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MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Vicente Medina Reus 2012
La observación directa es el primer paso en la investigación pero… ¿se ve lo que se mira?
“ El ciego se entera mejor de las cosas del mundo, los ojos son una ilusión embustera” José Mª del Valle Inclán 10 -3  m 10 3  m MICROSCOPIO TELESCOPIO Concepto Microscopía óptica y electrónica Construcción (partes) de un ME Microscopía y resolución Tipos de ME: TEM y SEM Interacción de los e- con la materia Aplicaciones Preparación de muestras al TEM Contraste. Sombreado Fijación, Deshidratación, Iinfiltración Ultramicrotomía Imágenes TEM Preparación de muestras al SEM Vaporización Imágenes SEM Microanálisis Rayos-X Combinación TEM y SEM Otras microscopías
electrones en lugar de fotones o luz visible MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst  Ruska  y  Max Knoll  entre 1925 y 1930, basándose en los estudios de  Louis-Victor de Broglie  sobre las propiedades ondulatorias de los electrones MET de la UdL
SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS ENTRE M. ÓPTICA Y M. ELECTRÓNICA observación lentes formación Imagen objetivos condensador Fuente de “iluminación” espécimen (muestra) Los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible por lo que permiten mostrar estructuras mucho más pequeñas MICROSCOPIO ÓPTICO MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
Las partes principales de un microscopio electrónico de transmisión TEM son: CAÑÓN DE ELECTRONES , que emite los electrones que chocan o atraviesan el espécimen (dependiendo que tipo de microscopio electrónico es), creando una imagen aumentada. LENTES MAGNÉTICAS  para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones. SISTEMA DE VACÍO  es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. PLACA FOTOGRÁFICA  o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. SISTEMA DE REGISTRO  que muestra la imagen que Producen los electrones, que suele ser un ordenador
CONSTRUCCIÓN DEL TEM Los electrones se producen generalmente en un filamento, normalmente de tungsteno, parecido al de una bombilla, mediante un proceso conocido como emisión termoiónica o bien mediante emisión de campo. Los electrones emitidos se aceleran entonces con ayuda de un potencial eléctrico (medido en V, o voltios) y se focalizan mediante lentes electrostáticas o electromagnéticas.
 
RESOLUCIÓN MINIMA DISTANCIA ENTRE DOS PUNTOS DE UNA MUESTRA PARA QUE PUEDAN SER DISTINGUIDOS COMO TALES Poder de resolución (R)   R = 0.61    / n sen       =   longitud de onda de iluminación n   =   índice de refracción    =   semiángulo de apertura del haz incidente     = h / mV h = constante de Planck m = masa de e - V = velocidad de e - Ej.: para V = 60.000 V;   = 0.05 nm, la R es de 0.2 nm
TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS Transmission electron microscope (TEM)  Scanning electron microscope (SEM)  TRANSMISIÓN BARRIDO O RASTREO e - e - e - e -
Interacción de los e -  con la materia
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO Aceria ficus  en el envés de una hoja de higuera Microanálisis de un mineral
PRESTACIONES O POSIBILIDADES
Preparación y observación de muestras para TEM
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Rejillas de cobre, oro, platino Soporte muestras Portaobjetos
CONTRASTE (TINCIÓN) DE SOLUCIONES O PURIFICADOS TINCIÓN SENCILLA : acetato de uranilo, ácido fosfotúngstico, heptamolibdato amónico, citrato de plomo Tobamovirus Geminivirus Potyvirus Contraste positivo Contraste negativo Contraste negativo + positivo
Fotografía electrónica (TEM, tinción negativa con acetato de uranilo) del viroide del tubérculo fusiforme de la patata (flechas) comparada con el DNA de doble cadena de un virus bacteriófago (bacteriófago T7) (T. Koller y M. Sogo)
Microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa SOMBREADO DE SOLUCIONES O PURIFICADOS Microscopía electrónica de transmisión con sombreado Vaporización de un metal pesado sobre en ángulo) la muestra El material evaporado sigue una línea recta en alto vacío Muestra Vapor de metal Superficie del espécimen cubierta por el metal Sombra Sombra 1 Sombra 2 Ángulo 1 Ángulo 2 Bomba vacío Superficie del virión  Cubierta con metal Sombra ángulo 1 Sombra ángulo 2
FASES DEL PROCESODE PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA TEM ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
FIJACIÓN ¿Objetivo? Preservar la estructura de la materia viva sin alterarla ¿Cómo? Mediante entrecruzamientos/ligamientos transversales de lípidos y proteínas principalmente FACTORES pH osmolaridad constitución iónica temperatura tiempo de fijación tamaño de la muestra Medio FIJADORES  TAMPONES Tetróxido de osmio Tetróxido de rutenio Aldehídos:  formaldehído glutaraldehido Acroleína Permanganato potásico Permanganato sódico Fosfato Cacodilato Veronal acetato Colidina
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],INFILTRACIÓN
ULTRAMICROTOMO Cuchillas de vidrio p diamante Rejillas de cobre (estándar), o de oro/platino para inmunomarcaje
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ANALÍTICA DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
IMÁGENES COLOREADAS AL TEM (falso color) Salmonella typhimurium  Virus de la gripe aviar A H5N1 Célula de mamífero
Lettuce infectious yellows virus  (LIYV) Tian, T, Rubio, L, Yeh, HH, Crawford, B, Falk, BW. 1999. Lettuce infectious yellows virus: in vitro acquisition analysis using partially purified virions and the whitefly Bemisia tabaci. J Gen Virol 1999 80: 1111-1117  Agranovsky, A.A., Lesemann, D.E., Maiss, E., Hull, R., Atabekov, J.G. 1995"Rattlesnake" structure of a filamentous plant RNA virus built of two capsid proteins.  Proc Natl Acad Sci U S A.  March 28; 92(7): 2470–2473.  CP CP CPm CPm Beet yellows virus  (BYV)
INMUNOMARCAJE COMBINACIÓN DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN Y LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICAS BASADAS EN LA REACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO INMUNOMARCAJE CON ORO COLOIDAL Marcaje de la proteína LAMP-1 en la membrana de un cuerpo multivesicular de una célula HepG2 Marcaje de residuos de manosa 6-fosfato en el interior d lisosomas de los linfoblastos
Preparación y observación de muestras para SEM Granos de polen
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Cicadulina mbila  NAUDE Brocosomas: gránulos de naturaleza proteica secretados por los tubos de Malpigio de los cicadélidos
A. Célula. B. TEM-criofractura de la mezcla BHPB/C6H12 (2 %). Barra = 100 nm CRIOFRACTURA Congelar en propano Cuchilla de acero Línea de fractura Réplica Hielo Hielo Fuente de carbono o platino (ángulo)
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BSE Si Fe Ni P Ti Combinación de imágenes: electrones retrodispersados (BSE) y análisis de rayos X en mineralogía
SCANNING TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE (STEM) A.  Vista general de un STEM . B.  Hemoglobina liofilizada de una lombriz de   tierra con partículas de TMV . C.  Detalle de B.  D.  Virus bacteriófago.  E.  IGL de C. A B C D E
Micrografías de células de  Candidatus M, bavaricum  (Mbav).  A. Al SEM por detección simultánea electrones secundarios (azul) y retrodispersados (rojo). Las cadenas de magnetita son visibles.  B-D. Al TEM de secciones ultrafinas células congeladas mediante alta presión o criosubstituidas (CM: membrana citoplásmatica, OM: membrana exterior, PG: peptidoglicanos, OL1: parte interior de la capa exterior, OL2: parte exterior de la capa exterior; los asteriscos señalan los pliegues o pailas del espacio periplasmático. E. Sección FIB (“focused ion bean”) mostrando la red de extensión de los pliegues. F y G. TEM y SEM de células congeladas por alta presión y criofracturadas. Los círculos señalan los cristales de marnetita (margetosomas) COMBINACIÓN DE TÉCNICAS
A. Óxido de metal sobre Si  B. Plankton del Atlántico Norte SEM de emisión fría A B SEM microanálisis ,[object Object],[object Object],A B ME y ARTE
Hebras de resina epoxi enlazadas a una esfera de poliestireno de 2,5 micrómetros.  Nanoestructuras de óxido de zinc sobre una capa de óxido de indio (la técnica es espectacular).  Espermatozoides en la superficie de un óvulo Nitruro de wurtzita e indio cristalizado
MICROSCOPIO DE BARRIDO DE EFECTO TUNEL (STM) Lámina de oro Nanotubo de carbono
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SABER OBSERVAR Vicente Medina [email_address]

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  • 3. “ El ciego se entera mejor de las cosas del mundo, los ojos son una ilusión embustera” José Mª del Valle Inclán 10 -3 m 10 3 m MICROSCOPIO TELESCOPIO Concepto Microscopía óptica y electrónica Construcción (partes) de un ME Microscopía y resolución Tipos de ME: TEM y SEM Interacción de los e- con la materia Aplicaciones Preparación de muestras al TEM Contraste. Sombreado Fijación, Deshidratación, Iinfiltración Ultramicrotomía Imágenes TEM Preparación de muestras al SEM Vaporización Imágenes SEM Microanálisis Rayos-X Combinación TEM y SEM Otras microscopías
  • 4. electrones en lugar de fotones o luz visible MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, basándose en los estudios de Louis-Victor de Broglie sobre las propiedades ondulatorias de los electrones MET de la UdL
  • 5. SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS ENTRE M. ÓPTICA Y M. ELECTRÓNICA observación lentes formación Imagen objetivos condensador Fuente de “iluminación” espécimen (muestra) Los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible por lo que permiten mostrar estructuras mucho más pequeñas MICROSCOPIO ÓPTICO MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
  • 6. Las partes principales de un microscopio electrónico de transmisión TEM son: CAÑÓN DE ELECTRONES , que emite los electrones que chocan o atraviesan el espécimen (dependiendo que tipo de microscopio electrónico es), creando una imagen aumentada. LENTES MAGNÉTICAS para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones. SISTEMA DE VACÍO es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. PLACA FOTOGRÁFICA o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. SISTEMA DE REGISTRO que muestra la imagen que Producen los electrones, que suele ser un ordenador
  • 7. CONSTRUCCIÓN DEL TEM Los electrones se producen generalmente en un filamento, normalmente de tungsteno, parecido al de una bombilla, mediante un proceso conocido como emisión termoiónica o bien mediante emisión de campo. Los electrones emitidos se aceleran entonces con ayuda de un potencial eléctrico (medido en V, o voltios) y se focalizan mediante lentes electrostáticas o electromagnéticas.
  • 8.  
  • 9. RESOLUCIÓN MINIMA DISTANCIA ENTRE DOS PUNTOS DE UNA MUESTRA PARA QUE PUEDAN SER DISTINGUIDOS COMO TALES Poder de resolución (R) R = 0.61  / n sen    = longitud de onda de iluminación n = índice de refracción  = semiángulo de apertura del haz incidente   = h / mV h = constante de Planck m = masa de e - V = velocidad de e - Ej.: para V = 60.000 V;  = 0.05 nm, la R es de 0.2 nm
  • 10. TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS Transmission electron microscope (TEM) Scanning electron microscope (SEM) TRANSMISIÓN BARRIDO O RASTREO e - e - e - e -
  • 11. Interacción de los e - con la materia
  • 12. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO Aceria ficus en el envés de una hoja de higuera Microanálisis de un mineral
  • 14. Preparación y observación de muestras para TEM
  • 15. IMAGEN DE TEM de alta resolución de un límite de grano de inclinación en aluminio
  • 16. Rejillas de cobre, oro, platino Soporte muestras Portaobjetos
  • 17. CONTRASTE (TINCIÓN) DE SOLUCIONES O PURIFICADOS TINCIÓN SENCILLA : acetato de uranilo, ácido fosfotúngstico, heptamolibdato amónico, citrato de plomo Tobamovirus Geminivirus Potyvirus Contraste positivo Contraste negativo Contraste negativo + positivo
  • 18. Fotografía electrónica (TEM, tinción negativa con acetato de uranilo) del viroide del tubérculo fusiforme de la patata (flechas) comparada con el DNA de doble cadena de un virus bacteriófago (bacteriófago T7) (T. Koller y M. Sogo)
  • 19. Microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa SOMBREADO DE SOLUCIONES O PURIFICADOS Microscopía electrónica de transmisión con sombreado Vaporización de un metal pesado sobre en ángulo) la muestra El material evaporado sigue una línea recta en alto vacío Muestra Vapor de metal Superficie del espécimen cubierta por el metal Sombra Sombra 1 Sombra 2 Ángulo 1 Ángulo 2 Bomba vacío Superficie del virión Cubierta con metal Sombra ángulo 1 Sombra ángulo 2
  • 20.
  • 21. FIJACIÓN ¿Objetivo? Preservar la estructura de la materia viva sin alterarla ¿Cómo? Mediante entrecruzamientos/ligamientos transversales de lípidos y proteínas principalmente FACTORES pH osmolaridad constitución iónica temperatura tiempo de fijación tamaño de la muestra Medio FIJADORES TAMPONES Tetróxido de osmio Tetróxido de rutenio Aldehídos: formaldehído glutaraldehido Acroleína Permanganato potásico Permanganato sódico Fosfato Cacodilato Veronal acetato Colidina
  • 22.
  • 23. ULTRAMICROTOMO Cuchillas de vidrio p diamante Rejillas de cobre (estándar), o de oro/platino para inmunomarcaje
  • 24. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ANALÍTICA DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
  • 25. IMÁGENES COLOREADAS AL TEM (falso color) Salmonella typhimurium Virus de la gripe aviar A H5N1 Célula de mamífero
  • 26. Lettuce infectious yellows virus (LIYV) Tian, T, Rubio, L, Yeh, HH, Crawford, B, Falk, BW. 1999. Lettuce infectious yellows virus: in vitro acquisition analysis using partially purified virions and the whitefly Bemisia tabaci. J Gen Virol 1999 80: 1111-1117 Agranovsky, A.A., Lesemann, D.E., Maiss, E., Hull, R., Atabekov, J.G. 1995"Rattlesnake" structure of a filamentous plant RNA virus built of two capsid proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. March 28; 92(7): 2470–2473. CP CP CPm CPm Beet yellows virus (BYV)
  • 27. INMUNOMARCAJE COMBINACIÓN DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN Y LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICAS BASADAS EN LA REACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO INMUNOMARCAJE CON ORO COLOIDAL Marcaje de la proteína LAMP-1 en la membrana de un cuerpo multivesicular de una célula HepG2 Marcaje de residuos de manosa 6-fosfato en el interior d lisosomas de los linfoblastos
  • 28. Preparación y observación de muestras para SEM Granos de polen
  • 30. Ojo de Drosophila melanogaster
  • 31. CRIO-SCANNING Haz vascular de hoja de maíz
  • 32. Bemisia tabaci ( GENNADIUS)
  • 33. Cicadulina mbila NAUDE Brocosomas: gránulos de naturaleza proteica secretados por los tubos de Malpigio de los cicadélidos
  • 34. A. Célula. B. TEM-criofractura de la mezcla BHPB/C6H12 (2 %). Barra = 100 nm CRIOFRACTURA Congelar en propano Cuchilla de acero Línea de fractura Réplica Hielo Hielo Fuente de carbono o platino (ángulo)
  • 35. IMÁGENES SEM COLOREADAS (falso color)
  • 36.  
  • 37. BSE Si Fe Ni P Ti Combinación de imágenes: electrones retrodispersados (BSE) y análisis de rayos X en mineralogía
  • 38. SCANNING TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE (STEM) A. Vista general de un STEM . B. Hemoglobina liofilizada de una lombriz de tierra con partículas de TMV . C. Detalle de B. D. Virus bacteriófago. E. IGL de C. A B C D E
  • 39. Micrografías de células de Candidatus M, bavaricum (Mbav). A. Al SEM por detección simultánea electrones secundarios (azul) y retrodispersados (rojo). Las cadenas de magnetita son visibles. B-D. Al TEM de secciones ultrafinas células congeladas mediante alta presión o criosubstituidas (CM: membrana citoplásmatica, OM: membrana exterior, PG: peptidoglicanos, OL1: parte interior de la capa exterior, OL2: parte exterior de la capa exterior; los asteriscos señalan los pliegues o pailas del espacio periplasmático. E. Sección FIB (“focused ion bean”) mostrando la red de extensión de los pliegues. F y G. TEM y SEM de células congeladas por alta presión y criofracturadas. Los círculos señalan los cristales de marnetita (margetosomas) COMBINACIÓN DE TÉCNICAS
  • 40.
  • 41. Hebras de resina epoxi enlazadas a una esfera de poliestireno de 2,5 micrómetros. Nanoestructuras de óxido de zinc sobre una capa de óxido de indio (la técnica es espectacular). Espermatozoides en la superficie de un óvulo Nitruro de wurtzita e indio cristalizado
  • 42. MICROSCOPIO DE BARRIDO DE EFECTO TUNEL (STM) Lámina de oro Nanotubo de carbono
  • 43. MICROSCOPIA DE FUERZA ATÓMICA (AFM)
  • 45. SABER OBSERVAR Vicente Medina [email_address]