Anomalies-genetiques-webinaire-UMT_STAR_02-SFabre.pdf

1. p. 1 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Stéphane Fabre Les anomalies génétiques : comment les étudier avec les outils génomiques disponibles ? Projet doctoral HOMLET co-financé par: CASDAR n°20ART1532777 https://idele.fr/presage/

2. p. 2 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Qu’est-ce qu’une anomalie génétique? Phénotype déviant (± délétère) par rapport à la population Mutation dans l’ADN naturelle, rare et héréditaire  Anomalie Génétique A effet dominant A effet récessif normal normal anomalie anomalie

3. p. 3 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Quels sont les outils de la génomique pour étudier les anomalies ? « Puces » de génotypages – des milliers de marqueurs génétiques balisant le génome (5 000 – 15 000 – 50 000 – 600 000 SNP) Des génomes de référence Séquenceurs haut-débit – 14.1012 bases (Tb) en 72h  génomes complets séquencés (3Gb) Bases de données génomiques Plateformes de bio-informatique Bases de données animales Identification individuelle Données zootechniques Les anomalies observées Cas Contrôles Méthodes statistiques

4. p. 4 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Comment identifier une anomalie génétique ? Phénotype Lanata caput héritable Génotype Mutation dans le gène TOUF Approche génétique classique Tissus biologiques disponibles Analyses génétiques Génotype Sélection génomique (des milliers de génotypes) Programmes « 1000 génomes » (des centaines de séquences) Approche génétique inverse Analyses statistiques / bioinformatiques Mutations Phénotype??

5. p. 5 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Exemples d’études d’anomalies touchant à la santé et au bien-être des ovins • Epidermolyse bulleuse, altération de la peau Approche de génétique classique • Dyskinésie ciliaire, syndrome respiratoire Approche de génétique inverse

6. p. 6 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique classique. Cas de l’Epidermolyse Bulleuse ovine Observation de cas Lésions sévères de la peau et des muqueuses Mort des agneaux Mouton Churra Epidermolyse bulleuse jonctionnelle https://www.eurogct.org/epidermolysisbullosa

7. p. 7 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique classique. Cas de l’Epidermolyse Bulleuse ovine Observation de cas Lésions sévères de la peau et des muqueuses Mort des agneaux Mouton Churra Collecte échantillons 28 cas atteints 28 sains Parenté connue Génotypage 50 000 SNP ITGB4 candidat Annotation du génome ovin Mutation récessive dans le gène ITGB4 Integrin ß4 (délétion 4pb exon 33) Test de diagnostic génétique GWAS Chromosome 11 (Suarez-Vega et al. PLOS One 2015) Epidermolyse bulleuse jonctionnelle Séquençage ITGB4

8. p. 8 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique classique. Cas de l’Epidermolyse Bulleuse ovine Observation de cas Lésions sévères de la peau et des muqueuses Mort des agneaux Mouton Vendéen Epidermolyse bulleuse jonctionnelle (Fabre et al. Anim. Genet. 2021) Test de diagnostic génétique (4200 animaux) Mutation récessive dans le gène ITGB4 (SNP exon 23, codon Stop) • Fréquence 12% de porteurs • Gestion pour limiter l’apparition de cas Collecte échantillons 6 cas atteints 4 frères ou soeurs sains 7 parents sains Génotypage Mutation candidate ITGB4 « Churra » Pas de porteur ITGB4 Recherche variants dans tous les gènes candidats connus (bibliographie E. bullosa) Séquençage génome complet

9. p. 9 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique inverse. Cas de la dyskinésie ciliaire ovine Génotype Sélection génomique (des milliers de génotypes) Programmes « 1000 génomes » (des centaines de séquences) Race ovine Lacaune Lait 35 000 (« puces » 15 000 ou 50 000 SNP) 31 génomes complets

10. p. 10 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 La transmission d’une anomalie génétique délétère avec un déterminisme récessif crée un biais dans la représentation des génotypes (déficit) Deux copies mutées donnent l’anomalie L’animal homozygote muté n’est jamais (ou très rarement) génotypé !!! On observe un déficit d’animaux homozygotes pour certaines régions du génome Génotypage (1 mois) Approche génétique inverse. Cas de la dyskinésie ciliaire ovine Phénotype délétère (possiblement létal)

11. p. 11 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique inverse. Identification du déficit en homozygotes Etape 1 – Identification d’haplotypes avec une fréq>1%  𝑃 − 𝑃𝑜𝑖𝑠𝑠𝑜𝑛 < 1,9 × 10 (5 ‰, nb chr ovins=26) ;  Déficit = de 75 à 100%  Regroupement des haplotypes de 20 marqueurs consécutifs avec les mêmes caractéristiques Deficient Homozygous Haplotype =DHH Etape 3 – Identification d’haplotypes en déficit Nombre de descendants homozygotes attendus Nombre de descendants homozygotes observés Etape 2 – Pour chaque haplotype, comparaison nombre d’animaux homozygotes Att et Obs

12. p. 12 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique inverse. Identification du déficit en homozygotes LDHH11, 4 et 6 LDHH9 Ben Braiek et al., GSE 2021  35 221 génotypages  31 703 informatifs  7 LDHH indépendants Lacaune 7 mutations potentielles causales d’anomalies génétiques récessives

13. p. 13 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique inverse. Analyse des bases de données « animal » Ben Braiek et al., GSE 2021 Embryons Fœtus Nouveau-né Jeune Fécondation Naissance gestation croissance de l’agneau Génotypage (1 mois) Taux de réussite à l’Insémination 0: brebis non gestante 1: brebis gestante Proxy pour de la perte embryonnaire Taux de mort-nés 0: pas de mort-né dans la portée 1: au moins un mort-né dans la portée Proxy pour la mortalité périnatale

14. p. 14 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique inverse. Analyse des bases de données « animal » Ben Braiek et al., GSE 2021 DHH/+ DHH/+ ? 12,5% de descendants DHH/DHH Acc. à risque vs Acc. non à risque (autres combinaisons) 1 155 835 accouplements (2006-2018) Utilisation d’un modèle logistique binaire pour comparer taux de réussite à l’Insémination et taux de mort-nés  Effet fixe à tester: Type d’accouplements (à risque ; non à risque)  Effets fixes: mois IA, numéro de lactation, prolificité (taux mort-nés) ? ~1% de descendants DHH/DHH ? 0% de descendants DHH/DHH ? 0% de descendants DHH/DHH DHH/+ +/+ +/+ +/+ DHH/+ +/+

15. p. 15 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique inverse. Analyse des bases de données « animal » LDHH6 et fréquent et porte une mutation récessive qui affecterait la viabilité périnatale Ben Braiek et al., GSE 2021

16. p. 16 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 En l’absence de matériel biologique d’animal homozygote, on cherche la mutation à l’état hétérozygote chez les porteurs Hypothèses: Fort déséquilibre de liaison entre l’haplotype et la mutation & spécifique de la race Lacaune 2 porteurs hétérozygotes de LDHH6 Nombreux non- porteurs (98) Alignement sur Oar_rambouillet_v1.0 (BWA v0.7.17-r1188) Détection variants (localisation) (GATK HaplotypeCaller) Annotation fonctionnelle des variants (SnpEff v4.3t) Nextflow v20.10.0 et Sarek pipeline v2.6.1 Approche génétique inverse. Analyse bio-informatique, bases de données « génome » 100 WGS Statut connu à LDHH6 69 moutons (14 autres races) 31 LAC Ben Braiek et al., Genes 2022

17. p. 17 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Extraction des variants de type SNP et InDels localisés dans la région LDHH6 ± 1 Mb LDHH6 -1 Mb +1 Mb Corrélation entre +/+ +/DHH DHH/DHH 0/0 0/1 1/1 Statut : Génotype : Annotation fonctionnelle variants prédits avec impact modéré à fort (SnpEff, PolyPhen ,SIFT) Corrélation=1 Approche génétique inverse. Analyse bio-informatique, bases de données « génome » Ben Braiek et al., Genes 2022

18. p. 18 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique inverse. Analyse bio-informatique, bases de données « génome » LDHH6 porte une mutation perte de fonction du gène CCDC65 (Coiled-Coil Domain Containing 65) CCDC65 Phénotype?? Ben Braiek et al., Genes 2022

19. p. 19 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Approche génétique inverse. Analyse bibliographique Rôle de CCDC65 dans le mouvement des structures ciliées Adapté de (Morohoshi et al., 2020 ; Gui et al., 2019 ; Horani et al., 2013 ; Poprzeczko et al., 2019 ; Kurkowiak et al., 2015) CCDC65 Syndrome humain de Dyskinésie ciliaire (OMIM 615504) détresse respiratoire néonatale, maladie des voies aériennes supérieures et inférieures récurrente et bronchectasie (infection).

20. p. 20 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 • Repérer les brebis issues de pères porteurs de LDHH6 dans les élevages (bases de données « animal ») • Prises de sang et génotypage spécifique CCDC65 des brebis (test de diagnostic génétique sur 2900 animaux, 14% de porteurs) • Réalisation et suivi des accouplements à risque de l’Insémination jusqu’à la naissance  DG par échographie à 45 jours  Biopsie auriculaire des agneaux nés (Pince TSU) / Génotypage CCDC65  Observations durant la croissance, Autopsie si mortalité Approche génétique inverse. Quelle est l’anomalie associée à CCDC65? CCDC65

21. p. 21 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Validation de la causalité par accouplements à risque mutation CCDC65 17 brebis Accouplements à risque Taux de réussite à l’IA 11 gestantes 6 vides 65% (~69% moy pop) Suivi des mises-bas (11 brebis) 16 agneaux Prolificité 1,5 Gestation: 139-159j 4 agneaux morts (taux de mortalité de 25%) (~10-15% moy pop) Naissance Fécondation (IA) croissance de l’agneau Sevrage (1 mois) Echographie J45-60 CCDC65 4 agneaux morts homozygotes (100% des agneaux morts sont liés à la mutation) Influence du génotype sur la viabilité G/G (n=5) GT (n=6) T/T (n=5) Total (n=16) Vivants 5 6 1 12 Morts - - 4 4 Ben Braiek et al., Genes 2022

22. p. 22 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 17 brebis Accouplements à risque Naissance Fécondation (IA) croissance de l’agneau Sevrage (1 mois) Echographie J45-60  Les agneaux homozygotes T/T ont un gain de poids quotidien plus faible (0-15j) et présentent des difficultés respiratoires (tachypnée) CCDC65 15 16 19 25 Mortalité juvénile ? Validation de la causalité par accouplements à risque mutation CCDC65

23. p. 23 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 CCDC65 Approche génétique inverse. Cas de la dyskinésie ciliaire ovine Autopsie des agneaux morts Système cœur-poumon Hépatisation des lobes pulmonaires Suspicion de pneumonie Perte du rôle de CCDC65 dans le mouvement des microtubules Alteration du mouvement des cils des voies aériennes Défaut excrétion du mucus Détresse respiratoire (i.e. tachypnée) Mort en lien avec l’insuffisance respiratoire et l’infection pulmonaire Infection bactérienne (effet de l’environnement) Dyskinésie ciliaire ovine Traitement chronique corticoïde + antibiotique Survie Ben Braiek et al., Genes 2022

24. p. 24 Webinaire UMT STAR 19 janvier 2023 Un grand merci à vous toutes et tous Maxime Ben Braeik

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