2. طی بازدید از مزارع آفتابگردان استانهای آذربايجان غربی، اصفهان، تهران، قم،
مرکزی و همدان در طی دو فصل زراعی ٧ 8-٦ 8 انجام گرفت، علئم آلودگی به
صورت کلروز و نکروز برگی، بدشکلی در رگبرگ ها و برگ ها و کوتولگی عنونی
بوته در مزارع آفتابگردان دیده شد.)شکل (از تعداد ٠٢ 5 نمونه جمع آوری شده با
استفادهی یازی یروشهایی TAS , DAS-ELISAی)شکلی ٥ 1 ( یتعدادی ٤٢١ ینمونه یآلوده
TSVو ٥٣ نمونه به TSWVتشخیص داده شدند.
تعداد نمونه آلوده تعداد نمونه آلوده به
تعداد نمونه كل مناطق نمونه برداري
به TSWV TSV
٤ ١٣ ٥٥ استان آذربايجان غربی
٢١ ٢١ ٥٣١ استان اصفهان
٥ ٧٣ ٠٣١ استان تهران
٠ ٨ ٥٥ استان قم
٠ ٠ ٠٣ استان مرکزی
٤١ ٦٣ ٥١١ استان همدان
٥٣ ٤٢١ ٠٢ 5 جمع كل
جدول 4-1 تعداد نمونه ها و محلهاي جمع آوري آنها
از میان آنتي سرمهاي مورد آزمايش تنها دو ویروس TSWVو TSVتوسط آزمون
الیزا از نمونه های مختلف شناسايي شدند. نتایج بدست آمده از آزمایشات فوق
3. حاکی از وجود میزان بالی آلودگی مزارع آفتابگردان به ویروس رگه ای توتون و
ویروس ّّپژمردگی خالدار گوجه فرنگی می باشد. این نتایج همچنین نشان داد که
استانی یآذربایجانی یغربیی ٦٥/٦٣ یدرصدی یآلودگی،ی یاستانی یهمدانی یبای ١٣/٠٣ یدرصد
آلودگی، استان تهران با ٦٢/٢٤ درصد آلودگی، استان قم با ٤١/٤٥ درصد آلودگی،
استانی یاصفهانی یبای ٨/8 یدرصدی یآلودگیی یوی یاستانی یمرکزیی یبدونی یآلودگیی ی یبترتیب
بیشترین و کمترین میزان آلودگی به ویروس TSVو استان همدان با ٢١/٧١ درصد
آلودگی، استان اصفهان بای ٨/8 یدرصد آلودگی، استان آذربایجان غربیی ٧/٢ یدرصد
آلودگی،ی یاستانی یتهرانی یبای ٣/٨ یدرصدی یآلودگیی یوی یاستانی یهایی یقمی یوی یمرکزیی یبدون
آلودگی بترتیب بیشترین و کمترین میزان آلودگی به ویروس TSWVرا دارا بودند.
2-4- آزمون TAS , DAS-ELISA
نمونه های آلوده به TSVبا آنتی سرم چند همسانه ای TSVتست شدند و نمونه های
آلوده به TSWVبا آنتی سرم چند همسانه ای و تک همسانه ای ) TSWVتهیه
شدهه دره موسسهه DSMZآلمانی ی(ی یتستی یشدند.ی ینمونهی یهايیی یکهی یجذبشانی یتوسط
دستگاهی ELISA- Readerیاز دوبرابر ميانگين جذب نمونه های منفی بيشتر بود
مثبت در نظر گرفته شدند.
4. ٤-٣- تعيين دامنه میزبانی
٤-٣-١- دامنه میزبانی ويروس :TSV
سلمه Chnopodium quinoa
علئم به صورت لکه های موضعی کلروتيک مشاهده گرديد.
سلمه C.amaranticolor
لکه های موضعی کلروتيک
باقل ) (Vicia. faba
لکه های کلروتيک ، پیچیدگی و باريک شدن برگها و در نهايت زردی بوته .
آفتابگردان Helianthus annuus
قاشقی شدن برگها به سمت پایین، تورم رگبرگی.
لوبيا چشم بلبلی Vigna ungu
لکه های موضعی کلروتيک
5. گل تکمه ای G. globosa
بدشکلی برگ و جمع شدن لبه برگها در قسمت رگبرگ اصلی.
توتون N.benthamiana
در اين گياه آلودگی پنهان رخ داد يعنی گياه آلوده فاقد علئم ظاهری بود.
٤-٣-٢- دامنه میزبانی :TSWV
سلمه C.amaranticolor
لکه های موضعی کلروزه و نکروزه.
اطلسی Petunia hybrida
علئم موزاييک خفيف و بدشکلی برگ
باقل ) (V. faba
علئم بدشکلی و باريک شدن شديد برگها.
6. توتون N.rustica
هيچ گونه علئمی در اثر تلقيح ظاهر نگرديد.
آفتابگردان Helianthus annuus
پیچیدگی برگها .
ساير گياهان محک شامل لوبيا چشم بلبلی ، گل هميشه بهار، سلمه C.quinoaو
به نسبت اين ویروس واکنش نشان ندادند.
در تمام موارد بال نتايج انتقال با انجام آزمون الیزا تایید شد.
4-٤-الکتروفورز پروتئینها SDS-PAGEو وسترن بلت
باند پوشش پروتئینیی TSVیدر الکتروفورز پروتئینها به روشی SDS-PAGEیدر ژل
پلی اکریل آمید و آزمون وسترن بلت دارای وزنی مشابه و برابر با 43 کیلو دالتون
بود. )شکل های ١ 2،٠٢ و ٢٢(.
7. ٤-٥- استخراج RNAکل
استخراج RNAویروس TSVو TSWVاز گیاهان آلوده به ویروس با استفاده از
کیتی RNeasyی)شرکتی یکیاژنی ی(ی یانجامی یشد.ی یدری یارزیابیی RNAیاستخراجی یشدهی یبه
وسیلهی یالکتروفورزی یافقی،ی یباندهایی یاسیدی ینوکلئیکی یبری یرویی یژلی یآگارزی یبهی یخوبی
مشخص بودند. در نتیجه اینی RNAیهای استخراج شده برای انجام آزمونی -RT
PCRمناسب تشخیص داده شدند.
4-٦-آزمون RT-PCR
در این آزمون با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی TSVقطعه ای به طول
٠ 07 یجفت باز تکثیر شد و همچنین با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی
TSWVقطعه ای به طول ٠٠٩ جفت باز تکثیر شد.
گیاهان آلوده به ویروس TSVدر آزمون IC-RT-PCRنیز به کار رفتند، با استفاده
از همان آغازگرهای ذکر شده در این آزمون هم قطعه ای به طول ٠٠٧ جفت باز
تکثیر گردید. بر روی ژل آگارز 1% باندهای ٠٠٧ و 0 ٠ 9 جفت بازی مشاهده گردید
شکل )32(.
8. 21-4-تعیین ترادف نوكلئوتیدي قطعه تكثیر شده از پوشش پروتئنی TSV
نتایجی یحاصلی یازی یمقايسهی یترادفی ینوكلئوتيديی یقطعهی یتكثيری یشدهی یازی پوششه پروتئنی
محصول PCRویروس TSVبا ساير جدايه هاي موجود در بانك ژن نشان دهنده
58/4 % تشابه بود.
