1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29919
(51) A01H 4/00 (2006.01)
A01G 7/00 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0889.1
(22) 30.06.2014
(45) 15.06.2015, бюл. №6
(72) Кириллов Виталий Юрьевич; Стихарева
Тамара Николаевна; Муканов Болат Мажитович;
Манабаева Акмарал Узакбаевна; Дауленова
Мейржан Жакыповна
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский институт лесного хозяйства и
агролесомелиорации"
(56) Sargsyan Е., Vardanyan A., Ghalachyan L.,
Bulgadaryan S. Cultivation of Thymus by in vitro and
hydroponics combined method. World Academy of
Science, Engineering and Technology, 2011, p. 129-132
(54) СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО
РАЗМНОЖЕНИЯ ТИМЬЯНА ПОЛЗУЧЕГО
(THYMUS SERPYLLUM L.) IN VITRO
(57) Изобретение относится к биотехнологии
выращивания растений, в частности к размножению
тимьяна ползучего и может быть использовано для
ускоренного массового размножения и получения
лекарственного сырья ценных форм тимьяна
ползучего, а также сохранения ценного генофонда.
Задача изобретения - разработать способ
микроклонального размножения тимьяна ползучего
(Thymus serpyllum L.) in vitro.
Используются в качестве эксплантов нодальные
сегменты активно растущих побегов выделенных
форм тимьяна ползучего, проводится их
стерилизация и культивирование на питательной
среде Нича и Нич (NN), не содержащей регуляторов
роста. Выявлено, что полноценные растения
тимьяна ползучего получаются на 40-45 сутки, их
приживаемость достигает 98-99%.
(19)KZ(13)A4(11)29919

2. 29919
Изобретение относится к биотехнологии
выращивания растений, в частности к размножению
тимьяна ползучего и может быть использовано для
ускоренного массового размножения и получения
лекарственного сырья ценных форм тимьяна
ползучего. Кроме того достигается сохранение
генофонда видов и форм.
Известны различные способы размножения
тимьяна ползучего (Thymus serpyllum L.), в
частности, способ вегетативного размножения
стеблевыми черенками [Iapichino G., Arnone С,
Bertolini М., Amico Roxas U. Propagation of three
Thymus species by stem cuttings // Acta Hortic. - 2006.
- Vol. 723. - P. 411-414.]. Способ заключается в
укоренении растений при обработке экзогенным
ауксином - 0,05%-ным раствором ИМК. Далее
черенки высаживаются в горшки со смесью торфа и
перлита. Затем растения выращиваются в теплице,
накрытой полиэтиленом, основание теплицы
подогревается. Недостатком данного метода
является низкий выход растений-регенерантов,
поскольку для размножения берутся стеблевые
черенки.
Наиболее близким к заявляемому является
способ размножения тимьяна ползучего с
использованием комбинированного метода in vitro и
гидропоники [Sargsyan Е., Vardanyan A., Ghalachyan
L., Bulgadaryan S. Cultivation of Thymus by in vitro
and hydroponics combined method // World Academy
of Science, Engineering and Technology. - 2011. - Vol.
56. - P. 129-132.]. Он заключается в следующем:
экспланты для микроразмножения длиной 0,4-0,5 см
(апикальные сегменты проростков, образовавшиеся
из проросших семян) помещаются на питательную
среду 1
∕2MS, содержащую уменьшенное вдвое
содержание микро- и макроэлементов, с
добавлением 0,1 мг/л ИМК. Через 7-10 дней
наблюдается образование корней. Образование
микрорастений наблюдается на 28-30 день,
коэффициент мультипликации равен 1:5. То есть
при получении первоначальных микрорастений
используется метод клонального микроразмножения
с активацией пазушных почек, который
основывается на снятии апикального
доминирования. Далее полученные микрорастения
разрезаются на нодальные сегменты и снова
субкультивируются на питательной среде Мурасиге
и Скуга (MS) с добавлением 0,1 мг/л ИМК. После 7-
10 дней субкультивирования ризогенез составляет
98-99%. Длина микрорастений составляет 7-8 см
после 28-30 дней субкультивирования, и
коэффициент мультипликации равен 1:6. По
данному способу из одного экспланта можно
получить в течение 9 месяцев 30 000
микрорастений. Процент приживаемости без
акклиматизации в условиях гидропоники составляет
93,3%.
В этом способе размножения тимьяна ползучего,
принятого за прототип, в качестве эксплантов
используется семенной материал, генотип
материнского растения которого не сохраняется и,
соответственно, не сохраняются ценные признаки и
свойства выделенных форм. Кроме того данный
способ отличается своей дороговизной, так как
используется наряду с микроклональным
размножением, еще и метод гидропоники.
Для устранения указанных недостатков была
поставлена задача разработки способа
микроклонального размножения тимьяна ползучего
in vitro, который позволит в короткие сроки, без
регулярного пассирования и добавления
фитогормонов, а, следовательно, и дополнительных
затрат на химические реактивы, получить
полноценные растения-регенеранты
Техническим результатом является увеличение
выхода растений in vitro за более короткие сроки.
Это достигается за счет стерилизации нодальных
сегментов побегов, а также введения в процесс
культивирования питательной среды Нича и Нич
(NN) [3], не содержащей регуляторов роста, что
обеспечивает формирование полноценных растений
на 40-45 сутки, т.е. происходит ускорение процесса
практически на 1/3.
Таблица
Сравнение способов микроклонального размножения тимьяна ползучего
№ Характеристика Способ с использованием
комбинированного метода in vitro
и гидропоники
Предложенный
способ
1 Первоначальный тип экспланта апикальные сегменты проростков,
образовавшиеся из проросших
семян
нодальные сегменты
активно растущих побегов
2 Питательная среда MS и 1
∕2MS NN
3 Добавление регуляторов роста для
образования корней
0,1 мг/л ИМК -
4 Количество этапов 2 1
5 Продолжительность этапов (в днях) 1 этап - 28-30
2 этап - 28-30,
т.е. всего два этапа в 56-60 дней
1 этап - 40-45, т.е. всего
один этап в 40- 45 дней
6 Коэффициент мультипликации 1 этап - 1:5
2 этап - 1:6
1 этап - 1:9
7 Длина побегов, см После 2 этапа - 7-8 9-10
8 Частота укоренения, % 98-99 92,5

3. 29919
№ Характеристика Способ с использованием
комбинированного метода in vitro
и гидропоники
Предложенный
способ
9 Количество микрорастений из 1
экспланта за 9 мес., штук
30 000 более 100 000
10 Процент приживаемости 93,3% без акклиматизации в
условиях гидропоники
98-99% с акклиматизацией
без гидропоники
Предложенный способ значительно удешевляет
процесс получения регенерантов, так как позволяет
получать полноценные растения в 1 этап за 40-45
дней, коэффициент мультипликации составляет 1:9,
что позволяет получить из 1 экспланта за 9 месяцев
более 100 000 штук растений, приживаемость с
акклиматизацией составляет 98-99%. Также данный
способ не требует использования экзогенных
регуляторов роста и применения гидропоники для
акклиматизации.
Сущность изобретения состоит в том, что
исследователь использует в качестве эксплантов
нодальные сегменты активно растущих побегов
выделенных форм тимьяна ползучего, проводит их
стерилизацию, культивирует на питательной среде
Нича и Нич (NN), не содержащую регуляторов
роста, и получает на 40-45 сутки полноценные
растения тимьяна ползучего.
Исходя из анализа известного уровня техники по
данному вопросу, сделан вывод об отсутствии
информации по микроклональному размножению
тимьяна ползучего in vitro с использованием в
качестве эксплантов активно растущих побегов и
культивированием их на питательной среде Нича и
Нич (NN), что позволяет сделать вывод о
соответствии предлагаемого технического решения
требованиям «новизны».
В настоящее время поставленная задача по
микроклональному размножению тимьяна
ползучего in vitro очень актуальна, так как несмотря
на то, что тимьян ползучий является одним из
доминантов степных сообществ, тем не менее, в
виду значительного сокращения естественных
степей вследствие антропогенного воздействия
(освоение целинных земель, нерегулируемая
рекреация, пасквальная деградация и др. виды
нарушений) в Казахстане ареал этого вида
существенно сокращается. Поэтому важным
вопросом является разработка различных путей
сохранения этого ценного степного растения.
Микроклональное размножение тимьяна ползучего
in vitro является одним из оптимальных решений
данного вопроса и найдет широкое применение на
практике, поэтому предлагаемое техническое
решение соответствует требованию «промышленная
применимость».
Пример. Активно растущие побеги длиной 5,0-
5,5 см срезают со взрослых выделенных естественно
произрастающих форм тимьяна ползучего.
Стерилизацию побегов проводят в несколько
этапов: выдерживают в течение 5 минут в
концентрированном мыльном растворе, затем в
растворе «Белизны» (1 часть отбеливателя к 5
частям воды) (активный компонент - хлор) в
течение 5 минут, далее 5 минут под проточной
водой, после этого в асептических условиях
выдерживают 3 минуты в 0,025%-ном растворе
мертиолята (тимерозал) (активный компонент -
ртуть) в сочетании с «Белизной». После 5 минут
ополаскивания в стерильной дистиллированной
воде, побеги разделяют на нодальные сегменты
длиной 1,0-1,5 см и помещают в стеклянные
пробирки размером 2×15 см, содержащие 15 мл
питательной среды. Культивирование нодальных
сегментов проводят на искусственной питательной
среде Нича и Нич (NN), не содержащую
регуляторов роста, следующего состава, в мг/л:
макроэлементы - калия нитрат 950, аммония нитрат
720, калия дигидрофосфат 68, магния сульфат 7-
водный 185, кальция хлорид 166; микроэлементы -
марганца сульфат 4-водный 25, борная кислота 10,
цинка сульфат 7-водный 10, меди сульфат 5-водный
0,025, натрия молибдат 2- водный 0,25; хелат железа
- железа сульфат 7-водный 27,8, трилон Б 37,3;
мезоинозит 100; глицин 2; тиамин-НСl 0,5;
никотиновая кислота 5,0; пиридоксин-НСl 0,5;
фолиевая кислота 0,5; биотин 0,05; сахароза
10 000-30 000; агар 6 000-7 000; pH питательной
среды 5,5.
Автоклавирование проводят при 121°С в течение
20 минут (давление 1,1-1,4 кг/см2
). Рост и развитие
растений проходит в культуральной комнате при
температуре 23±2°С, влажность воздуха - 65-70%,
фотопериод 16/8 часов свет/темнота, освещенность
3-5 клк, лампы дневного света флуоресцентные
белые.
На данной питательной среде Нича и Нич (NN)
наблюдалось интенсивное побегообразование и рост
побегов в длину. Цвет побегов был светло-зеленым.
На 40-45 сутки культивирования тимьяна ползучего
на данной питательной среде средняя длина побегов
составляет 9-10 см, частота укоренения - 92,5%,
средняя длина корней - 1,5-1,9 см. Коэффициент
мультипликации равен 1:9. Приживаемость
клонированных растений при акклиматизации
составляет 98-99%.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ микроклонального размножения тимьяна
ползучего (Thymus serpyllum L.) in vitro,
включающий получение микропобегов, их
микрочеренкование, получение из микрочеренков
побегов, их размножение, укоренение и адаптацию к
нестерильным условиям среды растений-
регенерантов, отличающийся тем, что в качестве
эксплантов используют нодальные сегменты
активно растущих побегов выделенных форм
тимьяна ползучего, культивирование проводят на
питательной среде Нича и Нич (NN), не

4. 29919
содержащую регуляторов роста, что обеспечивает
формирование из эксплантов полноценных растений
в один этап на 40-45 сутки и их приживаемость до
98-99%.
Верстка Н.Киселева
Корректор Р.Талькенов