Tema 12

Tema 12: ADN Recombinante
Nociones de ADN Recombinante
El campo de la genética cambió radicalmente en la década del `70 cuando los
investigadores desarrollaron procedimientos que permiten construir moléculas de ADN
recombinante y la clonación de las mismas (hacer muchas copias de estas).
La tecnología del ADN recombinante ha hecho posible la investigación de la estructura
y función de los genes, especialmente los eucarióticos que eran hasta el momento
inaccesibles. El clonamiento genera grandes cantidades de ADN puro, tales como genes,
los cuales pueden ser manipulados en varias maneras, incluyendo mapeo,
secuenciación, mutación y transformación celular. Por ejemplo: supongamos que
queremos estudiar el gen que codifica una proteína humana particular, para determinar
su secuencia de ADN y cómo su expresión esta regulada. Cada célula humana contiene
solamente dos copias de aquel gen, por lo tanto se requiere de un esfuerzo enorme para
lograr aislar suficientes copias del gen para el análisis. Por el contrario, un número
esencialmente ilimitado de copias puede ser producido por clonación.
La tecnología del ADN recombinante es un conjunto de técnicas moleculares usadas
para localizar, aislar, alterar y estudiar segmentos de ADN.
El uso de la tecnología del ADN Recombinante para manipular genes para el análisis
genético o para desarrollar productos u otras aplicaciones es llamado Ingeniería
Genética.
Técnicas Básicas del ADN recombinante
1. Métodos de obtención de fragmentos específicos de ADN que permitan el
análisis, aislamiento y manipulación de genes específicos.
2. Obtención de copias múltiples de fragmentos idénticos de ADN, como clonación
y PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
3. Localización e Identificación de fragmentos específicos de ADN o ARN, por
hibridación de Ácidos Nucleicos, esto permite por ejemplo estimar semejanzas
entre el origen de distintos organismos.
4. Secuenciación del ADN, lo que hace posible la lectura directa de la información
genética codificada.
5. Ingeniería Genética: mediante la cual se puede modificar una secuencia de ADN
para generar nuevas versiones de genes, que pueden ser introducidas en una
célula u organismo.
Para aislar un gen o porciones más pequeñas de ADN, la molécula de ADN debe ser
fragmentada. La ruptura puede ser mecánica (entonces la fragmentación es al azar), o
bien para obtener fragmentos específicos de ADN se utilizan otros métodos, dentro de
los cuales una herramienta importante son las enzimas de restricción sintetizadas por
ciertas bacterias. Otra herramienta utilizada, aislada de ciertos virus de ARN, es la
Transcriptasa Inversa.
Clonación de ADN
Para clonar ADN se deben seguir los siguientes pasos:
1. Aislamiento del ADN de un organismo.

2. Cortar el ADN en fragmentos con Enzimas de Restricción y unir cada
fragmento individual a un vector de clonación para obtener una molécula de
ADN recombinante. Un Vector de Clonación es una molécula de ADN
construida artificialmente, capaz de replicarse en un organismo hospedante,
como por ejemplo una bacteria o levadura.
3. Introducir (transformar) la molécula de ADN recombinante dentro de un
hospedador como Escherichia coli, levadura, una célula animal o vegetal.
La replicación del ADN Recombinante (clonación molecular) ocurre en la
célula del hospedante, produciendo muchas copias idénticas llamadas
clones. Como el organismo hospedante se reproduce, las moléculas de ADN
Recombinante pasan a toda la progenie, dando origen a una población
celular portando la secuencia clonada.
Enzimas de Restricción
Las Enzimas de Restricción fueron descubiertas en la década del `70 en varias especies
bacterianas incluyendo a E. coli. En estudios sobre bacteriófagos se encontró que los
virus que infectaban a una cepa de E. coli eran a veces incapaces de infectar a otra cepa
(ver Tema 11: Lisogenia). Esta restricción de la infección ocurre por la presencia en
ciertas especies bacterianas de enzimas de restricción que cortan el ADN extraño (viral)
antes de que pueda ser replicado o transcripto, es decir, protegen su ADN del ADN
extraño. La característica esencial de estas enzimas es que escinden el ADN solamente
en secuencias de nucleótidos específicas, conocidas como Secuencias de
Reconocimiento o Sitios de Restricción. Sin embargo estas enzimas cortan el ADN a
menos que este esté modificado por adición de un grupo metilo (CH3) a un residuo de
Adenina o Citosina en determinadas secuencias, de esta manera las bacterias protegen
su ADN mediante la adición de estos grupos metilo durante la replicación del ADN.
Una Enzima de Restricción o Endonucleasa de Restricción reconoce una secuencia
de pares de bases específica en el ADN, llamada Sitio de Restricción, y corta el ADN
dentro de la secuencia (lo que hace es hidrolizar los enlaces fosfodiéster de la molécula
de ADN). Todas las Enzimas de Restricción cortan el ADN entre el Carbono 3´ y la
mitad del Fósforo del enlace fosfodiéster, de tal manera que los fragmentos producidos
por la digestión con enzima de restricción tienen fosfato 5´ e hidroxilo 3´. Las enzimas
de restricción se usan para producir fragmentos de ADN para ser clonados; como así
también para analizar el posicionamiento de sitios de restricción en una pieza de ADN
clonado o en un segmento de ADN en el genoma.
Muchas enzimas de restricción son encontradas en bacterias, aunque también ha sido
encontrada una enzima de restricción en el alga verde Chlorella. Más de 400 enzimas
diferentes han sido aisladas, las mismas se nombran de acuerdo al organismo a partir del
cual fueron aisladas. Convencionalmente se utiliza un sistema de tres letras, las mismas
deben escribirse con letras itálicas o bien subrayadas, seguido por números romanos.
Algunas veces se adicionan letras para significar una cepa particular de bacteria a partir
de la cual fue obtenida la enzima.
Por ejemplo:
EcoRI: obtenida a partir de Escherichia coli cepa RY13, esta enzima corta el
ADN solamente en la secuencia GAATTC. Las células además de esta enzima,
sintetizan una enzima metiladora específica que añade el grupo metilo para
proteger su ADN. La enzima de restricción corta la cadena de ADN con algunos
nucleótidos de diferencia, dejando extremos pegajosos, los cuales pueden volver

a aparearse entre sí al formarse puentes de Hidrógeno entre bases
complementarias, la enzima ADN ligasa establece un nuevo enlace azúcar-
fosfato entre los extremos de cada cadena (este fragmento de ADN originado por
la enzima puede unirse con otro fragmento de ADN cortado por la misma
enzima, y que tenga los extremos pegajosos complementarios).
HindII: obtenida a partir de Haemophilus influenzae cepa Rd, esta enzima de
restricción corta el ADN del Fago T7 en 40 fragmentos específicos. Reconoce la
secuencia que va a cortar, la metilación para la protección ocurre justo en ese
sitio de corte. Corta ambas cadenas en el mismo punto, generando extremos
romos (poner dibujo).
Ambas enzimas poseen una secuencia con simetría rotacional (180º).
Muchos sitios de restricción tienen un eje de simetría a través del punto medio. Por
ejemplo: Bam HI la secuencia de bases de 5` a 3` sobre una cadena de ADN es la misma
secuencia de bases de 5` a 3` sobre la cadena de ADN complementaria. Entonces se
dice que la secuencia tiene “doble simetría rotacional”:
5`...GGATCC... 3`
3`...CCTAGG... 5`
Corte
Corte
5`...G
3`...CCTAG5`
Extremos
Pegagosos 5`
5`GATCC... 3`
G... 5`
Las enzimas de restricción más comúnmente usadas reconocen 4 pb (Hha I) o 6 pb (Eco
RI o Hind III), incluso algunas hasta 8 pb (Not I). Otras enzimas de restricción no
poseen un sitio de restricción simétrico en el centro. Por ejemplo Hinf I reconoce una
secuencia de 5 pb en el cual hay simetría en los dos pares de bases a un lado del centro,
pero el par de base central es asimétrico dentro de la secuencia.
Las enzimas de restricción cortan el ADN de diferentes formas. Algunas enzimas como
por ejemplo SmaI corta ambas cadenas de ADN entre las mismas dos pares de bases
para producir fragmentos de ADN con extremos romos. Otras enzimas como BamHI
hacen cortes sesgados en la secuencia del par de nucleótidos para producir fragmentos
de ADN con extremos pegajosos, tanto extremos sobrexpuestos 5`como BamHI o EcoRI
o con extremos 3`sobrexpuestos como PstI.
Las enzimas de restricción que producen extremos pegajosos son de particular valor en
clonación de ADN porque cada fragmento de ADN, generado al cortar una pieza de
ADN con la misma enzima de restricción, tiene la misma secuencia de bases en los dos
extremos sesgados. Como cada enzima de restricción corta el ADN en una secuencia
específica, el número de cortes que la enzima realiza en una molécula de ADN
particular depende del número de veces que el sitio de restricción aparece. Cuando
cortamos un número de copias del mismo genoma con una enzima de restricción
particular, el ADN es cortado en los sitios de restricción específicos de la enzima, los
cuales están distribuidos a través del genoma. Aunque esto produce millones de
fragmentos de diferentes tamaños, todos los ADNs cromosomales idénticos en el
genoma múltiple cortarán en secuencia de reconocimiento idénticas.

Actuación de las Enzimas de Restricción
T AA G A A T T C C C C A A T G C CGA
C C CT T T T T T TA A A A GG GGGG
A
T
G
Nucleótido de Adenina
Nucleótido de Timina
Nucleótido de Guanina
Nucleótido de CitosinaC
Enzima de Restricción Eco RI
Corte de Restricción
T AA G
A A T T C C C C A A T G C CGA
C
C C
T T T T
T T T
A A A
A GG GGGG
T AA G
C
C C
T T T T
T T T
A A A
A GG GGGG
Extremos Cohesivos
C CT T TA GG GGGG
Enzima de Restricción Hae III
C CT T TA GG GGGG
C CT T TA GG GGGG
A A T T C C C C A A T GGA
C CT T TAGGGG
C C
GG
Extremos Romos
Extremo Cohesivo Extremo Romo
AAA AAA TTT TTT CCC CCC CCC CCC AAA AAA TTT GGGGGGAAA
CCC CCCTTT TTT TTTAAAGGGGGGGGGGGG
Secuencia de Clonación
Vectores de Clonación y Clonación de ADN
Varios tipos de vectores son usados para clonar ADN. Estos difieren en sus propiedades
moleculares y en el tamaño máximo de ADN que cada uno puede clonar. Cada tipo de
vector ha sido específicamente construido en el laboratorio.
 Plásmidos: son elementos extracromosomales de las bacterias, que se replican
autónomamente dentro de la célula. Su ADN es circular y de doble cadena y porta
las secuencias requeridas para la replicación del plásmido (origen u ori), y para las
otras funciones del plásmido. Los vectores de clonación plasmídicos son derivados
de estos plásmidos. Por medio de Ingeniería Genética se logró que tengan
características útiles para clonación de ADN.

Citoplasma
Cromosoma
Plásmido
Bacteria
Un vector de clonación plasmídico de E. coli debe tener tres características:
Un ori (replicación autónoma)
Un marcador seleccionable dominante, el cual permite distinguir las células de
E. coli que portan dicho plásmido de aquellas que carecen del mismo.
Normalmente se trata de un gen de resistencia a antibióticos como por ejemplo:
ampiciclina o tetraciclina.
Un sitio de clonado único para la inserción de los fragmentos de ADN a ser
clonados. La clonación involucra el corte del plásmido en uno de los sitios
únicos con la enzima de restricción apropiada y la unión dentro aquel sitio de un
fragmento de ADN que ha sido cortado con la misma enzima. Un ejemplo es el
plásmido pUC19 que posee 2.686 pb y tiene las siguientes características que lo
convierten en útil para clonar ADN en E. coli:
1. Tiene un alto número de copias, aproximadamente 100 copias por célula,
entonces muchas copias de ADN pueden ser generadas rápidamente.
2. Tiene un marcador seleccionable de resistencia a Ampicilina.
3. Tiene un número de sitios de restricción único agrupados en una región
llamado sitio de clonación múltiple o Polilinker.
4. El Polilinker esta insertado dentro de parte del gen de la β-galactosidasa
de E. coli. La inserción fue construida por Ingeniería Genética de tal
manera que la β-galactosidasa es producida cuando pUC19 es
introducido dentro de una cepa mutante de E. coli lacZ-
que hace no
funcional a la β-galactosidasa. Entonces cuando una pieza de ADN es
clonado dentro del Polilinker, el marco de lectura de la β-galactosidasa
es interrumpido, con lo cual E. coli no puede producir β-galactosidasa. El
X-gal es incluido en el medio sobre el cual las bacterias fueron
plaqueadas, de tal manera que si la β-galactosidasa es producida por una
colonia, las colonias se tornarán azul, mientras que si no se produce β-
galactosidasa, las colonias serán blancas. Este simple test de selección
azul-blanco es usado para identificar colonias de E. coli conteniendo
pUC19 con ADN insertado debido a que ellas son blancas, en contraste
con las colonias azules que no contienen el inserto.
Los experimentos de clonación no siempre involucran cortar el vector y el ADN a
ser clonado con una sola enzima de restricción. En muchos casos se usan dos
enzimas de restricción, esto es para evitar la recircularización, debido a que los dos
extremos del ADN son incompatibles y no pueden ser unidos por la ADN ligasa.
Los vectores plasmídicos pueden aceptar fragmentos de 5 a 10 kb. Fragmentos
mayores transforman en inestables a los plásmidos y tienden a perder muchos de los
fragmentos clonados.

 Vectores Virales: los vectores virales son aquellos virus que permiten incorporar
genes de interés dentro de su genoma, ofreciendo muchas ventajas para clonación y
la posterior aplicación de los genes clonados. Como los virus infectan a las células
con una alta eficiencia, el gen clonado puede ser introducido dentro de una célula a
una frecuencia altamente significante que por simple transformación.
Algunos vectores virales son especialistas en producir altos niveles de proteínas
codificadas por los genes clonados. Otros vectores virales, tales como los basados en
M13, bacteriano, son diseñados para facilitar el secuenciamiento y la generación de
mutaciones en genes clonados. Los vectores derivados de Retrovirus (virus animal
de ARN de simple cadena que emplea un ADN de doble cadena como intermediario
para la replicación) puede efectuar la integración estable de ADN clonado dentro de
cromosomas de mamíferos, permitiendo la continua expresión del gen. Los vectores
virales también son vehículos de elección para estrategias de Terapia Génica.
 Fago Lambda (λ) es derivado del bacteriófago λ, que ha sido diseñado de tal
manera que el ciclo lítico sea posible pero el lisogénico no. Los vectores de
clonación λ linear poseen sitios de restricción útiles para clonar fragmentos de ADN
dentro de ellos. Uno de esos vectores, el vector de reemplazo lambda tiene un
cromosoma en el cual hay un brazo izquierdo y otro derecho que conjuntamente
tienen todos los genes esenciales para el ciclo lítico. Entre los dos brazos hay un
segmento de ADN que es “disponible” debido a que no contiene ningún gen
necesario para el ciclo lítico. Las uniones entre el segmento central disponible y los
dos brazos poseen un sitio de restricción EcoRI.
La clonación de un segmento de ADN usando un vector de reemplazo λ se realiza
de la siguiente manera: primero el vector es cortado con la enzima EcoRI para
separar los dos brazos del segmento reemplazable. Luego, fragmentos de ADN a ser
clonados son generados al digerir ADN de alto peso molecular de un organismo con
EcoRI. El ADN foráneo es mezclado con los fragmentos de ADN de λ y las piezas
son ligadas mediante una ADN ligasa.
El ADN ligado es mezclado in-vitro con las diferentes proteínas del fago λ,
resultando en la inserción del ADN dentro de la cabeza del fago y el ensamblaje de
partículas complejas. Este proceso es llamado Empaquetamiento. La cabeza del fago
puede acomodar fragmentos de ADN del orden de los 37 52 kb. Las partículas
ensambladas son usadas para infectar cultivos de E. coli. Solamente los fagos en los
cuales el ADN foráneo esta insertado entre el brazo izquierdo y el derecho podrán
replicarse porque solamente ellos contienen todos los genes necesarios para la
reproducción del fago. La clonación del fragmento de interés se produce por las
rondas repetidas de infección y lisis que cada fago funcional sufre en el cultivo. El
cultivo se convierte en transparente cuando todas las bacterias han sido lisadas,
alcanzando una concentración de 1010
a 1011
fagos/mL, con muchos representativos
de cada una de las moléculas de ADN recombinante original.
Al igual que los vectores plasmídicos, hay diferentes tipos de vectores de clonación
fágico. Las versiones más modernas tienen un gran número de sitios de restricción
para clonación. Algunos son diseñados para permitir la expresión de genes clonados
(vectores de expresión) y un desarrollo reciente permitió transferir el inserto de
ADN desde el fago a un plásmido, un proceso llamado subclonación.

Algunos fagos contienen moléculas de ADN de cadena simple, al infectar a una
bacteria, la cadena infectante simple es convertida en una forma replicativa de doble
cadena, con lo cual puede ser aislada y usada para clonación. La ventaja de usar
estos fagos como vectores de clonación es que el ADN de cadena simple es el
substrato requerido para la técnica de secuenciación de ADN de Sanger,
ampliamente utilizada en la actualidad.
 Cósmido: estos vectores son híbridos de fagos λ y plásmidos, y su ADN puede
replicarse tanto en bacterias, como un plásmido, o bien ser empaquetado como un
fago. Sin embargo, los cósmidos pueden portar insertos de ADN tres veces más
grandes a los portados por el propio fago λ (45 kb).
Un cósmido esta compuesto por una secuencia ori que permite su replicación en E.
coli, un marcador seleccionable dominante tal como ampR
y sitios de restricción
únicos para la inserción y clonación de fragmentos de ADN. Además los cósmidos
tienen un sitio cos que es derivado del fago λ. El sitio cos es el sitio en el cual copias
múltiples del genoma λ, reunidas en una pieza larga llamada Concatámero, son
reunidas dentro de una pieza de 48 kb para ser introducida dentro de la cabeza del
fago. El sitio cos permite el empaquetamiento del ADN dentro de una partícula de
fago λ que facilita la introducción de grandes moléculas de ADN dentro de una
bacteria. Esta propiedad esta ausente en los plásmidos.
Cósmido
Sitio cos
Amp
R
Sitio Clonación
Ori
Esquema de un Cósmido mostrando los sitios mencionadas en el texto.
Sitios cos lambda han sido clonados dentro de vectores plasmídicos para producir
cósmidos tan pequeños como de 5 kb. Cuando un fragmento de ADN de alrededor
de 32 a 47 kb es clonado dentro de tales cósmidos, la molécula de ADN
recombinante es del tamaño correcto para ser empaquetada dentro de la cabeza del
fago. El fago es entonces usado para introducir el cósmido recombinante dentro de
la célula de E. coli hospedante, donde éste se replica como lo hace un plásmido.
Cósmidos recombinantes pequeños (<37 kb) o grandes (>52 kb) no pueden ser
empaquetados. Esto es una desventaja cuando se quiere usar a estos como vectores.
Existen vectores que pueden ser introducidos dentro de dos o más organismos
hospedantes. Se denominan Vector Tansbordador (Shuttle vector). Por ejemplo: hay
vectores transbordadores que pueden ser transformados dentro y replicado en E. coli
(seleccionado por tener un marcador nutricional, tal como el gen URA 3 que
confiere crecimiento independiente de Uracilo sobre una célula de levadura mutante
ura3). Diferentes tipos de vectores transbordadores levadura-E. coli han sido
desarrollados, algunos de los cuales replican y otros no. Estos últimos vectores se

integran dentro del cromosoma de las células hospedante y son replicados cuando
aquel cromosoma replica.
 Cromosomas Artificiales de Levadura (YACs)
Son vectores de clonación que permiten que cromosomas artificiales sean fabricados
y clonados en levaduras. Los YACs son vectores lineales que tienen la siguiente
característica:
TEL TRP 1 ARS CEN
Sitio de Restricción
para clonación
URA 3 TEL
Brazo Izquierdo Brazo Derecho
1. Un Telómero de levadura (TEL) en cada extremo.
2. Un Centrómero de levadura (CEN).
3. Un marcador seleccionable sobre cada brazo para detectar el plásmido en
levadura (ejemplo: TRP 1 y URA 3 para independencia de Triptófano y Uracilo
en razas mutantes trp 1 y ura 3 respectivamente).
4. Un origen de replicación ARS (secuencia replicante autónoma) que permite que
el vector se replique en la levadura.
5. Sitios de restricción únicos a el YAC, que pueden ser usados para insertar ADN
foráneo.
Los YACs pueden usarse para clonar grandes fragmentos de ADN de hasta 500 kb.
Se usan para crear mapas físicos de genomas grandes como el humano. Los clones
YAC son construidos por ligamiento de fragmentos de ADN de muy alto peso
molecular a los brazos del YAC generados por digestión con enzimas de restricción
en el sitio de clonación. Los clones son introducidos dentro de la levadura por
transformación, por selección para ambos TRP 1 y URA 3, asegurándose que el clon
tenga tanto el brazo izquierdo como el derecho del vector YAC.
 Cromosomas Artificiales de Bacteria (BACs)
Estos son útiles para clonar fragmentos de hasta 200 kb en E. coli. Los BACs son
vectores que contienen un origen de replicación de un plásmido natural llamado el
“Factor F”, un sitio de clonación múltiple, y un marcador seleccionable y otras
características. Aunque los YACs pueden admitir fragmentos más largos que los
BACs, estos últimos tienen la ventaja que pueden ser manipulados como plásmidos
bacterianos normales. Una vez transformada E. coli, el Factor F mantiene el número
de copias del plásmido en uno por célula.
Biblioteca de ADN Recombinante
En general los investigadores quieren estudiar un gen particular o fragmento de
ADN. Cuando el ADN genómico es aislado del organismo y cortado con enzimas de
restricción, y la población de fragmentos de ADN es clonado en un vector, se

obtiene una Biblioteca Genómica, una colección de clones conteniendo por lo
menos una copia de cada una de las secuencias de ADN en el genoma.
Las bibliotecas genómicas han sido construidas para muchos organismos,
incluyendo los humanos a través del Proyecto Genoma Humano y muchos virus.
Relacionado con las bibliotecas genómicas, están las Bibliotecas Cromosómicas,
estas son colecciones de clones de fragmentos de ADN complementario (cDNA), las
cuales son colecciones de clones de ADN copias de mARNs aislados de células.
Bibliotecas Genómicas
Una biblioteca genómica es una colección de clones que contiene por lo menos una
copia de cada secuencia de ADN del genoma en estudio. Las bibliotecas genómicas
pueden ser usadas para aislar y estudiar un clon particular relacionado con un gen de
interés. Las bibliotecas genómicas son construidas usando los mismos
procedimientos de clonación que ya han sido descriptos.
Se utiliza una enzima de restricción para cortar el ADN genómico, se elige un vector
que permita que el genoma este representado en un número manejable de clones.
Hay tres procedimientos generales para producir bibliotecas genómicas:
1. El ADN genómico es digerido completamente con una enzima de
restricción, y los fragmentos de ADN resultantes son clonados en vectores de
clonación. Un inconveniente de esta técnica es que si el gen específico que
queremos estudiar, contiene uno o más sitios de restricción para la enzima, el
gen será dividido en dos o más fragmento, cuando el ADN sea digerido con
la enzima de restricción. Como resultado el gen sería clonado en dos o más
piezas. Otro inconveniente es que el tamaño promedio de los fragmentos
producidos por digestión de ADN eucariótico con enzimas de restricción es
pequeño (alrededor de 4 kb para enzimas de restricción de 6 pb). La mayoría
de los genes tienen un tamaño de más de 4 kb, especialmente en los
mamíferos. Por otro lado una biblioteca genómica entera debería contener un
gran número de moléculas de ADN recombinante, y la selección de un gen
específico sería muy laboriosa.
2. Los problemas de la división de genes en fragmentos y el gran número de
moléculas de ADN recombinante, puede ser minimizado clonando
fragmentos de ADN más grandes en un vector apropiado. Los fragmentos de
ADN más grandes pueden ser generados al agitar mecánicamente ADN de
alto peso molecular (usualmente 100 a 150 kb). Por ejemplo: el ADN puede
ser pasado a través de una aguja de jeringa para producir una población de
fragmentos de ADN superpuestos de gran tamaño. Sin embargo, debido a
que los extremos de los fragmentos resultantes no han sido generados por
enzimas de restricción, es necesario la manipulación enzimática adicional
para agregar extremos apropiados para su inserción en los vectores.
3. Otro método para generar fragmentos de ADN de tamaño apropiado es
realizando una digestión parcial del ADN con enzimas de restricción, que
reconocen frecuentemente 4 pb. La digestión parcial significa que solamente
una porción de los sitios de restricción disponibles son cortados por la
enzima de restricción. Esto se logra limitando la cantidad de enzima o el
tiempo de incubación. El resultado ideal de la digestión parcial es una
población de fragmentos superpuestos que representen el genoma entero. La
centrifugación en gradiente de sacarosa o electroforesis en gel de agarosa
son utilizadas para colectar fragmentos del tamaño deseado para clonación.

Estos fragmentos pueden ser clonados directamente porque los extremos de
los fragmentos fueron producidos por la digestión con enzimas de
restricción.
El número de clones necesarios para incluir todas las secuencias del genoma,
depende del tamaño del genoma a ser clonado, y del tamaño promedio de los
fragmentos de ADN insertados en el vector. La probabilidad de tener por lo
menos una copia de cualquier secuencia de ADN en la biblioteca genómica,
puede ser calculada por la fórmula:
N = ln (1-P)
ln (1-f )
N = número necesario de moléculas de ADN recombinante
P = probabilidad deseable
f = es la proporción fraccionable del genoma en una molécula de ADN
recombinante simple (f es el tamaño promedio en kb de los fragmentos usados para
hacer la biblioteca dividido el tamaño del genoma en kb).
ln = logaritmo natural
Por ejemplo: para un 99% de probabilidad que un fragmento de ADN de levadura
esté representado en una biblioteca de fragmento de 15 kb en una biblioteca
genómica basada en un vector lambda, donde el tamaño del genoma de levadura es
de alrededor de 12.000 kb, se necesitarían 3682 moléculas de ADN recombinante.
Para el genoma humano de tamaño aproximado de 3.000.000 kb, se necesitarán más
de 920.000 clones, por lo tanto en estos casos se utilizan vectores YACs o BACs.
Bibliotecas de cADN
El ADN complementario puede ser fabricado a partir de moléculas de mARN
presentes en una población de células eucariota en un momento particular. Estas
moléculas de mARN pueden ser clonadas para producir una biblioteca de cADN. La
biblioteca de cADN refleja la actividad génica del tipo celular en el momento que el
mARN es aislado. La construcción y análisis de las bibliotecas de cADN son útiles
por ejemplo para comparar actividades génicas en diferentes tipos celulares del
mismo organismo, o del mismo tipo celular en diferentes momentos, como en la
diferenciación celular durante el desarrollo.
Los clones en la biblioteca de cADN representan a los mARNs maduros
encontrados en la célula. En los organismos eucariontes los mARNs maduros son
moléculas procesadas, por lo que las secuencias obtenidas no son equivalentes a los
genes clonados. En particular los Intrones están presentes en los clones génicos,
pero no en los clones de cADN.
Para cualquier mARN los clones de cADN pueden ser útiles para luego aislar el gen
que codifica aquel mARN. El clon génico puede suministrar más información que el
cADN, por ejemplo: por la presencia y el ordenamiento de Intrones, y sobre la
secuencia reguladora que controla la expresión del gen.
Las bibliotecas de cADN son fácilmente construidas a partir de mARNs, debido a
que los mARN contienen una cola poly A que los diferencia del resto de los ARNs.
Estos mARNs poly A+ pueden ser purificados de una mezcla de ARNs celular, al
pasar las moléculas de ARN por una columna en la cual cortas cadenas de Ácido

Deoxitimidílico, llamado cadena oligo (dT), han sido adheridos. Cuando las
moléculas de ARN pasan a través de la columna, las colas poly A de las moléculas
de mARN se aparean con la cadena poly dT, por lo tanto los mARNs son capturados
sobre la columna, mientras que los otros ARNs pasan a través de la misma. Los
mARNs son liberados y colectados. Por ejemplo: disminuyendo la fuerza iónica del
buffer que pasa a través de la columna, de tal manera que los enlaces hidrógeno se
interrumpan. Este método permite un enriquecimiento significativo de mARNs poly
A+ en una población mezcla de ARN de alrededor del 50% sobre el 3% en la célula.
Para sintetizar cADN el primer paso consiste en el pegado de un primer corto
denominado Oligo (dT) a la cola poly A. El primer se extiende por medio de la
enzima Transcriptasa inversa (polimerasa de ADN dependiente de ARN) para hacer
una copia de ADN de la cadena de mARN. El resultado es una molécula de doble
cadena de mARN-ADN. Luego las enzimas RNasa H (un tipo de ribonucleasa),
ADN polimerasa I y ADN ligasa son usadas para sintetizar la segunda cadena de
ADN. La RNasa H degrada la cadena de ARN en el híbrido mARN-ADN, la ADN
polimerasa I fabrica nuevos fragmentos de ADN usando los fragmentos de ARN
parcialmente degradados como primers, y finalmente la ADN ligasa une los nuevos
fragmentos de ADN para hacer una cadena completa. El resultado es una molécula
de cADN de doble cadena que es una copia fiel del mARN del que proviene.
Para clonar las moléculas de cADN usando un ligador (linker), al sitio de
restricción, el cual es una fragmento de ADN corto de doble cadena compuesto de 8
a 12 pares de nucleótidos de longitud que incluye un sitio de restricción en el
ejemplo Bam HI. Tanto la molécula de cADN como el linker tienen extremos romos
y ellos pueden ser ligados juntos a una alta concentración de T4ADN ligasa. Los
extremos pegajosos son producidos en la molécula de cADN al cortar el cADN con
Bam HI. El ADN resultante es insertado dentro de un vector de clonación que ha
sido cortado con BamHI y la molécula de ADN recombinante se utiliza para
transformar células de E. coli para la clonación.
Un problema que se presenta al usar Linkers para clonar cADN, es que puede haber
un sitio de restricción dentro del cADN para la enzima usada para cortar los linkers,
con lo cual significaría que el cADN debería también ser cortado cuando se cortan
los linkers, resultando la división del cADN en fragmentos. Este problema se puede
resolver agregando un Adaptador al cADN, que ya tiene un extremo pegajoso
adecuado para clonación, de tal manera que el cADN nunca será digerido con la
enzima de restricción.

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