1. IMPACTO DE LAS FUENTES DE CARBONO Y LAS
CONDICIONES VARIABLES DE NITROGENO EN LA
BIOSINTESIS BACTERIANA DE POLIHIDROXIALCANOATOS
A PARTIR DE AGUAS DEL RIO PASTO
Burbano Paola1
, Mera Felipe1
, Riascos Edison1
, Rosales Esteban1
, Villaquiran Zulma1
., Revelo Romo Dolly2
.
1. Estudiantes facultad de Ingeniería Agroindustrial – Universidad de Nariño
2. Docente guía en este trabajo, profesora del departamento de Biología de la Universidad de Nariño
RESUMEN
Palabras Clave:
INTRODUCCIÓN
El uso de polímeros convencionales derivados del
petróleo origina enormes problemas de
contaminación ambiental, debido a que no son
materiales biodegradables, perduran en los rellenos
sanitarios como contaminantes durante largos
períodos de tiempo, bloqueando la circulación de
gases y líquidos e impidiendo la estabilización de la
materia orgánica. Dado que cualquier sustancia de
origen biológico puede ser degradada por
microorganismos presentes en el ambiente, el
reemplazo de dichos materiales por polímeros
biodegradables podría resolver los problemas de
contaminación mencionados.
Entre estos biopolímeros, la familia de
Polihidroxialcanoatos (PHAs) son los únicos
completamente sintetizados de forma biológica,
presentan altas tasas de biodegradabilidad, son
biocompatibles y tienen propiedades físico-
mecánicas comparables a las de los plásticos
convencionales producidos a partir de petroquímicos
(Chen, 2010), presentándose como los candidatos
ideales para reemplazar los polímeros sintéticos
(Barbosa at al, 2005).
Los PHAs son polímeros de ácidos R-
hidroxialcanóicos, son termoplásticos elastoméricos
(Sudesh et al., 2000), que son sintetizados por un gran
número de bacterias Gram positivas y Gram negativas
como material de almacenamiento de energía y
carbono intracelular. En muchos casos son
acumulados bajo condiciones de estrés como
limitación de nitrógeno, fósforo u oxígeno con exceso
de fuente de carbono.
Existen como inclusiones que son típicamente de 0,2
a 0,5 µm de diámetro localizadas en el citoplasma y
pueden visualizarse con un microscopio de contraste
de fases debido a su alta refractividad o pueden ser
teñidas con negro de sudan (Khanna & Srivastava,
2005). Estructuralmente estos polímeros son
clasificados de acuerdo al número de átomos de
carbono en un rango de 3 a 14 y el tipo de unidades
monoméricas, produciendo homopolímeros o
heteropolímeros (Keshavarz & Roy, 2010). PHAs con
3-5 átomos de carbono se considera un PHA de
cadena corta (PHASCL) y con 6 a 14 átomos de
carbono son llamados PHAs de cadena media
(PHAMCL) (Keshavarz & Roy, 2010;
Suriyamongkol et al., 2007; Ojumu et al., 2004).
Un número apreciable de PHAs con más de 150
monómeros ha sido identificado con masas
moleculares en el rango de 50.000 a 1’000.000 Da.,
por eso los PHAs y sus tecnologías asociadas forman
una cadena de valor industrial desde procesos de

2. fermentación, materiales, alimentos y energía hasta
los campos de la medicina debido a que estos son
biodegradables e inmunológicamente inertes
(Keshavarz & Roy, 2010).
La elección del microorganismo para la producción
industrial del biopolímero varía dependiendo de
factores como la habilidad celular para utilizar fuentes
de carbono no costosas, la velocidad de crecimiento,
la velocidad de síntesis del biopolímero, la calidad y
cantidad de PHA y el costo de los procesos de
recuperación (Lee & Choi, 2001). A nivel industrial
se emplean cepas como la Ralstonia eutropha,
Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii,
Pseudomonas oleovorans, Paracccus denitrificans,
Protomonas extorquens y E. coli recombinante (Lee,
1996).
MATERIALES Y MÉTODOS
Las muestras fueron recolectadas de aguas
contaminadas del rio Pasto, en el sector del puente del
polvorín (Barrio Pandiaco) se tomó una muestra
inicial de 500 ml en una botella de agua higienizada,
la cual se llevó de inmediato al laboratorio; se
procedió a tomar 1 ml de la muestra adicionándola a
10 ml de solución salina. Luego por el método de
dilución seriada se realiza la disolución en tubos de
ensayo con la misma cantidad de solución salina,
llegando a una dilución final de 10-6
.
PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
La preparación del medio de cultivo se realizó en dos
fases, en la primera de ellas se empleó un medio de
cultivo con glucosa como fuente de carbono y (NH)
2SO4 como fuente de nitrógeno, al medio de cultivo
con fuente de carbono y nitrógeno se lo denominó
Medio Mineral (MM) y al medio de cultivo con fuente
de carbono pero sin fuente de nitrógeno se le
denomino (MM-N); para evaluar el crecimiento de la
bacteria en condiciones desbalanceadas se empleó el
mismo medio exceptuando la fuente de nitrógeno.
Para la segunda fase se empleó el medio empleado en
la primera fase variando las fuentes de carbono
(Glucosa, Lactosa, Glicerol, Ácido Cítrico), además
se omitió la fuente de nitrógeno. La composición
detallada del medio fue tomada de Shahid y
colaboradores (2013), y se presenta a continuación:
Tabla 1. Composición de macronutrientes en un
medio de cultivo (MM) para la obtención de PHA’s
COMPUESTO CANTIDAD UNIDADES
KH2PO4 3.6 g/L
Na2HPO412H2O 14.4 g/L
MgSO47H2O 0.5 g/L
NaCl 0.015 g/L
CaCl22H2O 0.05 g/L
FeSO47H2O 0.009 g/L
(NH) 2SO4 3 g/L
Fuente de Carbono 5 g/L
Para los elementos traza se tomó 1 g/L de la solución,
la composición es la siguiente:
Tabla 2. Composición de micronutrientes en un
medio de cultivo (MM) para la obtención de PHA’s
COMPUESTO CANTIDAD UNIDADES
MnSO4H2O 1 g/L
CoCl26H2O 0.5 g/L
CuCl22H2O 0.2 g/L
ZnCl2 0.1 g/L
Na2MoO42H2O 40 mg/L
H3BO3 0.5 g/L
NiCl2 50 mg/L
El pH se ajustó a 7.4.
SELECCIÓN DE CULTIVO CON MEJOR
CRECIMIENTO
Para la determinación del mejor crecimiento, se tomó
8 aislamientos de diferentes cultivos los cuales se
conservaron a temperaturas de refrigeración, teniendo
en cuentas las reglas de asepsia se tomó una colonia
de cada aislamiento (71, 71*, 72, 74, 74*, 75. 75*,76)
en donde el símbolo * indica que para esos
aislamientos existía una réplica, se cultivaron los
aislamientos en MM (medio mineral) adaptado a este
trabajo de acuerdo a lo reportado anteriormente por
Shahid y colaboradores (2013). La siembra se llevó a
cabo por el método de siembra por agotamiento en
cajas Petri, cada cultivo se dejó a temperatura
ambiente durante 48 horas sin agitación, paso
continuo se seleccionaron los 4 cultivos que
evidenciaron un mejor crecimiento, para comprobar
la pureza de los cultivos se realizó tinción de Gram

3. tomando una colonia de los cultivos anteriores. La
tinción revelo que los nuevos cultivos se encontraban
en un estado puro y que poseían forma de bacilos.
Teniendo en cuenta los cultivos seleccionados, se
cultivaron colonias en MM-N (Medio mineral sin
nitrógeno) en las mismas condiciones trabajadas
anteriormente. Después de 48 horas se determinó que
el mejor crecimiento evidenciado en la adaptación al
medio desbalanceado se presentó para el cultivo del
aislamiento 75, manteniéndose el aislamiento a
refrigeración a temperatura de 4ºC.
PREPARACIÓN DEL INOCULO Y EL
REACTOR
Tomando la preparación del medio desbalanceado se
cambió la fuente de carbono original y se preparó 4
medios de cultivo con diferentes fuentes de carbono
(glucosa, lactosa, glicerol, ácido cítrico). Se tomó un
tubo ensayo de 10 ml y se añadió 9 ml del medio
preparado con cada fuente de carbono, cultivando una
colonia del medio seleccionado en cada uno, dejando
durante 5 días a temperatura ambiente, sin agitación.
Transcurrido el tiempo de crecimiento se preparó los
reactores donde se añadió el inoculo a 90 ml MM-N
en un Erlenmeyer de 250 ml, sin agitación, sin
aireación, empleando un sistema de cultivo batch.
OBTENCIÓN DE BIOMASA (MÉTODO
GRAVIMÉTRICO)
Para la determinación del cambio de biomasa, se tomó
1 ml de muestra de cada reactor y de depósito en un
tubo eppendorf, tomando el peso inicial, a las 48 horas
se tomó la muestra del peso final. Para conocer el
cambio de biomasa cuantitativo se empleó el método
gravimétrico donde se sometió cada muestra a un
proceso de separación mecánica (centrifugación) en
una centrifuga Marca de centrifuga a 8000 rpm
durante 15 min, se descartó el sobrenadante y se secó
hasta peso constante en una mufla a 60ºC durante 2
horas, al final se pesó cada eppendorf en una balanza
analítica marca Denver Instrument. APX-200 Max
OBTENCIÓN DEL PHA
Para conocer la cantidad de polihidroxialcanoato
producida se realizó un proceso de separación
mediante centrifugación con una posterior extracción,
en donde se tomó una muestra 20 ml de cada reactor
en un falcón de 50 ml, se realizó la separación del
material en una centrifuga *marca a 7800 rpm
durante 20 min, descartando el sobrenadante de cada
falcón, posteriormente se añadió 2ml de NaClO al 5%
y EDTA 10 mM , se colocó todas las muestras a 60ºC
durante 30 minutos en baño maría y se centrifugo a
7800 rpm durante 5 minutos, descartando el
sobrenadante, nuevamente se añadió 2 ml de agua
destilada y se llevó la muestra centrifugación en las
mismas condiciones, se descartó el sobrenadante y
añadió 2 ml de acetona, se procedió a centrifugar en
las mismas condiciones por último se descartó el
sobrenadante y se pesó el falcón con en una balanza
analítica Denver Instrument. APX-200 Max.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 1. Datos para la determinación de Biomasa por
el método gravimétrico
FUENTE DE
CARBONO
PESO
INICIAL (g)
PESO
FINAL (g)
DIFERENCIA
(g)
Lactosa 0,919 1,024 0,105
Glucosa 0,8975 1,0951 0,1976
Ác. Cítrico 0,945 1,107 0,162
Glicerol 1,0204 1,0997 0,0793
Después de realizados los procedimientos de
extracción mencionados anteriormente se encontró
que la única fuente de carbono sobre la cual se
evidencio precipitado que podría atribuirse a la
formación de PHA’s es la Glucosa, para la cual se
determinó la producción a partir de una muestra de 20
ml del medio de cultivo (reactor).
Tabla 2. Datos para la determinación de la
producción de PHA’s en Glucosa como fuente de
Carbono
GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO
PESO
INICIAL
(g)
PESO
FINAL (g)
DIFERENCIA
(g)
PRODUCCIÓN
PHA (g/L)
13,321 13,3526 0,0316 1,58

4. REFERENCIAS
Barbosa M, Espinosa A, Malagón D, Moreno N.
(2005). Producción de poli-B BB BB-hidroxibutirato
(PHB) por Ralstonia eutropha ATCC 17697.
Universitas Scientiarum, 45-54.
Chen G. (2010). Plastics from Bacteria Natural
Functions and Applications. Berlin: Springer.
Keshavarz, T, Roy, I. (2010).
Polyhydroxyalkanoates: bioplastics with a green
agenda. Current Opinion in Microbiology. 21–326.
Khanna S, Srivastava A. (2005). Recent advances in
microbial polyhidroxyalkanoates. Process
Biochemistry. 607-619.
Lee S. (1996). Plastic bacteria? Progress and
prospects for polyhydroxyalkanoate production in
bacteria. Trends Biotechnol, 14: 431-438.
Lee S, Choi J. (2001). Production of microbial
polyester by fermentation of recombinant
microorganisms. T. Scheper. Advances in
biochemical engineering/biotechnology. 71: 183-207.
Ojumu T, Yu J, Solomon B. (2004). Minireview
Production of Polyhydroxyalkanoates, a bacterial
biodegradable polymer. African Journal of
Biotechnology. 18- 24.
Shahid S, Mosrati R, Dedauphin J, Amiel C, Fontaine
P, Gillard J, Corroler D. 2013. Impact of carbon
source and variable nitrogen conditions on bacterial
biosynthesis of polyhydroxyalkanoates: Evidence of
an atypical metabolism in Bacillus megaterium DSM
509. Journal of Bioscience and Bioengineering. 16:
302- 308.
Sudesh K, Abe H, Doi Y. (2000). Synthesis, structure
and properties of polyhydroxyalkanoates: biological
polyesters. Progress in Polymer Science. 1503- 1555.
Suriyamongkol P, Weselake R, Narine S, Moloney
M. Shah, S. (2007). Biotechnological approaches for
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microorganisms and plants — A review.
Biotechnology Advances. 148-175.