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Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140134
A R T I C L E O R I G I N A L
Résumé :
Objectif : Cette étude consiste à évaluer la sensibilité in vitro des souches de Staphylococcus
aureus communautaires à Casablanca, et à définir la prévalence et la caractérisation
moléculaire des souches résistantes à la méthicilline.
Patients et méthodes : Dans ce but, 158 souches bactériennes ont été récoltées entre Janvier
2007 et Décembre 2008, de 15 laboratoires de biologie médicale à Casablanca. La sensibilité
des souches a été déterminée en utilisant la méthode de diffusion en milieu gélosé Mueller-
Hinton. La recherche du gène mecA a été réalisée sur toute souche exprimant un bas niveau de
sensibilité à la céfoxitine. Le typage du gène régulateur agr (accessory gene regulator) et de
la cassette chromosomique SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec) a été effectué
sur les souches mecA positives.
Résultats : Les résultats obtenus montrent un total de 31 différents profils de résistance. Douze
souches (7,6%) étaient phénotypiquement résistantes à la céfoxitine, cinq (3,2%) parmi elles
étaient des souches « Borderline Resistant S. aureus » (BORSA) et seulement 3 (1,9%)
possédaient le gène mecA avec un agr de type 1, dont deux avec un SCCmec de type III mercury
négative et une avec un SCCmec de type I.
Conclusion : Les souches de S. aureus communautaires à Casablanca montrent une diversité
des profils de résistance, avec seulement 1,9% des souches qui étaient résistantes à la
méthicilline par la présence du gène mecA.
Mots clés : Communautaire, résistance, antibiotiques, méthicilline, Staphylococcus aureus.
Key words : Community, resistance, antibiotics, methicillin, Staphylococcus aureus
Abstract:
Objective : The aim of the present study was to make an update on the susceptibility of
Staphylococcus aureus in Casablanca, and therefore to define the prevalence and the
characterization of methicillin-resistant strain.
Materials and methods : Clinical Staphylococcus aureus isolates were collected from patients
at the Institute Pasteur of Morocco and from 14 private laboratories located in Casablanca,
from January 2007 to December 2008. Susceptibility testing was performed by the disk
diffusion method on Mueller-Hinton agar plates. Strains expressed phenotypic resistance to
cefoxitin confirmed by polymerase chain reaction detection of the mecA gene, typing of the
accessory gene regulator “agr” and the Staphylococcal Cassette Chromosome “SCCmec” has
been made for mecA positive strains.
Results : The results showed 31 different resistance patterns. On the other hand, among twelve
strains (7.6%) which have a low susceptibility to cefoxitin, five (3.2%) isolates were Borderline
Resistant Staphylococcus aureus “BORSA” and only three (1.9% ) had the mecA gene with an
agr type 1. Two of the three MRSA were with type III SCCmec mercury negative and the other
with type I SCCmec.
Conclusion : The community strains of Staphylococcus aureus circulating in Casablanca had
a diversity of their resistance pattern. Only 1.9% of strains were resistant to methicillin by the
presence of mecA gene.
SENSIBILITÉ AUX ANTIBIOTIQUES DES SOUCHES DE
STAPHYLOCOCCUS AUREUS COMMUNAUTAIRES À CASABLANCA
(MAROC).
ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS
IN THE COMMUNITY OF CASABLANCA (MOROCCO).
M. Elazhari1,2*, K. Zerouali3,
D. Elhabchi4, N. Cohen4, A. El malki1,
N. Dersi1, M. Hassar1, M. Timinouni5,
R. Saile2.
1- Laboratoire de Bactériologie Médicale, Centre de Biologie Médicale, Institut
Pasteur du Maroc. Casablanca.Maroc
2- Département de Biologie, Faculté des Sciences Ben M'Sik,Université Hassan
II, UFR Biologie et Santé. Casablanca.Maroc
3- Laboratoire de Bactériologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie,Université
Hassan II, Rue Tarik Bnou Zyad, Casablanca.Maroc
4- Laboratoire de Bactériologie, Département de sécurité des aliments et
d’environnement, Institut Pasteur du Maroc. Casablanca.Maroc
5- Laboratoire de Bactériologie Moléculaire, Département de recherche, Institut
Pasteur du Maroc. Casablanca.Maroc
Correspondance :
Mohamed Elazhari
Laboratoire de Bactériologie Médicale.
Centre de Biologie Médicale - Institut
Pasteur. 1, place Louis Pasteur. 20360
Casablanca - Maroc.
Email : mohamed.elazhari@pasteur.ma
INTRODUCTION
Staphylococcus aureus, est une bactérie ubiquitaire que l’on
retrouve fréquemment sur la peau et dans les narines des
personnes. C’est l’un des principaux agents étiologiques des
infections suppuratives superficielles et profondes ainsi que
des syndromes liés à l’action des toxines. Il est doué d’une
grande capacité d’acquérir et d’exprimer un large éventuel de
facteurs de virulence et de résistance aux antibiotiques [1, 2].
Au moment de l'introduction de la pénicilline en usage clinique
au début des années quarante, S. aureus était sensible à son
action. En 1950, la première souche résistante à cet antibiotique
a été décrite. De nouvelles molécules semi-synthétiques anti-
staphylococciques furent alors commercialisées, et deux ans
après l'introduction de la méthicilline (pénicilline semi-
synthétique) en 1959, les premières souches résistantes à la
pénicilline M (méthicilline) ont été rapportées [3, 4, 5]. En fait,
cette résistance est acquise par l'insertion dans le chromosome
bactérien d'un élément génétique mobile appelé SCCmec
(Staphylococcal Cassette Chromosome mec) abritant le gène
mecA [6, 7]. Le produit majeur de cet élément est une enzyme
nommée protéine de liaison à la pénicilline additionnelle
(PLP2a ou PLP2'), caractérisée par une faible affinité pour les
ß-lactamines, par opposition aux autres PLP (au nombre de 4)
impliquées dans la biosynthèse du peptidoglycane. Le SCCmec
véhicule aussi une paire de gènes appelés (cassette
chromosomal recombinase genes A and B « ccrAB ou ccrA et
ccrB ») qui codent pour des recombinases A et B. Ces dernières
sont capables de mobiliser cet élément génétique [8].
Récemment, six grands types de SCCmec (de I à VI) ont été
définis, par combinaison du type de recombinases (5 hallotypes
ont été rapportés) et de la classe du complexe du gène mecA (4
classes ont été décrites) [9] ; trois parmi eux (I, II et III) sont
typiquement retrouvés dans les souches d'origine hospitalière.
Le SCCmec de type V a été rapporté dans certaines souches
communautaires, et celui du type IV a été trouvé chez les deux
types de souches [10, 11, 12].
A côté du S. aureus producteur de PLP2a, il existe des souches
ne possédant pas le gène mecA, tout en exprimant un bas
niveau de résistance à la méthicilline, ces souches sont soit
hyperproductrices de ß-lactamase (souches BORSA pour
Borderline Resistant S.aureus), soit expriment des PLP altérées
(souches MODSA pour Modified Penicillin-Binding S. aureus)
[13, 14].
Au cours de ces dernières années, les S. aureus résistants à la
méthicilline (SARM) sont devenus des agents pathogènes qui
circulent dans la communauté [15, 16, 17, 18].
Ils sont, contrairement aux souches nosocomiales, plus
sensibles à la plupart des antibiotiques, hormis les béta-
lactamines [19]. Il a été rapporté que dans certaines régions, ces
souches étaient plus répandues que les S. aureus sensibles à la
méthicilline (SASM) [20]. Plus encore, elles ont tendance a
être plus virulentes que les SARM hospitaliers [21].
A Casablanca, ville Marocaine de plus de 3 millions
d’habitants, les données concernant la sensibilité aux
antibiotiques de S. aureus communautaire sont rares, nous
évaluons donc dans ce travail, premier de son genre au Maroc,
la résistance de ce pathogène vis-à-vis de 16 molécules
d’antibiotiques et nous déterminons la prévalence et la
caractérisation moléculaire des SARM communautaires
(SARM-C) pourvus du gène mecA.
MATERIELS ET METHODES
2.1. Récolte des souches bactériennes : La totalité des
souches de S. aureus, objet de notre travail, a été récoltée entre
le début du mois de Janvier 2007 et la fin du mois de Décembre
2008, à partir de 15 laboratoires de biologie médicale situés à
Casablanca. Les bactéries ont été récupérées sur des géloses de
conservation en tube, accompagnées de renseignements
cliniques : l’âge et le sexe du patient, l’hospitalisation ou non
durant les 12 derniers mois et le site d’isolement. Chaque
souche a été remise en culture sur une gélose Mueller-Hinton
(MH) au sang, et incubée à 36°C en atmosphère ambiante
pendant 18 à 24 heures.
2.2. Identification bactérienne : Cette identification a été
basée sur les critères suivants : l’état frais, la coloration de
Gram, la recherche de catalase, la fermentation du mannitol, les
tests d’agglutination (Pastorex staph « Bio-Rad, France » et/ou
Slidex staph « BioMérieux, France ») et le test de coagulation
du plasma de lapin. Les souches identifiées ont été conservées
en gélose profonde à température ambiante et en cryobilles à -
20°C.
2.3. Sensibilité aux antibiotiques : La résistance aux
antibiotiques a été déterminée par la méthode de diffusion de
disques (Bio-Rad, France), en milieu gélosé MH (Bio-Rad,
France) selon les recommandations décrites par le CA-SFM,
2007 (Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de
Microbiologie). Un inoculum de 106
UFC/ml a été préparé pour
chaque souche bactérienne et le milieu MH a été ensemencé
par écouvillonnage ; après 18-24 heures d’incubation à 36°C en
atmosphère ambiante, la lecture et l’interprétation des
antibiogrammes ont été faites par le logiciel «OSIRIS®»
évolution software (Bio-Rad).
Les 16 antibiotiques testés sont : Pénicilline G (PG-6µg),
Kanamycine (K-30UI), Tobramycine (Tm-10µg), Gentamicine
(Gm-15µg), Tétracycline (Te-30UI), Erythromycine (E-15UI),
Lincomycine (L-15µg), Pristinamycine (PT-15µg),
Chloramphénicol (C-30µg), Péfloxacine (Pef-5µg),
Fosfomycine (Fos-5µg), Céfoxitine (Fox-30µg), Acide
fusidique (FA-10µg), Rifampicine (RF-30µg), Vancomycine
(VA-30µg) et Triméthoprime-sulfaméthoxazole
(Cotrimoxazole) (SXT- 1,25/23,75µg) .
La recherche de la résistance à la méthicilline a été effectuée
par la méthode de diffusion du disque de céfoxitine. Un
diamètre d’inhibition autour du disque de moins de 27 mm
témoigne de la suspicion de la présence d’un SARM. La
détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
de la céfoxitine a été réalisée par les bandelettes E-test (AB
Biodisk, Solna, Suède) sur gélose MH avec un inoculum de 106
UFC/ml selon les recommandations décrites par le CA-SFM.
La mise en évidence du gène responsable de cette résistance
(gène mecA) a été réalisée par PCR. Et, toute souche exprimant
une sensibilité réduite vis-à-vis de la céfoxitine et confirmée
défectueuse en gène mecA serait soumise à l’action de 4 autres
bêtalactamines (amoxicilline, amoxicilline+acide clavulanique,
céfalotine et ceftazidine).
Le contrôle de qualité de l’antibiogramme a été réalisé à l’aide
de S. aureus ATTC 25923 tout au long de ce travail.
2.4. Extraction d’ADN bactérien : L’ADN de chaque souche
suspectée SARM a été extrait selon le protocole standard [22].
L'ADN récolté était ensuite précipité, quantifié par
électrophorèse sur gel d'agarose ; puis conservé à -20°C.
2.5. Recherche des gènes mecA et nuc par PCR : Une PCR
duplex pour la recherche simultanée d’un fragment de 309
paires de bases (pb) spécifique au gène mecA, et d’un autre
Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140 135
M ELAZHARI et al.
Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140136
Sensibilité aux antibiotiques des souches de Staphylococcus aureus
fragment de 218 pb du gène nuc codant pour la nucléase
spécifique du S. aureus a été réalisée en utilisant les amorces
déjà décrites [23, 24].
Deux souches de références de l’unité des agents antibactériens
de l’institut Pasteur à Paris (France) : U2A1593 (S. aureus,
résistant à la méthicilline, mecA positive) et U2A1594 (S.
aureus, sensible à la méthicilline, mecA négative) ont été
utilisées comme témoins.
2.6. Typage moléculaire du gène agr «accessory gene
regulator» par PCR multiplex : Une PCR multiplex pour la
recherche du type d’agr a été effectuée, pour tout S. aureus
produisant une PLP2a, selon le protocole décrit par Gilot et al.
[25] ; les ADN chromosomiques de quatre souches de S. aureus
« A92 0242 CCM 5757 pour l’agr de type1 ; HT 2002 0599
N315 pour l’agr de type 2 ; HT 2003 0642 MW2 pour l’agr de
type 3 ; A92 0211 pour l’agr de type 4 » du Centre National de
Recherche (CNR) de Lyon (France) ont été utilisés au cours de
cette PCR pour définir le type d’agr de nos souches.
2.7. Typage moléculaire de la cassette SCCmec par PCR
multiplex : L'ADN bactérien de toute souche productrice d'une
PLP2a a été soumis à une PCR multiplex (M-PCR 1), selon le
protocole déjà décrit par Kondo et al. [9], pour la recherche
simultanée d’un fragment de 286 pb spécifique du gène mecA
(contrôle interne pour chaque souche de SARM), et du type des
recombinases ''ccr''. Les ADN chromosomiques de six souches
de S. aureus « NCTC10442, N315, SA85/2082, CA05, WIS,
HDE288 » également fournis par le CNR de Lyon (France), ont
été inclus le long de cette amplification pour déduire le type du
SCCmec de nos souches.
Tous les produits d’amplification sont séparés par
électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5% coloré avec du
bromure d’éthidium (0.5µg/ml) dans un tampon Tris-Borate-
EDTA (TBE) 0,5X. Les photos des gels ont été prises sous UV
par un appareil « Gel Doc ».
RESULTATS
Un total de 158 souches de S. aureus communautaires a été
confirmé dont 60% provenaient du laboratoire de bactériologie
de l’Institut Pasteur du Maroc (IPM), et 40% de 14 laboratoires
privés. Ces souches ont été isolées de divers prélèvements:
Génito-Urinaires, Pus, Naso-Pharyngés, Hémocultures et
Trachéo-Alvéolaires. Dans 55% des cas (88 souches) ces
souches proviennent de personnes de sexe masculin, l’âge des
patients variaient de 1 à 88 ans. Aucune personne n'a été
hospitalisée durant l'année qui a précédé l'isolement du
pathogène.
La sensibilité des souches étudiées vis-à-vis des antibiotiques
testés est décrite dans le Tableau I. Parmi les souches étudiées,
7 (4,4%) ont présenté le phénotype sauvage et étaient sensibles
à l’ensemble des antibiotiques testés. Cent quarante trois
(90,5%) étaient résistantes à au moins un antibiotique : la
pénicilline G. Les souches isolées ont exprimé un bon niveau
de sensibilité aux macrolides et aux antibiotiques apparentés
avec respectivement 92,4% ; 98,7% et 100% de sensibilité à
l’érythromycine, à la lincomycine et à la pristinamycine. Les
aminosides restent également très actives sur ces souches, 13
parmi elles (8,2%) ont exprimé le phénotype K (résistance à la
kanamycine), deux (1,3%) le phénotype KTm (résistance à la
kanamycine et à la tobramycine) et deux autres souches (1,3%)
ont présenté le phénotype KTmGm (résistance aux 3
antibiotiques : kanamycine, tobramycine et gentamicine). Nous
avons également noté un faible taux de résistance pour la
péfloxacine (1,9%), et pour le chloramphénicol (0,6%). Ces
souches montrent également un taux de résistance assez élevé vis-
à-vis de quatre antibiotiques : tétracycline, rifampicine, acide
fusidique, et triméthoprime-sulfaméthoxazole (Tableau I).
S : Sensible, R : Résistant, I : Intermédiaire.
* Souches de S. aureus exprimant une zone d’inhibition autours de la céfoxitine
< 27 mm. Seules 3 (1,9%) parmi elles possèdent le gène mecA.
Par ailleurs, toutes les souches étudiées étaient sensibles à la
vancomycine et à la fosfomycine.
D’autre part, 12 souches (7,6%) ont exprimé une inhibition de
moins de 27 mm autour du disque de céfoxitine, elles ont été
suspectées comme des SARM. Mais en se basant sur la CMI de
cet antibiotique et la recherche du gène mecA, nous les avons
classées en 3 catégories (Tableau II).
PG: Pénicilline G; K: Kanamycine; Tm: Tobramycine; Gm: Gentamicine; Te:
Tétracycline; L: Lincomycine; E: Erythromycine; FA: Acide fusidique; Péf: Péfloxacine;
Fox: Céfoxitine; RF: Rifampicine; SXT: Cotrimoxazole. CMI: Concentration Minimale
Inhibitrice de la céfoxitine (mg/l); (-): absence; (+): présence; NF: Non fait.
Antibiotiques
Pénicilline G
Gentamycine
Kanamycine
Tobramycine
Tétracycline
Lincomycine
Erythromycine
Pristinamycine
Chloramphénicol
Péfloxacine
Rifampicine
Fosfomycine
Céfoxitine
Acide fusidique
Vancomycine
Cotrimoxazole
Staphylococcus aureus communautaires : n =158
Nombre de souches isolées
S
15
156
142
154
112
156
146
158
157
155
136
158
146
137
158
144
R/I
143
02
16
04
46
02
12
00
01
03
22
00
12*
21
00
14
Taux de résistance
(%)
90,5
1,3
10,1
2,5
29,1
1,3
7,6
00
0,6
1,9
13,9
00
7,6*
13,3
00
8,9
Tableau I : Fréquence de résistance aux antibiotiques de Staphylococcus aureus
communautaire isolé à Casablanca (2007-2008).
Table I : Resistance rate of Staphylococcus aureus strains isolated in the
community of Casablanca (2007-2008).
Phénotype de
résistance
P-Fox
P-Te-RF-Fox
P-SXT-Fox
P-K-Te-Fox
P-Te-SXT-Fox
P-K-Te-RF-Fox
P-K-Te-RF-SXT-Fox
P-K-Tm-FA-Fox
P-K-Tm-Gm-Pef-Te-RF-Fox
P-K-Tm-Gm-Pef-E-L-Te-RF-Fox
Nbre de
souches
positives au
phénotype
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Diamètre de
sensibilité de
la céfoxitine
(en mm)
25 à 26
26
22
24
24
21
24
16
9
6
CMI
4 à 8
4
12
12
12
16
16
64
>256
>256
mecA
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
Type
agr
NF
NF
NF
NF
NF
NF
NF
1
1
1
Type
SCCmec
NF
NF
NF
NF
NF
NF
NF
I
I
III
Tableau II : Caractérisation et profil de résistance des Staphylococcus aureus
communautaires isolés à Casablanca, ayant une sensibilité diminuée à la
céfoxitine (2007-2008).
Table II : Characterization and resistance pattern of Staphylococcus aureus
with reduced susceptibility to cefoxitine in the community of Casablanca (2007
– 2008).
Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140 137
M ELAZHARI et al.
La première catégorie, représentée par 3 souches : deux parmi
elles, isolées de pus ou d’urine, ont une zone d'inhibition de
moins de 10 mm, une CMI de plus de 256 mg/l et possèdent le
gène mecA ; la troisième souche, isolée à partir de pus, a un
diamètre de sensibilité de 16 mm, une CMI de 64 mg/l et
possède également le gène mecA (Figure 1). Ces 3 souches ont
le même type du gène régulateur (agr de type 1) ; l’une avec un
SCCmec de type III mercury négative, et les deux autres ont
chacune un SCCmec de type I (Figure 2).
Ligne 1 : ADN de la Souche U2A1593 « souche contrôle mecA(+) » ;
Ligne 9 : ADN de la souche U2A1594 « souche contrôle mecA(-) » ;
Lignes 2-4 : ADN de souches isolées à CMI > 16 mg/ml = mecA (+) ;
Lignes 5-7,10-15 : ADN de souches isolées à CMI ≤ 16 mg/ml = mecA
(-) ;
Ligne 8 : Témoin négatif.
Lignes 1, 10 : marqueur de poids moléculaire (100-bp DNA ladder) ;
Lignes 2-7 : ADN des témoins positifs, respectivement NCTC10442
(SCCmec type I) ; N315 (SCCmec type II) ; 85/2082 (SCCmec type III)
; CA05 (SCCmec type IV) ; WIS (SCCmec type V) ; HDE288
(SCCmec type VI) ;
Lignes 8-9 et 11 : l’ADN chromosomique de chacune des souches
mecA(+).
L’ADN du gène mecA est un utilisé comme contrôle interne au niveau
de chaque puit.
The DNA fragment corresponding to mecA served as an internal
control in each lane.
La deuxième catégorie, formée par 5 souches ; isolées de pus
(2 souches), de crachat (1 souche) et d’urine (2 souches),
montre que ces germes expriment un diamètre de sensibilité
autour du disque de la céfoxitine compris entre 21 et 24 mm,
une CMI de 12 à 16 mg/l et qu’ils sont tous dépourvus du gène
mecA (Figure 1). Leur soumission aux 4 bêtalactamines
supplémentaires (amoxicilline, amoxicilline+acide
clavulanique, céfalotine et ceftazidine) montre que toutes ces 5
souches expriment une résistance à l’amoxicilline, 3 entre elles
(isolées de pus ou de crachat) expriment une résistance
supplémentaire à la céfalotine et aucune n’est résistante à la
ceftazidine. L’acide clavulanique associé à l’amoxicilline
restaure la sensibilité de ces cinq souches envers ce dernier
antibiotique (amoxicilline).
Enfin la troisième catégorie, représentée par les 4 dernières
souches ayant une zone d'inhibition de 25 ou 26 mm, une CMI
comprise entre 4 et 8 mg/l et qui sont également dépourvues du
gène mecA (Figure 1).
Au total, nous avons noté pour les 158 souches, 31 différents
profils de résistance, ils sont largement dominés par le
phénotype « Pénicilline G » (70/158 souches). Les profils de
résistance des souches exprimant une sensibilité réduite vis-à-
vis de la céfoxitine sont notés et caractérisés au Tableau II.
DISCUSSION
Au cours de ce travail, 61 souches (38%) de S. aureus ont été
isolées à partir de prélèvements génito-urinaires. Certains
auteurs préconisent que le S. aureus isolé à partir de ces sites
forme en majorité ou en partie une flore de colonisation passive
[26]. Toutes les souches récoltées ont exprimé une sensibilité
variable vis-à-vis des 16 antibiotiques testés. Ainsi, la
résistance à la pénicilline G, par production de pénicillinase, a
été de plus de 90%, ce taux a été rapporté ailleurs [26, 27, 28,
29]. Trois autres antibiotiques ; tétracycline, rifampicine et
cotrimoxazole ; assez utilisés au Maroc étaient plus au moins
actifs avec respectivement des taux de sensibilité de 70,9%;
86,1% et 91,1%. Ces résultats, en accord avec ceux rapportés
dans d'autres travaux réalisés en Afrique [26, 30], pourront être
justifiés par le fait qu'à Casablanca, comme partout au Maroc,
ces antibiotiques sont disponibles à des prix accessibles et
parfois même sont livrés sans prescription médicale.
Nous avons noté une résistance assez importante pour l'acide
fusidique, elle a été exprimée chez 21 souches (13,3%)
retrouvées dans divers produits pathologiques, avec à leur tête
les prélèvements de pus (11 cas), et les prélèvements génito-
urinaires (6 cas), 5 isolats ont présenté cette résistance d’une
façon isolée. Ce taux de résistance dépasse celui rapporté à
Casablanca par Belabbès et al. en 2001 avec seulement 4,5%
[31], ainsi que celui publié par d'autres auteurs allant de 0 à
7,7% aussi bien pour les SASM que pour les SARM
communautaires [29, 32, 33, 34]. Cependant, ce taux avoisine
celui déclaré récemment par Elhamzaoui et al. (14,2%) [28]
lors d’une étude réalisée durant la même période (2007-2008)
sur une série de SASM hospitaliers à Rabat (Maroc). Cette
remarquable résistance est peut-être la conséquence de la
consommation de plus en plus importante de cet antibiotique au
Figure 1 : Détection par PCR duplex des gènes nuc (codant la nucléase
spécifique de S. aureus) et mecA (résistance aux ß-lactamines) des S.
aureus résistants et sensibles à la méthicilline.
Figure 1 : Detection of different methicillin-susceptible and -resistant
S. aureus strains by mecA nuc duplex PCR.
Figure 2 : Détection par PCR multiplex du type de la cassette
chromosomique SCCmec des souches de S. aureus pourvues du gène
mecA, d'après le protocole décrit par Kondo et al. [9].
Figure 2 : Detection by multiplex PCR of SCCmec type from S. aureus
strains that possess the mecA gene, as described by Kondo et al. [9].
Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140138
Sensibilité aux antibiotiques des souches de Staphylococcus aureus
Maroc ou même son utilisation de façon inappropriée, sachant
que cet antibiotique peut développer rapidement une résistance
du staphylocoque s'il est utilisé en monothérapie [35].
La résistance aux Macrolides-Lincosamides-Streptograminés
donnant le phénotype de résistance MLSb constitutive (c) n'a
été trouvé que chez une souche (0,6%) confirmée SARM,
tandis que le phénotype MLSb inductible (i) a été détecté chez
11 souches (6,9%) toutes sensibles à la méthicilline (SASM).
Cependant, en Afrique du Sud, MLSb(c) n'a été trouvée que
chez des souches SASM (0,6%), et l'expression de la MLSb(i)
a été mise en évidence chez 10,8% des SASM et chez 82% des
SARM [29] ; en Corée, 24% des SASM et 86% des SARM ont
exprimé le phénotype MLSb(c) [36] ; en Belgique et en Grèce
le phénotype MLSb(c) est une caractéristique commune pour
les SARM [37, 38]. Toutes ces observations indiquent que
l'incidence des deux phénotypes de résistance MLSb(c) et
MLSb(i) chez S. aureus varie selon les régions géographiques,
et que ces phénotypes ne peuvent pas prédire la résistance ou la
sensibilité à la méthicilline.
Le taux de résistance à la méthicilline qui était de 7,6% (12
souches), en se basant uniquement sur l’interprétation
phénotypique de l’antibiogramme, n’est en réalité que de 5,1%,
en se basant sur la CMI et la recherche du gène mecA, avec 8
souches qui se présentent comme suit :
• Trois souches (1,9%) résistantes par production d’une PLP
2a isolées chez des patients ambulants, non hospitalisés
pendant les 12 mois précédant l'isolement du germe et âgés de
plus de 45 ans. Une de ces souches exprimant le profil de
résistance (P-K-Tm-Gm-Péf-TE-RF-Fox) a été identifiée à
partir d'urine, les deux autres ayant chacune l'un des profils: (P-
K-Tm-Gm-Péf-E-L-TE-RF-Fox) ou (P-K-Tm-FA-Fox) ont été
isolées de pus. Nous notons que ces 3 germes ont des profils de
résistance très différents de ceux rencontrés chez les SARM-C
présentant généralement une faible résistance aux antibiotiques
mis à part les béta-lactamines [18, 39-41]. D’autre part, ils sont
tous sous le contrôle du système agr du groupe 1. Cependant,
d'après Eady et al. [42], ce sont les types agr3 et agr4 qui ont
été identifiés de façon prédominante dans les SARM-C
producteurs respectivement de la leucocidine de Panton-
Valentine (LPV) et de l’exfoliatine. En plus, l’une de ces
souches a une cassette chromosomique SCCmec de type III
mercury négative alors que les deux autres ont un SCCmec de
type I, or selon Vandenesch et al. [15] l'analyse génétique de
plusieurs SARM-C a révélé leur appartenance à des clones
différents mais possédant tous la cassette SCCmec de type IV
et le locus LPV. En plus, et d'après d’autres auteurs [10, 11, 12],
les deux types de cassettes identifiées dans nos souches sont
typiquement celles retrouvés dans les souches d'origine
hospitalière. En partant de ces données, nous pouvons dire que
nos 3 isolats sont probablement des germes dits « évadés des
hôpitaux », ou qui infectent des personnes à risque en milieu
communautaire. Toutefois nous les avons classés comme des
SARM communautaires du fait que ce terme désigne le plus
souvent un SARM responsable d'une infection ou tout
simplement isolé d'une colonisation mais qui est détectée en
ville [43, 44]. En fait, il existe 8 définitions différentes pour
classer les infections à SARM en communautaire ou
nosocomiale d'où la nécessité de disposer de marqueurs
moléculaires des souches de SARM [45]. Ainsi, Enright et al.
[46] ont proposé une méthode de typage basée sur la
combinaison des profils par « multilocus sequence typing »
(MLST) et le type du SCCmec, d'autres auteurs ont combiné
entre une MLST et le typage du gène de la protéine A « spa »
[47].
• Pour les 5 souches (3,2%) ayant une zone d’inhibition
autours de la céfoxitine quivarie entre 21 et 24 mm, une CMI
comprise entre 8 et 16 mg/l et qui sont dépourvues du gène
mecA, elles sont des souches qui présentent une résistance
limite ou de bas niveau à la méthicilline [48]. En fait, le test de
sensibilité de ces souches aux 4 bêtalactamines
supplémentaires (amoxicilline, amoxicilline+acide
clavulanique, céfalotine et ceftazidine) a montré qu’il s’agit
probablement de souches BORSA qui présentent une résistance
à la méthicilline à cause d’une production accrue de ß-
lactamases [13, 48].
Cette prévalence de 5,1% (souches SARM, BORSA) est élevée
par rapport à celle déjà signalée en 2001 sur une série de S.
aureus communautaire à Casablanca avec un taux de 1,9 %
[31], mais elle reste relativement faible en comparaison avec
les taux signalés dans des pays développés, notamment des
pays de l'Europe occidentale et de l'Asie orientale [49], ceci
bien que la méthicilline est le traitement de choix des infections
staphylococciques communautaires à Casablanca [31].
Les 4 souches restantes ayant une zone d’inhibition à la
céfoxitine de 25mm ou de 26 mm et qui étaient interprétées
phénotypiquement comme des SARM, sont en réalité des
SASM, ceci a été confirmé par la détermination de la CMI de
cet antibiotique qui variait entre 4 et 8 mg/l, et par l’absence du
gène mecA d’où l’intérêt pour cette catégorie de souches
exprimant un diamètre réduit à la céfoxitine de la détermination
simultanée de la CMI de la céfoxitine et la recherche du gène
mecA.
D'autre part, S. aureus peut exprimer trois phénotypes de
résistance aux aminosides impliquant trois enzymes
inactivatrices [50]. Dans notre étude, le phénotype K dû à la
présence d'une aminoside O-phosphotransferase « APH(3')-III
», a été exprimé chez 13 souches (8,2%), trois parmi elles
étaient des BORSA et/ou des MODSA, les 10 autres étaient des
SASM. Les phénotypes KTm et KTmGm dûs respectivement à
la présence d'une aminoside O-nucléotidyltransferase «
ANT(4')-I » et d'une enzyme bifonctionnelle aminoside O-
phosphotransferase, aminoside N-acétyltransferase « APH(2')-
AAC(6') ont été identifiés chez 3 souches qui possèdent le gène
mecA, avec un taux de 0,6% pour le premier phénotype et de
1,3% pour le deuxième. Ces trois phénotypes ont été rapportés
par Ficca et al. [50] sur une série de S. aureus communautaires
isolés de prélèvements nasaux, cependant les taux qu'ils ont
rapportés étaient de 0,8% pour le phénotype K (toutes les
souches exprimant ce phénotype étaient des SASM); de 4,7%
pour le phénotype KTm (83,3% des souches ayant ce
phénotype étaient des SARM) et de 0,4% pour le phénotype
KTmGm (toutes les souches avec ce phénotype étaient des
SASM).
Enfin, nous notons que tous les germes étudiés étaient sensibles
à la vancomycine qui demeure avec la teicoplanine les
traitements de choix contre les infections à SARM [51, 52].
CONCLUSION
Le taux de résistance du S. aureus communautaire de cette série
est variable en fonction des molécules considérées. Il est de 1,3
à 10,1% pour les aminosides de 0 à 7,6% pour les macrolides
et apparentés, de 2,5% pour les fluoroquinolones, de 29,1%
pour les cyclines et de 8,9% pour le cotrimoxazole. Ce taux de
résistance est assez élevé vis-à-vis de la rifampicine et de
l’acide fusidique dépassant les 12%.
La prévalence des souches résistantes à la méthicilline est de
5,1%, ces souches sont subdivisées en deux catégories :
souches multirésistantes, pourvues du gène mecA et qui sont
classées comme des souches SARM-C (1,9%); et d’autres
dépourvues de ce gène, mais présentant une CMI à la céfoxitine
comprise entre 12 et 16 mg/l, elles sont classées comme
souches BORSA (3,2%).
Cette prévalence de SARM retrouvée reste relativement faible
par rapport à ce qui a été rapporté par d’autres travaux
concernant S. aureus communautaire. Cela n’empêche pas une
surveillance régulière de l’état de sensibilité du S. aureus
communautaire par les autorités sanitaires afin de limiter la
diffusion des souches résistantes au sein de la communauté.
Remerciements :
Les auteurs remercient le Dr. J. D. Perrier-Gros-Claude, le
Professeur Patrice Courvalin de l’unité des agents
antibactériens (Institut Pasteur à Paris-France) et le Professeur
Jérôme Etienne (CNR de Lyon-France) pour les souches de
contrôle utilisées dans ce travail ; ainsi que tous les directeurs
des laboratoires d’analyses médicales à Casablanca (Maroc).
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SENSIBILITÉ AUX ANTIBIOTIQUES DES SOUCHES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COMMUNAUTAIRES À CASABLANCA (MAROC).

  • 1. Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140134 A R T I C L E O R I G I N A L Résumé : Objectif : Cette étude consiste à évaluer la sensibilité in vitro des souches de Staphylococcus aureus communautaires à Casablanca, et à définir la prévalence et la caractérisation moléculaire des souches résistantes à la méthicilline. Patients et méthodes : Dans ce but, 158 souches bactériennes ont été récoltées entre Janvier 2007 et Décembre 2008, de 15 laboratoires de biologie médicale à Casablanca. La sensibilité des souches a été déterminée en utilisant la méthode de diffusion en milieu gélosé Mueller- Hinton. La recherche du gène mecA a été réalisée sur toute souche exprimant un bas niveau de sensibilité à la céfoxitine. Le typage du gène régulateur agr (accessory gene regulator) et de la cassette chromosomique SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec) a été effectué sur les souches mecA positives. Résultats : Les résultats obtenus montrent un total de 31 différents profils de résistance. Douze souches (7,6%) étaient phénotypiquement résistantes à la céfoxitine, cinq (3,2%) parmi elles étaient des souches « Borderline Resistant S. aureus » (BORSA) et seulement 3 (1,9%) possédaient le gène mecA avec un agr de type 1, dont deux avec un SCCmec de type III mercury négative et une avec un SCCmec de type I. Conclusion : Les souches de S. aureus communautaires à Casablanca montrent une diversité des profils de résistance, avec seulement 1,9% des souches qui étaient résistantes à la méthicilline par la présence du gène mecA. Mots clés : Communautaire, résistance, antibiotiques, méthicilline, Staphylococcus aureus. Key words : Community, resistance, antibiotics, methicillin, Staphylococcus aureus Abstract: Objective : The aim of the present study was to make an update on the susceptibility of Staphylococcus aureus in Casablanca, and therefore to define the prevalence and the characterization of methicillin-resistant strain. Materials and methods : Clinical Staphylococcus aureus isolates were collected from patients at the Institute Pasteur of Morocco and from 14 private laboratories located in Casablanca, from January 2007 to December 2008. Susceptibility testing was performed by the disk diffusion method on Mueller-Hinton agar plates. Strains expressed phenotypic resistance to cefoxitin confirmed by polymerase chain reaction detection of the mecA gene, typing of the accessory gene regulator “agr” and the Staphylococcal Cassette Chromosome “SCCmec” has been made for mecA positive strains. Results : The results showed 31 different resistance patterns. On the other hand, among twelve strains (7.6%) which have a low susceptibility to cefoxitin, five (3.2%) isolates were Borderline Resistant Staphylococcus aureus “BORSA” and only three (1.9% ) had the mecA gene with an agr type 1. Two of the three MRSA were with type III SCCmec mercury negative and the other with type I SCCmec. Conclusion : The community strains of Staphylococcus aureus circulating in Casablanca had a diversity of their resistance pattern. Only 1.9% of strains were resistant to methicillin by the presence of mecA gene. SENSIBILITÉ AUX ANTIBIOTIQUES DES SOUCHES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COMMUNAUTAIRES À CASABLANCA (MAROC). ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS IN THE COMMUNITY OF CASABLANCA (MOROCCO). M. Elazhari1,2*, K. Zerouali3, D. Elhabchi4, N. Cohen4, A. El malki1, N. Dersi1, M. Hassar1, M. Timinouni5, R. Saile2. 1- Laboratoire de Bactériologie Médicale, Centre de Biologie Médicale, Institut Pasteur du Maroc. Casablanca.Maroc 2- Département de Biologie, Faculté des Sciences Ben M'Sik,Université Hassan II, UFR Biologie et Santé. Casablanca.Maroc 3- Laboratoire de Bactériologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie,Université Hassan II, Rue Tarik Bnou Zyad, Casablanca.Maroc 4- Laboratoire de Bactériologie, Département de sécurité des aliments et d’environnement, Institut Pasteur du Maroc. Casablanca.Maroc 5- Laboratoire de Bactériologie Moléculaire, Département de recherche, Institut Pasteur du Maroc. Casablanca.Maroc Correspondance : Mohamed Elazhari Laboratoire de Bactériologie Médicale. Centre de Biologie Médicale - Institut Pasteur. 1, place Louis Pasteur. 20360 Casablanca - Maroc. Email : mohamed.elazhari@pasteur.ma
  • 2. INTRODUCTION Staphylococcus aureus, est une bactérie ubiquitaire que l’on retrouve fréquemment sur la peau et dans les narines des personnes. C’est l’un des principaux agents étiologiques des infections suppuratives superficielles et profondes ainsi que des syndromes liés à l’action des toxines. Il est doué d’une grande capacité d’acquérir et d’exprimer un large éventuel de facteurs de virulence et de résistance aux antibiotiques [1, 2]. Au moment de l'introduction de la pénicilline en usage clinique au début des années quarante, S. aureus était sensible à son action. En 1950, la première souche résistante à cet antibiotique a été décrite. De nouvelles molécules semi-synthétiques anti- staphylococciques furent alors commercialisées, et deux ans après l'introduction de la méthicilline (pénicilline semi- synthétique) en 1959, les premières souches résistantes à la pénicilline M (méthicilline) ont été rapportées [3, 4, 5]. En fait, cette résistance est acquise par l'insertion dans le chromosome bactérien d'un élément génétique mobile appelé SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec) abritant le gène mecA [6, 7]. Le produit majeur de cet élément est une enzyme nommée protéine de liaison à la pénicilline additionnelle (PLP2a ou PLP2'), caractérisée par une faible affinité pour les ß-lactamines, par opposition aux autres PLP (au nombre de 4) impliquées dans la biosynthèse du peptidoglycane. Le SCCmec véhicule aussi une paire de gènes appelés (cassette chromosomal recombinase genes A and B « ccrAB ou ccrA et ccrB ») qui codent pour des recombinases A et B. Ces dernières sont capables de mobiliser cet élément génétique [8]. Récemment, six grands types de SCCmec (de I à VI) ont été définis, par combinaison du type de recombinases (5 hallotypes ont été rapportés) et de la classe du complexe du gène mecA (4 classes ont été décrites) [9] ; trois parmi eux (I, II et III) sont typiquement retrouvés dans les souches d'origine hospitalière. Le SCCmec de type V a été rapporté dans certaines souches communautaires, et celui du type IV a été trouvé chez les deux types de souches [10, 11, 12]. A côté du S. aureus producteur de PLP2a, il existe des souches ne possédant pas le gène mecA, tout en exprimant un bas niveau de résistance à la méthicilline, ces souches sont soit hyperproductrices de ß-lactamase (souches BORSA pour Borderline Resistant S.aureus), soit expriment des PLP altérées (souches MODSA pour Modified Penicillin-Binding S. aureus) [13, 14]. Au cours de ces dernières années, les S. aureus résistants à la méthicilline (SARM) sont devenus des agents pathogènes qui circulent dans la communauté [15, 16, 17, 18]. Ils sont, contrairement aux souches nosocomiales, plus sensibles à la plupart des antibiotiques, hormis les béta- lactamines [19]. Il a été rapporté que dans certaines régions, ces souches étaient plus répandues que les S. aureus sensibles à la méthicilline (SASM) [20]. Plus encore, elles ont tendance a être plus virulentes que les SARM hospitaliers [21]. A Casablanca, ville Marocaine de plus de 3 millions d’habitants, les données concernant la sensibilité aux antibiotiques de S. aureus communautaire sont rares, nous évaluons donc dans ce travail, premier de son genre au Maroc, la résistance de ce pathogène vis-à-vis de 16 molécules d’antibiotiques et nous déterminons la prévalence et la caractérisation moléculaire des SARM communautaires (SARM-C) pourvus du gène mecA. MATERIELS ET METHODES 2.1. Récolte des souches bactériennes : La totalité des souches de S. aureus, objet de notre travail, a été récoltée entre le début du mois de Janvier 2007 et la fin du mois de Décembre 2008, à partir de 15 laboratoires de biologie médicale situés à Casablanca. Les bactéries ont été récupérées sur des géloses de conservation en tube, accompagnées de renseignements cliniques : l’âge et le sexe du patient, l’hospitalisation ou non durant les 12 derniers mois et le site d’isolement. Chaque souche a été remise en culture sur une gélose Mueller-Hinton (MH) au sang, et incubée à 36°C en atmosphère ambiante pendant 18 à 24 heures. 2.2. Identification bactérienne : Cette identification a été basée sur les critères suivants : l’état frais, la coloration de Gram, la recherche de catalase, la fermentation du mannitol, les tests d’agglutination (Pastorex staph « Bio-Rad, France » et/ou Slidex staph « BioMérieux, France ») et le test de coagulation du plasma de lapin. Les souches identifiées ont été conservées en gélose profonde à température ambiante et en cryobilles à - 20°C. 2.3. Sensibilité aux antibiotiques : La résistance aux antibiotiques a été déterminée par la méthode de diffusion de disques (Bio-Rad, France), en milieu gélosé MH (Bio-Rad, France) selon les recommandations décrites par le CA-SFM, 2007 (Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie). Un inoculum de 106 UFC/ml a été préparé pour chaque souche bactérienne et le milieu MH a été ensemencé par écouvillonnage ; après 18-24 heures d’incubation à 36°C en atmosphère ambiante, la lecture et l’interprétation des antibiogrammes ont été faites par le logiciel «OSIRIS®» évolution software (Bio-Rad). Les 16 antibiotiques testés sont : Pénicilline G (PG-6µg), Kanamycine (K-30UI), Tobramycine (Tm-10µg), Gentamicine (Gm-15µg), Tétracycline (Te-30UI), Erythromycine (E-15UI), Lincomycine (L-15µg), Pristinamycine (PT-15µg), Chloramphénicol (C-30µg), Péfloxacine (Pef-5µg), Fosfomycine (Fos-5µg), Céfoxitine (Fox-30µg), Acide fusidique (FA-10µg), Rifampicine (RF-30µg), Vancomycine (VA-30µg) et Triméthoprime-sulfaméthoxazole (Cotrimoxazole) (SXT- 1,25/23,75µg) . La recherche de la résistance à la méthicilline a été effectuée par la méthode de diffusion du disque de céfoxitine. Un diamètre d’inhibition autour du disque de moins de 27 mm témoigne de la suspicion de la présence d’un SARM. La détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la céfoxitine a été réalisée par les bandelettes E-test (AB Biodisk, Solna, Suède) sur gélose MH avec un inoculum de 106 UFC/ml selon les recommandations décrites par le CA-SFM. La mise en évidence du gène responsable de cette résistance (gène mecA) a été réalisée par PCR. Et, toute souche exprimant une sensibilité réduite vis-à-vis de la céfoxitine et confirmée défectueuse en gène mecA serait soumise à l’action de 4 autres bêtalactamines (amoxicilline, amoxicilline+acide clavulanique, céfalotine et ceftazidine). Le contrôle de qualité de l’antibiogramme a été réalisé à l’aide de S. aureus ATTC 25923 tout au long de ce travail. 2.4. Extraction d’ADN bactérien : L’ADN de chaque souche suspectée SARM a été extrait selon le protocole standard [22]. L'ADN récolté était ensuite précipité, quantifié par électrophorèse sur gel d'agarose ; puis conservé à -20°C. 2.5. Recherche des gènes mecA et nuc par PCR : Une PCR duplex pour la recherche simultanée d’un fragment de 309 paires de bases (pb) spécifique au gène mecA, et d’un autre Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140 135 M ELAZHARI et al.
  • 3. Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140136 Sensibilité aux antibiotiques des souches de Staphylococcus aureus fragment de 218 pb du gène nuc codant pour la nucléase spécifique du S. aureus a été réalisée en utilisant les amorces déjà décrites [23, 24]. Deux souches de références de l’unité des agents antibactériens de l’institut Pasteur à Paris (France) : U2A1593 (S. aureus, résistant à la méthicilline, mecA positive) et U2A1594 (S. aureus, sensible à la méthicilline, mecA négative) ont été utilisées comme témoins. 2.6. Typage moléculaire du gène agr «accessory gene regulator» par PCR multiplex : Une PCR multiplex pour la recherche du type d’agr a été effectuée, pour tout S. aureus produisant une PLP2a, selon le protocole décrit par Gilot et al. [25] ; les ADN chromosomiques de quatre souches de S. aureus « A92 0242 CCM 5757 pour l’agr de type1 ; HT 2002 0599 N315 pour l’agr de type 2 ; HT 2003 0642 MW2 pour l’agr de type 3 ; A92 0211 pour l’agr de type 4 » du Centre National de Recherche (CNR) de Lyon (France) ont été utilisés au cours de cette PCR pour définir le type d’agr de nos souches. 2.7. Typage moléculaire de la cassette SCCmec par PCR multiplex : L'ADN bactérien de toute souche productrice d'une PLP2a a été soumis à une PCR multiplex (M-PCR 1), selon le protocole déjà décrit par Kondo et al. [9], pour la recherche simultanée d’un fragment de 286 pb spécifique du gène mecA (contrôle interne pour chaque souche de SARM), et du type des recombinases ''ccr''. Les ADN chromosomiques de six souches de S. aureus « NCTC10442, N315, SA85/2082, CA05, WIS, HDE288 » également fournis par le CNR de Lyon (France), ont été inclus le long de cette amplification pour déduire le type du SCCmec de nos souches. Tous les produits d’amplification sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5% coloré avec du bromure d’éthidium (0.5µg/ml) dans un tampon Tris-Borate- EDTA (TBE) 0,5X. Les photos des gels ont été prises sous UV par un appareil « Gel Doc ». RESULTATS Un total de 158 souches de S. aureus communautaires a été confirmé dont 60% provenaient du laboratoire de bactériologie de l’Institut Pasteur du Maroc (IPM), et 40% de 14 laboratoires privés. Ces souches ont été isolées de divers prélèvements: Génito-Urinaires, Pus, Naso-Pharyngés, Hémocultures et Trachéo-Alvéolaires. Dans 55% des cas (88 souches) ces souches proviennent de personnes de sexe masculin, l’âge des patients variaient de 1 à 88 ans. Aucune personne n'a été hospitalisée durant l'année qui a précédé l'isolement du pathogène. La sensibilité des souches étudiées vis-à-vis des antibiotiques testés est décrite dans le Tableau I. Parmi les souches étudiées, 7 (4,4%) ont présenté le phénotype sauvage et étaient sensibles à l’ensemble des antibiotiques testés. Cent quarante trois (90,5%) étaient résistantes à au moins un antibiotique : la pénicilline G. Les souches isolées ont exprimé un bon niveau de sensibilité aux macrolides et aux antibiotiques apparentés avec respectivement 92,4% ; 98,7% et 100% de sensibilité à l’érythromycine, à la lincomycine et à la pristinamycine. Les aminosides restent également très actives sur ces souches, 13 parmi elles (8,2%) ont exprimé le phénotype K (résistance à la kanamycine), deux (1,3%) le phénotype KTm (résistance à la kanamycine et à la tobramycine) et deux autres souches (1,3%) ont présenté le phénotype KTmGm (résistance aux 3 antibiotiques : kanamycine, tobramycine et gentamicine). Nous avons également noté un faible taux de résistance pour la péfloxacine (1,9%), et pour le chloramphénicol (0,6%). Ces souches montrent également un taux de résistance assez élevé vis- à-vis de quatre antibiotiques : tétracycline, rifampicine, acide fusidique, et triméthoprime-sulfaméthoxazole (Tableau I). S : Sensible, R : Résistant, I : Intermédiaire. * Souches de S. aureus exprimant une zone d’inhibition autours de la céfoxitine < 27 mm. Seules 3 (1,9%) parmi elles possèdent le gène mecA. Par ailleurs, toutes les souches étudiées étaient sensibles à la vancomycine et à la fosfomycine. D’autre part, 12 souches (7,6%) ont exprimé une inhibition de moins de 27 mm autour du disque de céfoxitine, elles ont été suspectées comme des SARM. Mais en se basant sur la CMI de cet antibiotique et la recherche du gène mecA, nous les avons classées en 3 catégories (Tableau II). PG: Pénicilline G; K: Kanamycine; Tm: Tobramycine; Gm: Gentamicine; Te: Tétracycline; L: Lincomycine; E: Erythromycine; FA: Acide fusidique; Péf: Péfloxacine; Fox: Céfoxitine; RF: Rifampicine; SXT: Cotrimoxazole. CMI: Concentration Minimale Inhibitrice de la céfoxitine (mg/l); (-): absence; (+): présence; NF: Non fait. Antibiotiques Pénicilline G Gentamycine Kanamycine Tobramycine Tétracycline Lincomycine Erythromycine Pristinamycine Chloramphénicol Péfloxacine Rifampicine Fosfomycine Céfoxitine Acide fusidique Vancomycine Cotrimoxazole Staphylococcus aureus communautaires : n =158 Nombre de souches isolées S 15 156 142 154 112 156 146 158 157 155 136 158 146 137 158 144 R/I 143 02 16 04 46 02 12 00 01 03 22 00 12* 21 00 14 Taux de résistance (%) 90,5 1,3 10,1 2,5 29,1 1,3 7,6 00 0,6 1,9 13,9 00 7,6* 13,3 00 8,9 Tableau I : Fréquence de résistance aux antibiotiques de Staphylococcus aureus communautaire isolé à Casablanca (2007-2008). Table I : Resistance rate of Staphylococcus aureus strains isolated in the community of Casablanca (2007-2008). Phénotype de résistance P-Fox P-Te-RF-Fox P-SXT-Fox P-K-Te-Fox P-Te-SXT-Fox P-K-Te-RF-Fox P-K-Te-RF-SXT-Fox P-K-Tm-FA-Fox P-K-Tm-Gm-Pef-Te-RF-Fox P-K-Tm-Gm-Pef-E-L-Te-RF-Fox Nbre de souches positives au phénotype 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Diamètre de sensibilité de la céfoxitine (en mm) 25 à 26 26 22 24 24 21 24 16 9 6 CMI 4 à 8 4 12 12 12 16 16 64 >256 >256 mecA (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) Type agr NF NF NF NF NF NF NF 1 1 1 Type SCCmec NF NF NF NF NF NF NF I I III Tableau II : Caractérisation et profil de résistance des Staphylococcus aureus communautaires isolés à Casablanca, ayant une sensibilité diminuée à la céfoxitine (2007-2008). Table II : Characterization and resistance pattern of Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to cefoxitine in the community of Casablanca (2007 – 2008).
  • 4. Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140 137 M ELAZHARI et al. La première catégorie, représentée par 3 souches : deux parmi elles, isolées de pus ou d’urine, ont une zone d'inhibition de moins de 10 mm, une CMI de plus de 256 mg/l et possèdent le gène mecA ; la troisième souche, isolée à partir de pus, a un diamètre de sensibilité de 16 mm, une CMI de 64 mg/l et possède également le gène mecA (Figure 1). Ces 3 souches ont le même type du gène régulateur (agr de type 1) ; l’une avec un SCCmec de type III mercury négative, et les deux autres ont chacune un SCCmec de type I (Figure 2). Ligne 1 : ADN de la Souche U2A1593 « souche contrôle mecA(+) » ; Ligne 9 : ADN de la souche U2A1594 « souche contrôle mecA(-) » ; Lignes 2-4 : ADN de souches isolées à CMI > 16 mg/ml = mecA (+) ; Lignes 5-7,10-15 : ADN de souches isolées à CMI ≤ 16 mg/ml = mecA (-) ; Ligne 8 : Témoin négatif. Lignes 1, 10 : marqueur de poids moléculaire (100-bp DNA ladder) ; Lignes 2-7 : ADN des témoins positifs, respectivement NCTC10442 (SCCmec type I) ; N315 (SCCmec type II) ; 85/2082 (SCCmec type III) ; CA05 (SCCmec type IV) ; WIS (SCCmec type V) ; HDE288 (SCCmec type VI) ; Lignes 8-9 et 11 : l’ADN chromosomique de chacune des souches mecA(+). L’ADN du gène mecA est un utilisé comme contrôle interne au niveau de chaque puit. The DNA fragment corresponding to mecA served as an internal control in each lane. La deuxième catégorie, formée par 5 souches ; isolées de pus (2 souches), de crachat (1 souche) et d’urine (2 souches), montre que ces germes expriment un diamètre de sensibilité autour du disque de la céfoxitine compris entre 21 et 24 mm, une CMI de 12 à 16 mg/l et qu’ils sont tous dépourvus du gène mecA (Figure 1). Leur soumission aux 4 bêtalactamines supplémentaires (amoxicilline, amoxicilline+acide clavulanique, céfalotine et ceftazidine) montre que toutes ces 5 souches expriment une résistance à l’amoxicilline, 3 entre elles (isolées de pus ou de crachat) expriment une résistance supplémentaire à la céfalotine et aucune n’est résistante à la ceftazidine. L’acide clavulanique associé à l’amoxicilline restaure la sensibilité de ces cinq souches envers ce dernier antibiotique (amoxicilline). Enfin la troisième catégorie, représentée par les 4 dernières souches ayant une zone d'inhibition de 25 ou 26 mm, une CMI comprise entre 4 et 8 mg/l et qui sont également dépourvues du gène mecA (Figure 1). Au total, nous avons noté pour les 158 souches, 31 différents profils de résistance, ils sont largement dominés par le phénotype « Pénicilline G » (70/158 souches). Les profils de résistance des souches exprimant une sensibilité réduite vis-à- vis de la céfoxitine sont notés et caractérisés au Tableau II. DISCUSSION Au cours de ce travail, 61 souches (38%) de S. aureus ont été isolées à partir de prélèvements génito-urinaires. Certains auteurs préconisent que le S. aureus isolé à partir de ces sites forme en majorité ou en partie une flore de colonisation passive [26]. Toutes les souches récoltées ont exprimé une sensibilité variable vis-à-vis des 16 antibiotiques testés. Ainsi, la résistance à la pénicilline G, par production de pénicillinase, a été de plus de 90%, ce taux a été rapporté ailleurs [26, 27, 28, 29]. Trois autres antibiotiques ; tétracycline, rifampicine et cotrimoxazole ; assez utilisés au Maroc étaient plus au moins actifs avec respectivement des taux de sensibilité de 70,9%; 86,1% et 91,1%. Ces résultats, en accord avec ceux rapportés dans d'autres travaux réalisés en Afrique [26, 30], pourront être justifiés par le fait qu'à Casablanca, comme partout au Maroc, ces antibiotiques sont disponibles à des prix accessibles et parfois même sont livrés sans prescription médicale. Nous avons noté une résistance assez importante pour l'acide fusidique, elle a été exprimée chez 21 souches (13,3%) retrouvées dans divers produits pathologiques, avec à leur tête les prélèvements de pus (11 cas), et les prélèvements génito- urinaires (6 cas), 5 isolats ont présenté cette résistance d’une façon isolée. Ce taux de résistance dépasse celui rapporté à Casablanca par Belabbès et al. en 2001 avec seulement 4,5% [31], ainsi que celui publié par d'autres auteurs allant de 0 à 7,7% aussi bien pour les SASM que pour les SARM communautaires [29, 32, 33, 34]. Cependant, ce taux avoisine celui déclaré récemment par Elhamzaoui et al. (14,2%) [28] lors d’une étude réalisée durant la même période (2007-2008) sur une série de SASM hospitaliers à Rabat (Maroc). Cette remarquable résistance est peut-être la conséquence de la consommation de plus en plus importante de cet antibiotique au Figure 1 : Détection par PCR duplex des gènes nuc (codant la nucléase spécifique de S. aureus) et mecA (résistance aux ß-lactamines) des S. aureus résistants et sensibles à la méthicilline. Figure 1 : Detection of different methicillin-susceptible and -resistant S. aureus strains by mecA nuc duplex PCR. Figure 2 : Détection par PCR multiplex du type de la cassette chromosomique SCCmec des souches de S. aureus pourvues du gène mecA, d'après le protocole décrit par Kondo et al. [9]. Figure 2 : Detection by multiplex PCR of SCCmec type from S. aureus strains that possess the mecA gene, as described by Kondo et al. [9].
  • 5. Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140138 Sensibilité aux antibiotiques des souches de Staphylococcus aureus Maroc ou même son utilisation de façon inappropriée, sachant que cet antibiotique peut développer rapidement une résistance du staphylocoque s'il est utilisé en monothérapie [35]. La résistance aux Macrolides-Lincosamides-Streptograminés donnant le phénotype de résistance MLSb constitutive (c) n'a été trouvé que chez une souche (0,6%) confirmée SARM, tandis que le phénotype MLSb inductible (i) a été détecté chez 11 souches (6,9%) toutes sensibles à la méthicilline (SASM). Cependant, en Afrique du Sud, MLSb(c) n'a été trouvée que chez des souches SASM (0,6%), et l'expression de la MLSb(i) a été mise en évidence chez 10,8% des SASM et chez 82% des SARM [29] ; en Corée, 24% des SASM et 86% des SARM ont exprimé le phénotype MLSb(c) [36] ; en Belgique et en Grèce le phénotype MLSb(c) est une caractéristique commune pour les SARM [37, 38]. Toutes ces observations indiquent que l'incidence des deux phénotypes de résistance MLSb(c) et MLSb(i) chez S. aureus varie selon les régions géographiques, et que ces phénotypes ne peuvent pas prédire la résistance ou la sensibilité à la méthicilline. Le taux de résistance à la méthicilline qui était de 7,6% (12 souches), en se basant uniquement sur l’interprétation phénotypique de l’antibiogramme, n’est en réalité que de 5,1%, en se basant sur la CMI et la recherche du gène mecA, avec 8 souches qui se présentent comme suit : • Trois souches (1,9%) résistantes par production d’une PLP 2a isolées chez des patients ambulants, non hospitalisés pendant les 12 mois précédant l'isolement du germe et âgés de plus de 45 ans. Une de ces souches exprimant le profil de résistance (P-K-Tm-Gm-Péf-TE-RF-Fox) a été identifiée à partir d'urine, les deux autres ayant chacune l'un des profils: (P- K-Tm-Gm-Péf-E-L-TE-RF-Fox) ou (P-K-Tm-FA-Fox) ont été isolées de pus. Nous notons que ces 3 germes ont des profils de résistance très différents de ceux rencontrés chez les SARM-C présentant généralement une faible résistance aux antibiotiques mis à part les béta-lactamines [18, 39-41]. D’autre part, ils sont tous sous le contrôle du système agr du groupe 1. Cependant, d'après Eady et al. [42], ce sont les types agr3 et agr4 qui ont été identifiés de façon prédominante dans les SARM-C producteurs respectivement de la leucocidine de Panton- Valentine (LPV) et de l’exfoliatine. En plus, l’une de ces souches a une cassette chromosomique SCCmec de type III mercury négative alors que les deux autres ont un SCCmec de type I, or selon Vandenesch et al. [15] l'analyse génétique de plusieurs SARM-C a révélé leur appartenance à des clones différents mais possédant tous la cassette SCCmec de type IV et le locus LPV. En plus, et d'après d’autres auteurs [10, 11, 12], les deux types de cassettes identifiées dans nos souches sont typiquement celles retrouvés dans les souches d'origine hospitalière. En partant de ces données, nous pouvons dire que nos 3 isolats sont probablement des germes dits « évadés des hôpitaux », ou qui infectent des personnes à risque en milieu communautaire. Toutefois nous les avons classés comme des SARM communautaires du fait que ce terme désigne le plus souvent un SARM responsable d'une infection ou tout simplement isolé d'une colonisation mais qui est détectée en ville [43, 44]. En fait, il existe 8 définitions différentes pour classer les infections à SARM en communautaire ou nosocomiale d'où la nécessité de disposer de marqueurs moléculaires des souches de SARM [45]. Ainsi, Enright et al. [46] ont proposé une méthode de typage basée sur la combinaison des profils par « multilocus sequence typing » (MLST) et le type du SCCmec, d'autres auteurs ont combiné entre une MLST et le typage du gène de la protéine A « spa » [47]. • Pour les 5 souches (3,2%) ayant une zone d’inhibition autours de la céfoxitine quivarie entre 21 et 24 mm, une CMI comprise entre 8 et 16 mg/l et qui sont dépourvues du gène mecA, elles sont des souches qui présentent une résistance limite ou de bas niveau à la méthicilline [48]. En fait, le test de sensibilité de ces souches aux 4 bêtalactamines supplémentaires (amoxicilline, amoxicilline+acide clavulanique, céfalotine et ceftazidine) a montré qu’il s’agit probablement de souches BORSA qui présentent une résistance à la méthicilline à cause d’une production accrue de ß- lactamases [13, 48]. Cette prévalence de 5,1% (souches SARM, BORSA) est élevée par rapport à celle déjà signalée en 2001 sur une série de S. aureus communautaire à Casablanca avec un taux de 1,9 % [31], mais elle reste relativement faible en comparaison avec les taux signalés dans des pays développés, notamment des pays de l'Europe occidentale et de l'Asie orientale [49], ceci bien que la méthicilline est le traitement de choix des infections staphylococciques communautaires à Casablanca [31]. Les 4 souches restantes ayant une zone d’inhibition à la céfoxitine de 25mm ou de 26 mm et qui étaient interprétées phénotypiquement comme des SARM, sont en réalité des SASM, ceci a été confirmé par la détermination de la CMI de cet antibiotique qui variait entre 4 et 8 mg/l, et par l’absence du gène mecA d’où l’intérêt pour cette catégorie de souches exprimant un diamètre réduit à la céfoxitine de la détermination simultanée de la CMI de la céfoxitine et la recherche du gène mecA. D'autre part, S. aureus peut exprimer trois phénotypes de résistance aux aminosides impliquant trois enzymes inactivatrices [50]. Dans notre étude, le phénotype K dû à la présence d'une aminoside O-phosphotransferase « APH(3')-III », a été exprimé chez 13 souches (8,2%), trois parmi elles étaient des BORSA et/ou des MODSA, les 10 autres étaient des SASM. Les phénotypes KTm et KTmGm dûs respectivement à la présence d'une aminoside O-nucléotidyltransferase « ANT(4')-I » et d'une enzyme bifonctionnelle aminoside O- phosphotransferase, aminoside N-acétyltransferase « APH(2')- AAC(6') ont été identifiés chez 3 souches qui possèdent le gène mecA, avec un taux de 0,6% pour le premier phénotype et de 1,3% pour le deuxième. Ces trois phénotypes ont été rapportés par Ficca et al. [50] sur une série de S. aureus communautaires isolés de prélèvements nasaux, cependant les taux qu'ils ont rapportés étaient de 0,8% pour le phénotype K (toutes les souches exprimant ce phénotype étaient des SASM); de 4,7% pour le phénotype KTm (83,3% des souches ayant ce phénotype étaient des SARM) et de 0,4% pour le phénotype KTmGm (toutes les souches avec ce phénotype étaient des SASM). Enfin, nous notons que tous les germes étudiés étaient sensibles à la vancomycine qui demeure avec la teicoplanine les traitements de choix contre les infections à SARM [51, 52]. CONCLUSION Le taux de résistance du S. aureus communautaire de cette série est variable en fonction des molécules considérées. Il est de 1,3 à 10,1% pour les aminosides de 0 à 7,6% pour les macrolides et apparentés, de 2,5% pour les fluoroquinolones, de 29,1% pour les cyclines et de 8,9% pour le cotrimoxazole. Ce taux de résistance est assez élevé vis-à-vis de la rifampicine et de l’acide fusidique dépassant les 12%. La prévalence des souches résistantes à la méthicilline est de 5,1%, ces souches sont subdivisées en deux catégories :
  • 6. souches multirésistantes, pourvues du gène mecA et qui sont classées comme des souches SARM-C (1,9%); et d’autres dépourvues de ce gène, mais présentant une CMI à la céfoxitine comprise entre 12 et 16 mg/l, elles sont classées comme souches BORSA (3,2%). Cette prévalence de SARM retrouvée reste relativement faible par rapport à ce qui a été rapporté par d’autres travaux concernant S. aureus communautaire. Cela n’empêche pas une surveillance régulière de l’état de sensibilité du S. aureus communautaire par les autorités sanitaires afin de limiter la diffusion des souches résistantes au sein de la communauté. Remerciements : Les auteurs remercient le Dr. J. D. Perrier-Gros-Claude, le Professeur Patrice Courvalin de l’unité des agents antibactériens (Institut Pasteur à Paris-France) et le Professeur Jérôme Etienne (CNR de Lyon-France) pour les souches de contrôle utilisées dans ce travail ; ainsi que tous les directeurs des laboratoires d’analyses médicales à Casablanca (Maroc). 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Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140 139 M ELAZHARI et al.
  • 7. Revue Tunisienne d’Infectiologie. Octobre 2010, Vol.4, N°4 : 134 - 140140 Sensibilité aux antibiotiques des souches de Staphylococcus aureus Panton-Vlentine leucocidin-positive community-acquired methicillin- resistant Staphylococcus aureus clone in Tunisia. Diagn Microbiol Infect Dis ; 2008 Apr 2. [Epub ahead of print]. 35.Darley ESR and MacGowan AP. Antibiotic treatment of gram positive bone and joint infections. J Antimicrob Chemother 2004 ; 53 : 928-35. 36.Kim HB, Jang HC, Nam HC et al. In vitro activities of 28 antimicrobial agents against Staphylococcus aureus isolates from tertiary-care hospitals in Korea: a nationwide survey. Antimicrob Agents Chemother 2004 ; 48 : 1124-7. 37.Denis O, Deplano A, Nonhoff C et al. National Surveillance of Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus in Belgian Hospitals Indicates Rapid Diversification of Epidemic Clones. Antimicrob Agents Chemother 2004 ; 48(9) : 3625-9. 38.Fokas S, Fokas S, Tsironi M et al. Prevalence of inducible clindamycin resistance in macrolide-resistant Staphylococcus spp. Clin Microbiol Infect 2005 ; 11 : 337-40. 39.O'Brien FG, Lim TT, Chong FN et al. Diversity among community isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Australia. J Clin Microbiol 2004 ; 42(7) : 3185-90. 40.Orrett FA, Brooks PJ, Richardson EG. Nosocomial infections in a rural regional hospital in a developing country: infection rates by site, service, cost, and infection control practices. Infect Control Hosp Epidemiol 1998; 19(2) : 136-40. 41.Naimi TS, LeDell KH, Como-Sabetti K et al. Comparison of community-and health care-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. JAMA 2003 ; 290 : 2976-84. 42.Eady E, Cove J. Staphylococcal resistance revisited community acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an emerging problem for the management of skin and soft tissue infections. Curr Opin Infect Dis 2003 ; 16: 103-24. 43.Siegman-Igra Y, Fourer B, Orni-Wasserlauf R et al. Reappraisal of Community-Acquired Bacteremia : A proposal of a New Classification fort the Spectrum of Acquisition of Bacteremia. Clin Infect Dis 2002 ; 34 : 1431- 9. 44.Eguia JM and Chambers HF. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus : epidemiology and potential virulence factors. Curr Infect Dis Reports 2003 ; 5(6) : 459-66. 45.Salgado CD, Farr BM, Calfee DP. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus : a meta-analysis of prevalence and risk factors. Clin Infect Dis 2003 ; 36 : 131-9. 46.Enright MC, Robinson DA, Randle G et al. The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proc Natl Acad Sci USA 2002 ; 99(11) : 7687-92. 47.Orrett FA and Land M. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus prevalence: Current susceptibility patterns in Trinidad. BMC Infect Dis 2006 ; 6 : 83. 48.Jorgensen J. Mechanisms of methicillin resistance in Staphylococcus aureus and methods for laboratory detection. Infect Control Hosp Epidemiol 1991 ; 12 : 214-19. 49.Denton M, O'Connell B, Bernard P et al. The EPISA Study: antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus causing primary or secondary skin and soft tissue infections in the community in France, the UK and Ireland. J Antimicrob Chemother 2008 ; 61(3) : 586-8. 50.Ficca G, Chauvel M, de Moüy D et al. Etude de la prévalence de la résistance à la méthicilline chez Staphylococcus aureus. Med Mal Infect 2006 ; 36 : 207- 12. 51.Sabath LD. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics in strains of Staphylococcus aureus. Ann Intern Med 1982 ; 97(3) : 339-44. 52.Fortun J, Pérez-Molina JA, Anon MT et al. Right-sided endocarditis caused by Staphylococcus aureus in drug abusers. Antimicrob Agents Chemother 1995 ; 39(2) : 525-8.