1. AVORTEMENTS des PETITS RUMINANTS :
une nouvelle PCR digitale multiplex
pour l’analyse des cas non élucidés
1
D. Bergonier1, C. Bauguil2, C. Fontaneil2, G. Ameziane2, L. Blanc2, L. Frayssinet2,
O. Maffre2, C. Pons2, L. Demesmay1, I. Gelin1, E. Genottin1, R. Brugidou2
1. Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse – Pathologie de la reproduction.
UMR INRAe-ENVT 1225 « Interactions hôtes-agents pathogènes »
(dominique.bergonier@envt.fr)
2. AVEYRON LABO.

2. • ENJEUX
• SITUATION ÉPIDÉMIOLOGIQUE
• AGENTS ABORTIFS
• NOUVELLE TECHNOLOGIE de PCR
• PREMIERS RÉSULTATS
• UTILISATION PROPOSÉE
AVORTEMENTS OVINS – PLAN
2

3. D’IMPORTANTS ENJEUX CONNUS …
Impact économique
“Bien-être animal”
Risque zoonotique
Règlementations
• Parmi les agents abortifs :
la majorité des bactéries et parasites sont zoonotiques
• Parmi l’ensemble des cas de zoonose en Europe (2021) :
- Sévérité :
ordre : 1- L. monocytogenes ; 2- Salmonella ; 3- STEC
(critère : incidence de cas mortels)
……
3

4. D’IMPORTANTS ENJEUX CONNUS et … MOINS CONNUS
Impact économique
“Bien-être animal”
Risque zoonotique
Règlementations
• Parmi les agents abortifs : majorité des bactéries et parasites
• Parmi l’ensemble des cas de zoonose en Europe (2021) :
- Sévérité
- Fréquences :
Campylobactériose :
• Sévérité : modérée (diarrhées,…)
donc sous-déclaration
• Espèces : C. jejuni > C. coli
> autres
• Cause : viande > lait (autres) :
viande : volailles, porcs > RMts
• Modalités :
- ingestion : contamination
fécale < portage intestinal
(+ cuisson insuffisante)
- > transmission (non alim.)
62%
(1er depuis
2007)
4

5. Impact économique
“Bien-être animal”
Risque zoonotique
Règlementations
Bonnes pratiques de maîtrise des avortements
D’IMPORTANTS ENJEUX EVOLUTIFS …
• Vaccins :
Conforter le crédit des vaccins auprès des éleveurs : étiologie avérée
• Antibiothérapie :
o “Réflexe TLA” historique (tétracyclines longue action) depuis 50 ans
o Evolutions associées : Tétracyclines
- antibiorésistance marquée des bactéries Gram + et –
Cf Résapath
- exemple de Campylobacter spp. (avortements) :
Prévalences historiques :
C. fetus fetus >> C. jejuni
(pays Anglo-Saxons)
Prévalences actuelles : C. jejuni >> C. fetus fetus
• Etats-Unis (Ov > Bv, Cp) :
- 1 clone dominant, hypervirulent,
devenu 1ère cause d’avortements (Ov)
- espèce historiquement sensible,
aujourd’hui clone résistant (TétraC.)
- clone zoonotique
- fort usage des TétraC (avortements) : voie orale, …
• GB, Nouvelle-Zélande :
- clones diversifiés en majorité Sensibles aux TétraC.
- “faible usage des TétraC”
• France ?
Clones
diversifiés
(jusqu’aux
années 2000)
Clone SA (Sheep Abortion)
(Wu et al., 2014)
5

6. Impact économique
“Bien-être animal”
Risque zoonotique
Règlementations
Bonnes pratiques de maîtrise
D’IMPORTANTS ENJEUX EVOLUTIFS… et RESTRICTIFS
• Vaccins :
Conforter le crédit des vaccins auprès des éleveurs : étiologie avérée
• Antibiothérapie :
o “Réflexe TLA” historique
o Evolutions associées (tétracyclines)
o Bactéries abortives intra-cellulaires (Chlamydia, Coxiella, …) :
- ABrésistance mal connue (TétraC.) (Bommana et al., 2019)
- Quelle alternative aux TétraC. ? (ABthérapie sur avortements)
o Nouveau Règlement UE relatif aux médicaments vétérinaires
depuis janvier 2022 (2019/6) :
• Utilisation PRÉVENTIVE des AB : non autorisée
• Utilisation MÉTAPHYLACTIQUE sous conditions :
- « si aucune autre solution appropriée n’est disponible »
- « la prescription nécessite une justification et un diagnostic de la maladie … »
- …
R. UE 2019/6 sur les médicaments vétérinaires – Articles 107.4 et 107.5
6

7. Réseau OSCAR * (2020 et 2021)
1 3
Taux d’élucidation :
54 et 62%
(2020 et 2021)
2021
Maladies recherchées :
• 1ère intention :
Fièvre Q, Toxoplasmose,
Chlamydiose au minimum
• 2ème intention :
en moyenne 1,1 et 1,2 (Ov),
et 1,1 et 1,3 maladies (Cp)
Une SITUATION EPIDEMIOLOGIQUE partiellement CONNUE
* Observatoire et suivi des causes d’avortements
chez les ruminants. 20 départements (Ov, Cp) 7

8. Réseau OSCAR * (2020 et 2021)
2 1 3
Taux d’élucidation :
54 et 62%
(2020 et 2021)
Taux d’élucidation :
47 et 55%
(2020 et 2021)
2 1
3
2021
2021
Maladies recherchées :
• 1ère intention :
Fièvre Q, Toxoplasmose,
Chlamydiose au minimum
• 2ème intention :
en moyenne 1,1 et 1,2 (Ov),
et 1,1 et 1,3 maladies (Cp)
Une SITUATION EPIDEMIOLOGIQUE partiellement CONNUE
* Observatoire et suivi des causes d’avortements
chez les ruminants. 20 départements (Ov, Cp)
8

9. DIAGNOSTIC
ÉTIOLOGIQUE
Informations
épidémiologiques,
nécropsiques, …
Amélioration
des procédures
de prélèvements
Optimisation
des ANALYSES
Financement
Suivi de
procédures :
diagnostic et
imputabilité
• Type
• Temporalité
• Nombre
• Cinétiques
• Qualité
• …
COMMENT AMÉLIORER le DIAGNOSTIC ÉTIOLOGIQUE ?
• Vétos :
- arbres décisionnels
- conditions d’imputabilité
- +/- cohortes Avortée et non A.
- connaissance des tests, …
• Labos :
- conservation des ADN
(cas non élucidés)
- quantification
interprétée, …
• PCRs : 2ème intention
• Cultures
• Sérologies, …
• combinaison

10. • ENJEUX
• ÉPIDÉMIOLOGIE
• AGENTS ABORTIFS :
- Liste d’agents avérés ou potentiels
- Cibles de la PCR multiplex
• NOUVELLE TECHNOLOGIE de PCR
• PREMIERS RÉSULTATS
• UTILISATION PROPOSÉE
AVORTEMENTS OVINS – PLAN
10

11. 11
Agent abortif 1ère intention 2ème intention
Coxiella burnetii -
Chlamydia abortus pecorum, (psittaci ?)
Waddlia chondrophila, …?
Salmonella S. Abortusovis autres sérovars
Campylobacter - fetus fetus, jejuni,
coli, lari, … (?)
Yersinia - pseudotuberculosis, enterocolitica, …
Listeria - monocytogenes, ivanovii, …
Leptospira - divers sérovars
Mollicutes - Mycoplasma agalactiae, bovigenitalium, mycoides capri, …
Mycoplasma ovis (?), … Ureaplasma spp., …
Anaplasmes - phagocytophilum, ovis, bovis, capra, (marginale ?), …
Ehrlichia canis, …
T. pyogenes Brucella ovis ? Bacillus sp. ?
Helicobacter spp. Streptocoques ? F. necrophorum ?
E. coli Arcanobacterium pluranimalium Pasteurella spp.
Objectif : augmenter le taux d’élucidation
Une LISTE TRÈS LARGE D’AGENTS ABORTIFS
Agents abortifs :
• espèces ou
sérovars avérés
ou potentiels
• de fréquence
variable
• à l’origine
de tableaux
épidémiologiques
variables
(épizootiques,
enzootiques
ou sporadiques)
Synthèse bibliographique (à visée “exhaustive”)
Agents rares
et/ou à l’origine
d’avortements sporadiques
BACTERIES :
11

12. Une LISTE TRÈS LARGE D’AGENTS ABORTIFS
Synthèse bibliographique
PARASITES :
Cause 1ère intention 2ème intention
Toxoplasma gondii
Neospora - caninum
Sarcocystis - spp.
Theileria - spp.
…
Mycoses - A. fumigatus, …
Border disease - BDV
Blue Tongue - BTV
Schmallenberg - SBV
Herpesvirus - BoHV1, BoHV4 ?
(Simbu) - ?
… +/- +/-
VIRUS :
Agents abortifs :
• avérés
• de fréquence
variable
• tableaux
épidémiologiques
variables
12

13. 13
Une LISTE TRÈS LARGE D’AGENTS ABORTIFS …
Vet. Med. Sci, 2021
Trop. Anim. Health Prod., 2018
Vet. Path., 2021
… dont certains de prévalence méconnue ou inconnue en France,
et non recherchés – Exemples :

14. Etapes successives :
• 2022-2023 :
PCR de format 1 –
Exploratoire
1. Détection large
des principaux
agents
à l’échelon des
genres ou familles :
PCR “semi-ouverte”
2. Différenciation
d’espèce
(PCR spécifiques
ou séquençage)
3. Elargissement possible
à d’autres cibles
(sur ADN négatifs)
Une LISTE LARGE de CIBLES pour la nouvelle PCR multiplex
Cause bactérienne, parasitaire PCR :
échelon de la cible retenue
1 Chlamydia abortus, pecorum, … Famille des Chlamydiaceae
2 Sporozoaires : Toxoplasma, Neospora,
Sarcocystis, …
Famille des Sarcocystidae
3 Salmonella spp. Genre Salmonella
4 Campylobacter fetus fetus,
C. jejuni (C. coli, … )
Genre Campylobacter
5 Yersinia pseudotuberculosis,
Y. enterocolitica, …
Genre Yersinia
6 Listeria monocytogenes,
L. ivanovii, …
Genre Listeria
7 Leptospira spp. Genre Leptospira
8 Mycoplasmes, Uréaplasmes, … Plusieurs genres : Mycoplasma (dont
hémoplasmes), Ureaplasma, …
9 Anaplasma spp., Ehrlichia spp., … Famille des Anaplasmataceae
• 2023-2024 : PCR de format 2 – Utilisation régulière
- Restriction possible : adaptation aux incidences obtenues (par région …), à la “demande”, …
- Spéciation directe possible, … 14

15. “Diviser pour mieux amplifier …”
Une NOUVELLE TECHNOLOGIE : la PCR DIGITALE
Fractionnement jusqu’en dilution limite
Cible
ADN autre
S
Plusieurs milliers de micro-compartiments
indépendants, avec dilutions,
donc peu d’effet des cibles concurrentes ou des
inhibiteurs :
- sensibilité accrue
- précision augmentée
- moindre sensibilité aux inhibiteurs
- reproductibilité
15

16. “Le nombre fait la force”
Une NOUVELLE TECHNOLOGIE : la PCR DIGITALE
Fluorescence
(+ ou -) :
% de +,
puis
quantification
« absolue »
précise
(sans courbe
d’étalonnage)
Milliers de PCR
individuelles
(en point final)
16

17. • ENJEUX
• SITUATION ÉPIDÉMIOLOGIQUE
• AGENTS ABORTIFS
• NOUVELLE TECHNOLOGIE de PCR
• PREMIERS RÉSULTATS
• UTILISATION PROPOSÉE
AVORTEMENTS OVINS – PLAN
17

18. PCR digitale en phase de lancement :
Premiers résultats obtenus sur séries abortives non (ou mal) élucidées
(à partir d’organes d’avortons) :
• Quelques positivités, sporadiques à ce jour :
- Yersinia spp.
- Salmonella enterica enterica (divers sérovars), enterica subsp. diarizonae
- Campylobacter fetus fetus
- …
• Nombreuses positivités pour Campylobacter jejuni :
2 zones analysées (avril 2023) :
- au fil de l’eau :
bassin de Roquefort :
n=8 élevages positifs
- a posteriori (cas non élucidés) :
autre département (élevage viande) :
n=5 élevages positifs sur 11
PREMIERS RÉSULTATS OBTENUS
 1 exemple type pour illustrer le potentiel de la dPCR
18
C. jejuni

19. PREMIERS RÉSULTATS OBTENUS : C. jejuni, 1 exemple
2021 :
Approche
traditionnelle :
- Agents de 1ère
intention
uniquement
- Négativités =>
cas demeuré
“non élucidé”
2023 :
- Priorité aux
organes (5 avortons)
- Mise en évidence
de C. jejuni en
culture (organes)
et en dPCR
(écouvillons et
organes)
1. Etape de diagnostic étiologique
Elevage laitier (N = 1 500 brebis) et allaitant (N = 250 brebis)
2 épisodes d’avortements (brebis laitières) : 2021 (adultes et agnelles) et 2023 (agnelles)
• Etablissement du diagnostic étiologique
19
Date Animal Echantillon Statut Culture
(avorton)
PCR
Toxo
PCR
FQ
PCR
Chlamydia
PCR digitale :
Campylobacter
14/01/2021 16286291203 écouvillon et encéphale Avortée Neg Neg Neg
14/01/2021 16286280230 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg Neg
14/01/2021 16286280109 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg Neg
14/01/2021 16286290281 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg
14/01/2021 16286280459 écouvillon vaginal Avortée Neg
26/01/2021 16286250623 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg
26/01/2021 16286291192 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg
26/01/2021 16286290524 écouvillon vaginal Avortée Neg
26/01/2021 16286290100 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg
26/01/2021 mélange encéphale Avortée Neg
20/01/2023 16286223401 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg Neg +++
20/01/2023 16365523252 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg Neg +++
20/01/2023 16286222446 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg Neg +
20/01/2023 16365523470 écouvillon vaginal Avortée Neg Neg Neg +++
20/01/2023 avorton 1 et 2 liqu stomac, encéphale Avorton C. jejuni Neg Neg Neg
23/02/2023 avorton 3 liqu stomac, poumon, foie Avorton C. jejuni Neg Neg Neg +++
23/02/2023 avorton 4 liqu stomac, poumon, foie Avorton C. jejuni Neg Neg Neg +++
23/03/23 avorton 5 liqu stomac, poumon, foie Avorton C. jejuni Neg Neg Neg +++

20. Avorton
Organe A B C
Rate 20 12 10
Foie 12 26 94
Poumon 255 684 138
Liquide Stomacal 10449 2367 19500
PREMIERS RÉSULTATS OBTENUS : C. jejuni, 1 exemple
• Etablissement du diagnostic initial : prélèvements de choix
o Différences fréquentes de titre bactérien
entre organes :
Nombre de copie de la séquence-cible /µL
20
 C. jejuni passe la barrière placentaire
 Intérêt d’une quantification « absolue » comparative :
• entre organes ou matrices
• entre microorganismes (multi-positivités possibles)

21. C. jejuni (Sanad et al., 2014)
Hydrothorax
GB.
o Lésions évocatrices possibles :
Avorton
Organe A B C
Rate 20 12 10
Foie 12 26 94
Poumon 255 684 138
Liquide Stomacal 10449 2367 19500
PREMIERS RÉSULTATS OBTENUS : C. jejuni, 1 exemple
Etablissement du diagnostic initial : prélèvements de choix
o Différences fréquentes de titre bactérien
entre organes
Nombre de copie /µL
21

22. PREMIERS RÉSULTATS OBTENUS : C. jejuni, 1 exemple
Brebis avortées versus
non avortées (2023) :
• Ecouvillons vaginaux
- Comparaison tardive
(+ 2 mois)
- Insuffisance de la
culture !
- dPCR : fréquence et
titres supérieurs pour
les avortées,
mais portage global
1. Etape de diagnostic étiologique
• Approfondissement (en vue du plan de lutte) : comparaison de cohortes
• (réalisé aussi) Ecouvillons rectaux : évaluation comparative
du portage intestinal et de la contamination de la bergerie 22
 1 ou 2 écouvillonnages vaginaux
sont en général insuffisants
pour un diagnostic étiologique
d’avortement (quelle que soit la
cause)
 Infection de type “vénérien”

23. Quantification comparée
entre :
• l’eau à l’arrivée dans
l’élevage (origine de la
contamination ?) :
- réseau (32 copies/µL)
- ressources privées
(sources, …)
• l’eau des abreuvoirs en
bergerie ou à l’extérieur
(réservoir-relais ?)
Applications :
contamination forte à massive
des jeunes agnelles,
des béliers avant la lutte
 à contrôler
Bergerie Quantification (copie /µL)
Brebis viande (extérieur)-1 0
Brebis viande (extérieur)-2 0
Bergerie principale (laitières)-1 743
Bergerie principale (laitières)-2 690
Bergerie annexe : agnelles-1 2858
Bergerie annexe : agnelles-2 1821
Bergerie annexe : béliers-2 2093
Bergerie annexe : béliers-1 13116
Avortements :
Troupeau viande,
(extensif) : pas
d’avortements
Troupeau laitier
(en bergerie) : pas
d’avortements des
multipares
Troupeau de
renouvellement
(bergerie séparée) :
avortements des
primigestes
PREMIERS RÉSULTATS OBTENUS : C. jejuni, 1 exemple
2. Etape d’analyse épidémiologique
(réservoirs primaires, réservoirs-relais, transmission, …),
en vue de préciser le plan d’action
• Contaminations différenciées de l’eau de boisson par une Entérobactérie de portage
(Campylobacter, Salmonella, Yersinia, coliformes, …) :
23

24. Béliers (écouvillonnage génital) Quantification (copie /µL)
jeune 1026
jeune 3046
jeune 3111
vieux 20
vieux et balanoposthite 1220
vieux et balanoposthite 1236
PREMIERS RÉSULTATS OBTENUS : C. jejuni, 1 exemple
2. Etape d’analyse épidémiologique
• Evaluation du portage
génital par les béliers
en fonction de leur âge
et des lésions existantes :
portage préputial généralisé
(monte naturelle : 100%)
24

25. Béliers (écouvillonnage génital) Quantification (copie /µL)
jeune 1026
jeune 3046
jeune 3111
vieux 20
vieux et balanoposthite 1220
vieux et balanoposthite 1236
Fèces en bergerie (annexe) Quantification (copie /µL)
Oiseaux 17
Rats 20830
PREMIERS RÉSULTATS OBTENUS : C. jejuni, 1 exemple
2. Etape d’analyse épidémiologique
• Evaluation du portage
par les béliers :
portage préputial généralisé
(monte naturelle : 100%)
• Evaluation du rôle de la faune commensale (bergerie) :
portage massif par les rats
(bergerie des agnelles avortées seulement)
25
PCR digitale : micro-compartiments positifs

26. 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Am
oxicilline
Am
ox. +
Ac Clav.
Cefalexine
Cefoxitine
Ceftiofur
Cefquinom
e
Gentam
ycine
Streptom
ycine
Ac. Nalidixique
Enrofloxacine
Tétracycline
Colistine
Florfenicol
TM
PS
Erythrom
ycine
PREMIERS RÉSULTATS OBTENUS : C. jejuni, 1 exemple
• Echecs sévères de
traitement
(Aveyron, 2022)
• Antibiogrammes :
de nombreuses
résistances, naturelles
et acquises,
en particulier aux
tétracyclines
3. Etape thérapeutique
Antibiosensibilité de souches de C. jejuni isolées d’avortons (n=10)
(méthode des disques).
 ABGrammes
obligatoires
 CMI à venir
 Privilégier la prévention :
prophylaxie sanitaire avant tout 26
%

27. CONCLUSION : UTILISATION PROPOSÉE (dPCR multiplex)
Indications :
• Avortements, morti- et morbi-natalité, agneaux chétifs, …
• Métrites, subfertilité, vulvo-vaginites, balano-posthites, …
Signes d’appel :
• Séries abortives non (ou mal) élucidés :
o résultats négatifs ou douteux, multi-positivités à éclaircir
o résistance aux traitements antibiotiques, “échecs vaccinaux” présumés, …
Utilisations proposées
• Labos d’analyse : au fil de l’eau, et/ou a posteriori (bilan de fin de campagne, …)
• Vétérinaires praticiens (après négativité vis-à-vis des agents de 1ère intention)
• …
Cadre :
• ADN ou échantillons (+ sérums) à envoyer à Aveyron Labo (DA spécifique à demander avant)
• Etude en cours (thèses vétérinaires)
• Gratuité des dPCR associée à la phase de lancement (2022-2023),
au titre d’analyses de 2ème intention