENZIMA
 Partindo de:
 E sabendo que a absorbância ideal deve estar próxima
de 0,5:

12. FORMULAS USADAS PARA CALCULAR A ATIVIDADE
ESPECIFICA E RELATIVA DA ENZIMA

13. DADOS EXPERIMENTAIS PARA DETERMINAÇÃO DO
PH ÓTIMO DA ENZIMA LIVRE

14. ATIVIDADES ESPECIFICA E RELATIVA DA
INVERTASE LIVRE EM DIFERENTES PHS

15. CONCENTRAÇÃO DE PRODUTOS EM
DIFERENTES PH
Sacarose 1%
T= 20min
T=37ºC

16. GRÁFICO DA ATIVIDADE RELATIVA DA
INVERTASE LIVRE EM FUNÇÃO DO PH

17. ATIVIDADE DA INVERTASE LIVRE EM FUNÇÃO
DO PH

18. GRÁFICO DA ATIVIDADE ESPECIFICA DA
INVERTASE LIVRE EM FUNÇÃO DO PH
 Com base nos gráficos, o pH ótimo seria estaria entre 5 e 6;
 Próximo ao padrão descrito na literatura (pH entre 3,9 e 5,1).

19. DADOS EXPERIMENTAIS PARA A DETERMINAÇÃO DA
TEMPERATURA ÓTIMA DA INVERTASE LIVRE

20. ATIVIDADE, ATIVIDADE RELATIVA E ATIVIDADE
ESPECIFICA DA INVERTASE LIVRE EM DIFERENTES
TEMPERATURAS

21. CONCENTRAÇÃO DE PRODUTO EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA

22. VARIAÇÃO DA ATIVIDADE RELATIVA DA INVERTASE LIVRE
EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA

23. VARIAÇÃO DA ATIVIDADE DA INVERTASE LIVRE
EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA

24. VARIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPECIFICA DA INVERTASE
LIVRE EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA
 Temperatura ótima em torno de 45ºC;
 Dentro do intervalo descrito na literatura (39 a 55ºC).

25. DADOS EXPERIMENTAIS DA VARIAÇÃO DA
ABSORBÂNCIA EM FUNÇÃO DO NÚMERO DE
PELLETS

26. VARIAÇÃO DA ABSORBÂNCIA EM FUNÇÃO DO
NÚMERO DE PELLETS
 Desconsiderar dados que ultrapassem a linha pontilhada;
 Número ideal de pellets igual a 11.

27. DADOS EXPERIMENTAIS PARA A DETERMINAÇÃO DO
PH ÓTIMO DA INVERTASE IMOBILIZADA

28. ATIVIDADE E ATIVIDADE RELATIVA DA ENZIMA
INVERTASE IMOBILIZADA EM FUNÇÃO DO PH

29. CONCENTRAÇÃO DO PRODUTO EM FUNÇÃO
DO PH PARA A INVERTASE IMOBILIZADA

30. VARIAÇÃO DA ATIVIDADE DA INVERTASE
IMOBILIZADA EM FUNÇÃO DO PH

31. VARIAÇÃO DA ATIVIDADE RELATIVA DA INVERTASE
IMOBILIZADA EM FUNÇÃO DO PH
 pH ideal próximo a 5;
 Dentro do intervalo da literatura (3,9 a 5,1).

32. DADOS EXPERIMENTAIS UTILIZADOS PARA
DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA ÓTIMA DA INVERTASE
IMOBILIZADA

33. ATIVIDADE E ATIVIDADE RELATIVA DA INVERTASE
IMOBILIZADA EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA

34. CONCENTRAÇÃO DE PRODUTO FORMADO EM FUNÇÃO DA
TEMPERATURA, PARA INVERTASE IMOBILIZADA

35. VARIAÇÃO DA ATIVIDADE DA INVERTASE EM
FUNÇÃO DA TEMPERATURA

36. VARIAÇÃO DA ATIVIDADE RELATIVA DA INVERTASE
IMOBILIZADA EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA
 Temperatura ideal de 45ºC;
 Dentro do intervalo descrito na literatura (39ºC a 55ºC).

37. COMPARAÇÃO ENTRE A VARIAÇÃO DA
ATIVIDADE RELATIVA DA ENZIMA LIVRE E DA
IMOBILIZADA EM FUNÇÃO DO PH
 Enzima imobilizada mantém sua atividade mais estável quando submetida a
variações de pH.

38. COMPARAÇÃO ENTRE A VARIAÇÃO DA
ATIVIDADE RELATIVA DA ENZIMA LIVRE E
IMOBILIZADA EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA
 A perda de atividade em função da temperatura ocorre de maneira menos brusca
na imobilizada em relação a livre.

39. COMPARAÇÃO ENTRE AS ATIVIDADES DA ENZIMA
LIVRE E IMOBILIZADA EM CONDIÇÕES ÓTIMAS
 Considerou-se que cada pellet tinha volume de aproximadamente 0,05 mL;
 A atividade da imobilizada é mais baixa que a da livre (diluição pelo alginato de
cálcio);
 Mudanças estereoquímicas e conformacionais no sítio ativo;
 Problemas na transferência de massa causados pela imobilização.

40. REATOR BATELADA DE MISTURA TOTAL

41. CONCENTRAÇÕES MEDIAS DE PRODUTO
FORMADO E CONVERSÃO PERCENTUAL PARA A
INVERTASE LIVRE, IMOBILIZADA E IMOBILIZADA
DE REUSO

42. CONCENTRAÇÃO MEDIA DE PRODUTO FORMADO PELA
ENZIMA LIVRE, IMOBILIZADA E IMOBILIZADA DE REUSO

43. CONVERSÃO PERCENTUAL DA INVERTASE
LIVRE E IMOBILIZADA/REUSO
 Comportamento similar da livre e da imobilizada (35% de conversão após 135
minutos);
 Enzima de reuso teve perda de atividade.

44. REATOR EM CONTINUO (LEITO FIXO)

45. TESTE DE TRAÇADOR: VALORES DA
CONCENTRAÇÃO DO TRAÇADOR

46. TESTE DE TRAÇADOR
 Tempo Espacial: 21,09 min;
 Tempo de residência: 36,88 minutos;
 Diferença de 171% maior do tempo de residência em relação ao espacial;
 Há caminhos preferenciais;
 Refazer o preenchimento da coluna do reator de modo a deixá-la mais
uniforme em relação aos espaços entre os pellets.

47. RELAÇÕES DA CONVERSÃO (%) PELO TEMPO E
CONCENTRAÇÃO DE PRODUTO FORMADO PELO TEMPO.
 Após aproximadamente 40 minutos atingiu-se o estado estacionário no reator;
 Variáveis não se alteram mais.

48. CONCLUSÃO
 Imobilização da Invertase em Alginato de Cálcio aumenta a
estabilidade da enzima à mudanças de temperatura e pH;
 Imobilização causou perda significativa de atividade enzimática;
 Reatores não alcançaram seu potencial máximo de conversão;
 Enzimas de reuso perderam significativamente a atividade;
 Sanados os problemas de homogeneidade e formação de caminhos
preferenciais, a atividade nos dois processos (batelada e contínuo)
seria aumentada.